Name: Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę pulldown z koekspresją białek w komórkach Escherichia coli BL21(DE3) do badania trudnych interakcji białkowych. Technika umożliwia szybkie testowanie heterodimerów i optymalizację warunków ekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekty Rosyjskiej Fundacji Naukowej 19-74-30026 (opracowanie i walidacja metody) i 19-74-10099 (testy interakcji białko-białko); oraz przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej - grant 075-15-2019-1661 (analiza reprezentatywnych interakcji białko-białko).

Schematyczne przedstawienie przepływu pracy metody jest pokazane w Rysunek 1.
1. Współtransformacja E. coli
<ol>
	<li>Przygotuj wektory ekspresyjne dla białek docelowych przy użyciu standardowych metod klonowania. 
	UWAGA: Zazwyczaj dobrym punktem wyjścia jest użycie konwencjonalnych wektorów pGEX/pMAL zawierających gen oporności na ampicylinę i pochodzenie ColE1 do ekspresji białek znakowanych GST/MBP oraz kompatybilnego wektora o pochodzeniu p15A lub RSF i oporności na kanamycynę do ekspresji białek znakowanych 6xHis, w niektórych przypadkach w połączeniu z tioredoksyną lub znacznikiem SUMO w celu zwiększenia rozpuszczalności. Zazwyczaj przed eksperymentem należy przetestować kilka kombinacji tagów. Opisana metoda sama w sobie jest wygodna do badania okresowego warunków ekspresji białek docelowych. Ważne jest, aby zauważyć, że większość szczepów Rosetta zawiera już plazmid o pochodzeniu p15A do ekspresji tRNA dla rzadkiego kodonu, więc jeśli użycie takich szczepów jest możliwą opcją, należy unikać plazmidów p15A. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Hodować bakterie odpowiedniego szczepu w pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej (OD) 0,1-0,2. W tym badaniu jako przykłady użyto szczepu BL21(DE3). 
		UWAGA: Zaleca się użycie świeżo przygotowanych kompetentnych komórek, aby osiągnąć wydajną kotransformację z dwoma wektorami. Jeśli więcej niż dwa wektory muszą być przekształcane współ, lepiej jest przekształcać je sekwencyjnie, aby osiągnąć dobrą wydajność transformacji. Dobrą alternatywą jest elektroporacja.</li>
		<li>Odwirować 1,0 ml zawiesiny bakteryjnej przez 1 minutę w temperaturze 9 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml lodowatego buforu transformacyjnego buforowego (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl2 i 15 mM CaCl2) i inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Wirować przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 100 μl buforu TB, dodaj 100 ng każdego wektora i inkubuj przez 30 minut na lodzie. Oddzielnie przekształcaj pojedyncze wektory, aby badać zachowanie białek bez koekspresji. Ponadto współprzekształcanie wektorów wyrażeń w parach z pustymi wektorami współwyrażeń dla kontrolek powiązań niespecyficznych. 
		UWAGA: W przykładach podanych w tym badaniu wektory pGEX/pMAL z odpowiadającymi im cDNA połączonymi z cDNA GST/MBP zastosowano w połączeniu z kompatybilnymi wektorami pochodzącymi z pACYC, zawierającymi kodujące cDNA domeny białka partnera połączone z cDNA tioredoksyny.</li>
		<li>Podgrzewać w temperaturze 42 °C przez 150 s, a następnie schładzać przez 1 minutę na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 ml płynnej pożywki LB bez antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Płytka na płytkach LB-agar zawierających 0,5% glukozy i odpowiednie antybiotyki (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikol). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyrażenie
<ol>
	<li>Przepłukać komórki z płytki 2 ml płynnej pożywki LB do 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami (typowe stężenia to: 50 mg/l ampicyliny; 20 mg/l kanamycyny; 50 mg/l streptomycyny; 35 mg/l chloramfenikolu). Dodaj jony metali lub inne znane kofaktory (w przykładach podanych w tym badaniu do pożywki dodano 0,2 mM ZnCl2). Przechowywać podwielokrotność z 20% glicerolem w temperaturze -70 °C do ponownego powtórzenia doświadczenia. 
	UWAGA: Zaleca się wypłukanie kilku kolonii bezpośrednio z płytki, aby wykluczyć możliwość złej ekspresji w pojedynczym izolowanym klonie z powodu sporadycznych zdarzeń rekombinacji między dwoma plazmidami.</li>
	<li>Hodować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 37 °C do OD 0,5-0,7, schłodzić do temperatury pokojowej (RT) i dodać izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do 1 mM. Przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek jako kontrolę próbki nieindukowanej.</li>
	<li>Inkubować komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 18 °C przez noc. 
