Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Protokół ten demonstruje zupełnie nowy sposób analizy kompleksów białkowych o niskim powinowactwie. Pozwala naukowcom wykryć i scharakteryzować pewne interakcje białkowe nawet wtedy, gdy są one słabe lub przejściowe, co wcześniej było na ogół bardzo trudne lub nawet niemożliwe. Interakcje białek mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek, ale ich wykrycie i zmierzenie może być trudne.

Fotometria masowa jest doskonałym narzędziem do ilościowego określania tworzenia kompleksów białkowych, ale ma ograniczenia w przypadku rozcieńczonych próbek. Rozwiązujemy ten problem za pomocą płynów masowych. Luka badawcza, którą się zajmujemy, polega na tym, w jaki sposób naukowcy mogą wiarygodnie scharakteryzować interakcje o niskim powinowactwie między białkami w roztworze.

Zaletą naszego podejścia jest to, że pozwala ono na poszukiwanie słabych oddziaływań białkowych w roztworze bez konieczności etykietowania lub unieruchomienia. Dzięki temu naukowcy mogą obserwować interesujące ich białka i to, jak oddziałują ze sobą, nie martwiąc się, że zakłócają system, któremu się przyglądają. Aby rozpocząć, włącz fotometr masy i pozwól mu działać przez godzinę przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów.

Włącz zasilanie i włącz przycisk izolacji, aby aktywować stół antywibracyjny. Następnie włącz sprężarkę powietrza, aby aktywować skrzynkę mikroprzepływową. Następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, a następnie oprogramowanie sterujące mikrofluidyką.

Aby załadować próbkę i kaliber, umieść rurkę wirówki kalibru w szczelinie numer cztery, a probówkę wirówki do próbki w szczelinie numer pięć w pudełku z mikroprzepływami. Umieść roztwory czyszczące CS2, CS2 i CS3 odpowiednio w pozycjach pierwszej, drugiej i trzeciej w pudełku z mikrofluidyką. Przymocuj nakrętkę łączącą linię buforową do 200-mililitrowej butelki buforowej o pH 7,4.

Następnie umieść chip mikrofluidyczny na płytce przygotowawczej. Podłącz drugi koniec rurki czujnika jednostki przepływu S do wlotu próbki pierwszego kanału na chipie mikroprzepływowym, kończąc linię próbkowania. Włóż drugi koniec czujnika jednostki przepływu L do wlotu bufora pierwszego kanału na chipie mikrofluidycznym, kończąc linię bufora.

W celu zbierania odpływu należy podłączyć rurkę do wylotu pierwszego kanału na chipie mikroprzepływowym, a drugi koniec umieścić w kolbie lub zlewce pojemnika na odpady. Nałóż niewielką ilość mikroskopowego olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu fotometru masowego. Umieść chip mikrofluidyczny na uchwycie fotometru masowego, upewniając się, że wlot próbki jest skierowany do góry, i zabezpiecz go za pomocą stage clamps.

Użyj oprogramowania do akwizycji danych, aby dostosować stolik, wyrównując obszar obserwacji kanału pierwszego z obiektywem fotometru. Następnie zamknij pokrywę fotometru masowego i aktywuj funkcję Rozcieńczanie kropelek znajdź ostrość w oprogramowaniu do akwizycji danych. Sprawdź biały pierścień ostrości w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania.

Jeśli występują szczeliny wskazujące na pęcherzyki powietrza w olejku immersyjnym, zwiększ prędkość stage do maksimum i delikatnie przesuń stage na boki, aby je wyeliminować. Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć jednominutowy pomiar, upewniając się, że podczas pomiaru nie ma żadnych zanieczyszczeń. Zdejmij nakrętkę z 200-mililitrowej butelki buforowej o pH 7,4 i przymocuj ją do 200-mililitrowej butelki buforowej o pH 5,0.

Umieść chip mikrofluidyczny na płytce przygotowawczej, jak pokazano wcześniej, i użyj drugiego kanału na chipie mikrofluidycznym zamiast pierwszego do zbierania odpływu. W oprogramowaniu sterującym mikroprzepływami ustaw przełącznik M w pozycji piątej, ustaw natężenie przepływu w linii próbkowania na osiem mikrolitrów na minutę i upewnij się, że ciśnienie w przewodzie próbkowania pozostaje poniżej 350 milibarów. Przy obliczaniu natężenia przepływu należy dopasować pełną różnicę natężenia przepływu do żądanego współczynnika rozcieńczenia próbki.

Po zakończeniu eksperymentu postępuj zgodnie z protokołem czyszczenia, aby utrzymać czystość linii. Aby rozpocząć, umieść chip mikrofluidyczny na uchwycie fotometru masy i zmierz próbkę fotometrii masowej. Po zakończeniu pobierania danych otwórz oprogramowanie do analizy danych.

Aby załadować plik do analizy, kliknij ikonę plusa w lewym górnym rogu i wybierz plik mp calibrant. Oprogramowanie rozpocznie analizę pliku, a czas potrzebny może się różnić w zależności od rozmiaru pliku i liczby pomiarów. Aby skalibrować masę, naciśnij przycisk Utwórz kalibrację masy znajdujący się w prawym dolnym rogu.

Pojawi się okno dialogowe wyświetlające tabelę z wartościami kontrastu dopasowanych szczytów. Zmodyfikuj wartości w tabeli, aby dopasować je do znanych wartości masy dla zamontowanych szczytów, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Nowy plik kalibracyjny zostanie wyświetlony w panelu wzorcowania masy w lewym dolnym rogu oprogramowania do analizy danych.

Aby dodać przykładowy plik, kliknij ikonę plusa w lewym górnym rogu i wybierz przykładowy plik mp. Aby utworzyć histogram masowy, przejdź do karty Analiza, wybierz opcję Tryb histogramu i wybierz opcję Wykres masowy. Dostosuj szerokość pojemnika, limity masy i inne niezbędne parametry zgodnie z wymaganiami.

Dalej dostosuj wykres na karcie Rysunki zgodnie z potrzebami. Po dostosowaniu wyeksportuj figury lub zapisz cały obszar roboczy jako plik DMP. Pomiary fotometrii masowej z ręcznym rozcieńczeniem dały w wyniku histogram masy, w którym dwa największe piki odpowiadały niezwiązanym monomerom FcRn i monomerom przeciwciał immunoglobuliny G.

Wyraźnie zaobserwowano również dwa dodatkowe piki przy 196 i 251 kilodaltonach odpowiadających kompleksom immunoglobuliny G FcRn z jedną do jednej i jedną do dwóch stechiometrii.