Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Metoda ta pozwala na badanie powstawania kompleksów białkowych, które wymagają koekspresji dla wydajnych próbek testowych, takich jak tworzenie heterodimerów. Głównym potencjałem końcowym tej metody jest wykorzystanie koekspresji różnie znakowanych badanych białek przy użyciu kombinacji kompatybilnych wektorów w celu promowania wydajnego składania złożonych, wraz z efektywnym czasowo przepływem pracy i skalowalnością umożliwiającą szybkie testowanie płatkowe wielu interakcji. Metoda ta może być również stosowana do szybkich badań przesiewowych optymalnych warunków ekspresji i oczyszczania białek.

Demonstracja wizualna pomaga w prawidłowym wykonywaniu krytycznych kroków protokołu, takich jak konfiguracja koekspresji, zakłócanie komórek i kolejne kroki rozwijania. Na początek wyhoduj szczep Escherichia coli BL21(DE3) w pożywce Luria-Bertani lub LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza do gęstości optycznej lub OD od 0,1 do 0,2. Odwirować jeden mililitr zawiesiny bakteryjnej przez jedną minutę w temperaturze 9 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Następnie dodaj 0,5 mililitra lodowatego buforu transformacyjnego lub TB i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji odwirować przez 30 sekund w temperaturze 8 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu TB, 100 nanogramów każdego wektora i inkubuj przez 30 minut na lodzie.

Podgrzewaj w 42 stopniach Celsjusza przez 150 sekund, a następnie schładzaj na lodzie przez minutę. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LB bez antybiotyków i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po inkubacji odwirować i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki LB przed posiewem zawiesiny na płytce agarowej LB zawierającej 0,5% glukozy i odpowiednie antybiotyki.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz komórki z płytki dwoma mililitrami pożywki LB do 50 mililitrów pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami. Dodaj jony metali lub inne znane kofaktory przed przechowywaniem podwielokrotności z 20% glicerolem w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do kolejnych eksperymentów.

Hoduj komórki ze stałą rotacją 220 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza do OD 0,5 do 0,7. Schłodzić kulturę do temperatury pokojowej i dodać IPTG do końcowego stężenia jednego milimola. Przechowywać 20-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek jako kontrolę nieindukowanej próbki.

Inkubuj komórki przez noc z prędkością 220 obr./min w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnego dnia podziel zawiesinę bakteryjną na dwie części i przechowuj 20-mikrolitrowe podwielokrotności, aby potwierdzić ekspresję białka. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o stężeniu 4 000 G przez 15 minut.

W przypadku testu pulldown ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy z inhibitorami proteazy i środkami redukującymi dodanymi bezpośrednio przed eksperymentem. Dostosuj skład buforu dla badanych białek. Rozbij komórki przez sonikację na lodzie i przechowuj 20-mikrolitrową porcję do elektroforezy.

Odwirować przy 16 000 G przez 30 minut i zebrać 20 mikrolitrów oczyszczonego lizatu do elektroforezy. Równoważyć żywicę z jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy przez 10 minut, następnie odwirować przy 2 000 G przez 30 sekund i wyrzucić supernatant. Dodaj lizaty komórkowe do żywicy i inkubuj przez 10 minut przy stałych obrotach 15 obr./min.

Następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed zebraniem 20 mikrolitrów frakcji niezwiązanej do analizy. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do płukania i inkubuj przez minutę. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.

Następnie wykonaj dwa długie mycia lodowatym buforem do mycia. Po drugim przemyciu eluować związane białka za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego w wytrząsarce z prędkością 1 200 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Analizować eluowane białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.

Przedstawiono tutaj badania domeny związanej z palcem cynkowym lub ZAD, homodimeryzacji w białku wiążącym maltozę lub MBP oraz testów pulldown 6xhistydyny. Jednoczesna ekspresja ZADs skondensowanych z MBP i tioredoksyną 6xhistydyną wykazuje dobrą i powtarzalną aktywność homodimeryzacyjną, pojawiając się jako dodatkowe pasmo w wynikach SDS-PAGE testu ściągania MBP. Inny przykład zastosowania tej metody do badania alternatywnych formacji złożonych przedstawiono tutaj.

W teście koekspresji ENY2 znakowany 6xhistydyną oddziaływał zarówno z Sgf11 znakowanym GST, jak i MBP-CTCF, ale GST-Sgf11 nie był obecny w ściąganiach MBP i odwrotnie. Przedstawiono tutaj porównanie krok po kroku wymaganych odstępów czasu w przepływie pracy konwencjonalnego testu pulldown w porównaniu z pulldown sprzężonym z koekspresją. Wyniki wykorzystania obu technik do badania tej samej interakcji między domeną BTB białka CP190 a znakowaną GST domeną C-końcową białka Drosophila CTCF przedstawiono tutaj.

Właściwy wybór testu powinowactwa i rozpuszczalności, tioredoksyny, GST lub MBP, ma kluczowe znaczenie dla skutecznego wykonania testu. Kolejnym krytycznym krokiem jest szybkie i równomierne rozerwanie komórek. Zdecydowanie zaleca się stosowanie sond sonicznych z wieloma końcówkami.

Metoda ta pozwala na bezpośrednie badanie powstawania heterodimerów między domenami białkowymi, które w przeciwnym razie tworzą homodimery, które nie rozłączyłyby się podczas inkubacji oczyszczonych białek w konwencjonalnym teście pulldown.