	UWAGA: Optymalny czas i temperatura inkubacji mogą się różnić; 18 °C przez noc działa najlepiej w przypadku większości białek i zaleca się ich domyślne wypróbowanie. Skróć czas inkubacji do 2-3 godzin, jeśli zaobserwuje się silne niespecyficzne wiązanie.</li>
	<li>Podzielić zawiesinę bakteryjną na dwie części (lub więcej, jeśli użyto więcej niż dwóch różnych znaczników) i przechowywać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórkowej w celu potwierdzenia ekspresji białka. Wirować przy 4 000 x g przez 15 min. 
	UWAGA: Punkt pauzy: granulki bakteryjne można przechowywać w temperaturze -70 °C przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Test pulldown
UWAGA: Szczegółowe procedury są opisane dla białek oznaczonych tagiem 6xHis lub MBP/GST. Wszystkie zabiegi wykonywane są w temperaturze 4°C.
<ol>
	<li>Zawiesić osady bakteryjne w 1 ml lodowatego buforu do lizy z inhibitorami proteazy i środkami redukującymi (patrz poniżej) dodanymi bezpośrednio przed eksperymentem. Unikaj ditiotreitolu (DTT) podczas stosowania żywic chelatujących metale, ponieważ usuwa on jony metali. Dostosuj skład buforu dla badanych białek. Typowe receptury do lizy, które są odpowiednie dla większości białek, to:
	<ol>
		<li>6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM beta-merkaptoetanolu, 1 mM fenylometylosfulfonylofluorku (PMSF) i rozcieńcz 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 w 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu, 5 mM DTT, 1 mM PMSF i rozcieńczenie 1:1,000 koktajlu inhibitora proteazy (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbij komórki przez sonikację na lodzie. Przechowywać 20 μl podwielokrotności do elektroforezy. 
	UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest 20-25 impulsów po 5 s w odstępach 15 s z mocą wyjściową 20 W na próbkę. Odpowiednia moc sonikacji powinna być dostosowana do każdego instrumentu, aby uniknąć przegrzania i zapewnić całkowite rozerwanie komórek. Aby osiągnąć lepszą wydajność, zdecydowanie zaleca się stosowanie sond sonicyjnych z wieloma końcówkami o wysokiej przepustowości.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 30 min. Zebrać 20 μl oczyszczonego lizatu do dalszej analizy SDS-PAGE.</li>
	<li>Zrównoważyć żywicę (50 μl na każdą próbkę) z 1 ml lodowatego buforu do lizy przez 10 minut, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać lizaty komórkowe (całkowite stężenie białka: 20-50 mg/ml) do żywicy, inkubować przez 10 minut przy stałych obrotach 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Zebrać 20 μl frakcji niezwiązanej do dalszej analizy SDS-PAGE.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania i inkubować przez 1 min. Wirować przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant. Typowe przepisy na do płukania to:
	<ol>
		<li>6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazolu, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.</li>
		<li>GST lub MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [w/w] glicerolu i 5 mM DTT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać dwa długie płukania: dodać 1 ml lodowatego buforu do płukania, inkubować przez 10-30 minut ze stałą prędkością 15 obr./min, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego buforu do przemywania wodą, inkubować przez 1 minutę, odwirowywać przy 2 000 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Eluować związane białka za pomocą 50 μl buforu elucyjnego w wytrząsarce z prędkością 1 200 obr./min przez 10 minut. Typowe receptury elucyjnych to:
	<ol>
		<li>6xHis-pulldown: Wymieszaj 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazolu i 5 mM beta-merkaptoetanolu.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutation (dostosowany do pH 7,5 z zasadowym Tris) i 5 mM DTT.</li>
		<li>MBP-pulldown: Wymieszaj 20 mM Tris (pH 7,5 przy 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltozy i 5 mM DTT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj eluowane białka za pomocą SDS-PAGE. 
	UWAGA: Procentowa zawartość akrylamidu powinna być dostosowana do wielkości białek. W przykładach podanych w tym badaniu użyto 12% żeli akrylowych, pracujących w buforze tris-glicyna-SDS (2 mM Tris, 250 mM glicyny, 0,1% SDS) przy stałym napięciu 180 V. Żele barwiono przez gotowanie w 0,2% Coomassie blue R250, 10% kwasu octowego i 30% izopropanolu, a odbarwiono przez gotowanie w 10% kwasie octowym. Ilość załadowanego białka nie powinna być równa, ponieważ różne ilości oddziałujących białek mogą być ściągane w dół w różnych eksperymentach.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
<li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number%3A+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li>
<li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li>
<li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70(2019).</li>
<li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+two-hybrid+%28F2H%29+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li>
<li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68(2008).</li>
<li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Doklady+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li>
<li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+insulator+proteins%2C+Pita+and+ZIPIC%2C+target+CP190+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li>
<li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16(2021).</li>
<li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Opisana metoda pozwala na badanie oddziaływań białko-białko, które nie mogą być efektywnie złożone in vitro i wymagają koekspresji. Metoda ta jest jednym z niewielu odpowiednich podejść do badania białek heterodimeryzujących, które są również zdolne do homodimeryzacji, ponieważ po oddzielnym oczyszczeniu takie białka tworzą stabilne homodimery, które najczęściej nie mogą się dysocjować i ponownie asocjować podczas eksperymentu 3,11.
<p class="jove_co...

Konwencjonalne rozwijanie jest powszechnie używane do badania interakcji białko-białko1. Jednak oczyszczone białka często nie oddziałują skutecznie in vitro2,3, a niektóre z nich są nierozpuszczalne bez ich partnera wiążącego4,5. Takie białka mogą wymagać złożenia kotranslacyjnego lub obecności molekularnych białek opiekuńczych5,6,7,8,9. Innym ograniczeniem konwencjonalnego pulldownu jest testowanie możliwej aktywności heteromultimeryzacji między domenami, które mogą istnieć jako stabilne homo-oligomery złożone kotranslacyjnie8,10, ponieważ wiele z nich nie może się rozdzielić i ponownie skojarzyć in vitro w czasie inkubacji. Stwierdzono, że wyrażenie współbieżne jest przydatne w przezwyciężaniu takich problemów3,11. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów u bakterii została z powodzeniem wykorzystana do oczyszczania dużych wielopodjednostkowych kompleksów makromolekularnych, w tym kompleksu represyjnego polycomb PRC212, moduł głowicy mediatora polimerazy II RNA13, płytka bazowa bakteriofaga T414, moduł deubikwitylazy kompleksu SAGA15,16, oraz ferritin17. Źródła replikacji często używane do kowyrażeń to ColE1, p15A18, CloDF1319 i RSF20. W dostępnym na rynku systemie ekspresji Duet te pochodzenie jest łączone z różnymi genami oporności na antybiotyki i wygodnymi wieloma miejscami klonowania w celu wytworzenia wektorów policistronicznych, umożliwiających ekspresję do ośmiu białek. Te źródła mają różną liczbę kopii i mogą być używane w różnych kombinacjach w celu osiągnięcia zrównoważonych poziomów ekspresji docelowych białek21. Do testowania oddziaływań białko-białko stosuje się różne znaczniki powinowactwa; najczęstsze to 6xhistydyna, S-transferaza glutationu (GST) i białko wiążące maltozę (MBP), z których każde ma specyficzne powinowactwo do odpowiedniej żywicy. GST i MBP zwiększają również rozpuszczalność i stabilność oznakowanych białek22.
Opracowano również szereg metod obejmujących koekspresję białek w komórkach eukariotycznych, z których najważniejszą jest test dwuhybrydowy drożdży (Y2H)23. Test Y2H jest tani, łatwy i umożliwia testowanie wielu interakcji; Jednak jego przepływ pracy trwa dłużej niż 1 tydzień. Istnieje również kilka rzadziej stosowanych testów opartych na komórkach ssaków, na przykład fluorescencyjny test dwuhybrydowy (F2H)24 i test interakcji białko-białko w macierzy komórkowej (CAPPIA)25. Test F2H jest stosunkowo szybki, pozwala na obserwację interakcji białek w ich naturalnym środowisku komórkowym, ale wymaga użycia drogiego sprzętu do obrazowania. Wszystkie te metody mają przewagę nad ekspresją prokariotyczną, zapewniając natywne środowisko translacji i fałdowania eukariotycznego; Wykrywają jednak interakcje pośrednio, albo poprzez aktywację transkrypcyjną, albo przez fluorescencyjny transfer energii, co często prowadzi do powstania artefaktów. Ponadto komórki eukariotyczne mogą zawierać innych partnerów interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania, co może zakłócać testowanie interakcji binarnych między białkami wyższych eukariontów.
Niniejsze badanie opisuje metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek, stosowaną za pomocą konwencjonalnych technik pulldown. Metoda pozwala na badanie oddziaływań między białkami docelowymi, które wymagają koekspresji. Jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z tradycyjnym pulldownem, umożliwiając testowanie wsadowe wielu celów, co czyni go korzystnym w większości przypadków. Koekspresja przy użyciu kompatybilnych wektorów jest wygodniejsza niż policytroniczna koekspresja, ponieważ nie wymaga pracochłonnego etapu klonowania.

<table><tbody><tr><td>8-ELEMENTOWA</td><td>sonda Sonics</td><td>630-0586</td><td>Wysokowydajne 8-elementowe sondy sonikatywne</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amylozowa</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Żywica do oczyszczania białek znakowanych MBP</td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamycyna); A0839 (ampicylina)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutation agaroza</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Żywica do oczyszczania białek oznaczonych GST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Żywica do oczyszczania białek znakowanych 6xHis</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji p15A</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji CloDF13</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Koktajl pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Wektor do koekspresji białek o pochodzeniu replikacji RSF</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 Sonikator</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>Ultradźwiękowy procesor cieczy</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown to łatwy i szeroko stosowany test interakcji białko-białko. Ma jednak ograniczenia w badaniu kompleksów białkowych, które nie łączą się skutecznie in vitro. Takie kompleksy mogą wymagać składania kotranslacyjnego i obecności molekularnych białek opiekuńczych; Albo tworzą stabilne oligomery, które nie mogą się rozdzielić i ponownie asocjować in vitro, albo są niestabilne bez partnera wiążącego. Aby przezwyciężyć te problemy, możliwe jest zastosowanie metody opartej na bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek przy użyciu zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalnych technik pulldown. Przepływ pracy jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z tradycyjnym pulldownem, ponieważ brakuje w nim czasochłonnych etapów oddzielnego oczyszczania oddziałujących białek i ich późniejszej inkubacji. Kolejną zaletą jest większa odtwarzalność ze względu na znacznie mniejszą liczbę etapów i krótszy okres czasu, w którym białka istniejące w środowisku in vitro są narażone na proteolizę i utlenianie. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania szeregu interakcji białko-białko, gdy inne techniki in vitro okazały się nieodpowiednie. Metoda może być stosowana do badania okresowego oddziaływań białko-białko. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w badaniach interakcji między domeną BTB a wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami oraz heterodimerów domen związanych z palcem cynkowym.

Opisana metoda była rutynowo stosowana w przypadku wielu różnych celów. Przedstawiono tutaj kilka reprezentatywnych wyników, których prawdopodobnie nie udałoby się uzyskać przy użyciu konwencjonalnych technik pulldown. Pierwszym z nich jest badanie specyficznej dimeryzacji ZAD (domeny związanej z palcem cynkowym)11. Domeny ZAD tworzą stabilne i specyficzne dimery, przy czym heterodimery mogą powstawać jedynie pomiędzy blisko spokrewnionymi domenami w obrębie grup paralogicznych. Dimery tworzone pr...

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Metoda ta pozwala na badanie powstawania kompleksów białkowych, które wymagają koekspresji dla wydajnych próbek testowych, takich jak tworzenie heterodimerów. Głównym potencjałem końcowym tej metody jest wykorzystanie koekspresji różnie znakowanych badanych białek przy użyciu kombinacji kompatybilnych wektorów w celu promowania wydajnego składania złożonych, wraz z efektywnym czasowo przepływem pracy i skalowalnością umożliwiającą szybkie testowanie płatkowe wielu interakcji. Metoda ta może być również stosowana do szybkich badań przesiewowych optymalnych warunków ekspresji i oczyszczania białek.Demonstracja wizualna pomaga w prawidłowym wykonywaniu krytycznych kroków protokołu, takich jak konfiguracja koekspresji, zakłócanie komórek i kolejne kroki rozwijania. Na początek wyhoduj szczep Escherichia coli BL21(DE3) w pożywce Luria-Bertani lub LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza do gęstości optycznej lub OD od 0,1 do 0,2. Odwirować jeden mililitr zawiesiny bakteryjnej przez jedną minutę w temperaturze 9 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.Następnie dodaj 0,5 mililitra lodowatego buforu transformacyjnego lub TB i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować przez 30 sekund w temperaturze 8 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu TB, 100 nanogramów każdego wektora i inkubuj przez 30 minut na lodzie.Podgrzewaj w 42 stopniach Celsjusza przez 150 sekund, a następnie schładzaj na lodzie przez minutę. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LB bez antybiotyków i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po inkubacji odwirować i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki LB przed posiewem zawiesiny na płytce agarowej LB zawierającej 0,5% glukozy i odpowiednie antybiotyki.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz komórki z płytki dwoma mililitrami pożywki LB do 50 mililitrów pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami. Dodaj jony metali lub inne znane kofaktory przed przechowywaniem podwielokrotności z 20% glicerolem w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do kolejnych eksperymentów.Hoduj komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza do OD 0,5 do 0,7. Schłodzić kulturę do temperatury pokojowej i dodać IPTG do końcowego stężenia jednego milimola. Przechowywać 20-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek jako kontrolę nieindukowanej próbki.Inkubuj komórki przez noc z prędkością 220 obr./min w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnego dnia podziel zawiesinę bakteryjną na dwie części i przechowuj 20-mikrolitrowe podwielokrotności, aby potwierdzić ekspresję białka. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o stężeniu 4 000 G przez 15 minut.W przypadku testu pulldown ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy z inhibitorami proteazy i środkami redukującymi dodanymi bezpośrednio przed eksperymentem. Dostosuj skład buforu dla badanych białek. Rozbij komórki przez sonikację na lodzie i przechowuj 20-mikrolitrową porcję do elektroforezy.Odwirować przy 16 000 G przez 30 minut i zebrać 20 mikrolitrów oczyszczonego lizatu do elektroforezy. Równoważyć żywicę z jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy przez 10 minut, następnie odwirować przy 2 000 G przez 30 sekund i wyrzucić supernatant. Dodaj lizaty komórkowe do żywicy i inkubuj przez 10 minut przy stałych obrotach 15 obr./min.Następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed zebraniem 20 mikrolitrów frakcji niezwiązanej do analizy. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do płukania i inkubuj przez minutę. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.Następnie wykonaj dwa długie mycia lodowatym buforem do mycia. Po drugim przemyciu eluować związane białka za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego w wytrząsarce z prędkością 1 200 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Analizować eluowane białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.Przedstawiono tutaj badania domeny związanej z palcem cynkowym lub ZAD, homodimeryzacji w białku wiążącym maltozę lub MBP oraz testów pulldown 6xhistydyny. Jednoczesna ekspresja ZADs skondensowanych z MBP i tioredoksyną 6xhistydyną wykazuje dobrą i powtarzalną aktywność homodimeryzacyjną, pojawiając się jako dodatkowe pasmo w wynikach SDS-PAGE testu ściągania MBP. Inny przykład zastosowania tej metody do badania alternatywnych formacji złożonych przedstawiono tutaj.W teście koekspresji ENY2 znakowany 6xhistydyną oddziaływał zarówno z Sgf11 znakowanym GST, jak i MBP-CTCF, ale GST-Sgf11 nie był obecny w ściąganiach MBP i odwrotnie. Przedstawiono tutaj porównanie krok po kroku wymaganych odstępów czasu w przepływie pracy konwencjonalnego testu pulldown w porównaniu z pulldown sprzężonym z koekspresją. Wyniki wykorzystania obu technik do badania tej samej interakcji między domeną BTB białka CP190 a znakowaną GST domeną C-końcową białka Drosophila CTCF przedstawiono tutaj.Właściwy wybór testu powinowactwa i rozpuszczalności, tioredoksyny, GST lub MBP, ma kluczowe znaczenie dla skutecznego wykonania testu. Kolejnym krytycznym krokiem jest szybkie i równomierne rozerwanie komórek. Zdecydowanie zaleca się stosowanie sond sonicznych z wieloma końcówkami.Metoda ta pozwala na bezpośrednie badanie powstawania heterodimerów między domenami białkowymi, które w przeciwnym razie tworzą homodimery, które nie rozłączyłyby się podczas inkubacji oczyszczonych białek w konwencjonalnym teście pulldown.

pulldown-assay-coupled-with-co-expression-bacteria-cells-as-time

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Poznaj metodę pulldown z koekspresją białek w komórkach Escherichia coli BL21(DE3) do badania trudnych interakcji białkowych. Technika umożliwia szybkie testowanie heterodimerów i optymalizację warunków ekspresji.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Przeglądaj więcej filmów