Immunoterapia adoptywna komórek iNKT u myszy RZS indukowanych izomerazą glukozo-6-fosforanową (G6PI)

Nasz protokół opisuje metodę budowania modelu RA. Jego wskaźnik sukcesu wynosi ponad 93 procent, a jego patogeneza zależy od limfocytów T, limfocytów B i odporności wrodzonej, co pozwala naukowcom lepiej badać patogenezę RZS z globalnej perspektywy immunologicznej. Następnie do ich leczenia wykorzystujemy komórki INKT o działaniu immunomodulującym.

Komórki INKT mają dobry wpływ na leczenie poprzez wprowadzenie in vivo, które zapewniają podstawowe wsparcie danych dla klinicznego zastosowania komórek INKT i naprawdę eksplodują wartość kliniczną zastosowań komórek INCT. Największą zaletą tej technologii jest to, że jest prosta w obsłudze i łatwa do kopiowania. Procedurę zademonstrują Chen Shengde, Gao Xiang i Zhang Jingnan, doktorant z mojego laboratorium.

Na początek zważ 1,75 miligrama obu HGPI325 do 339 i HGPI469 do 483 fragmentów i rozpuść je w 5,25 mililitra potrójnie destylowanej wody o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozpuść kompletny adiuwant Freunda w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Wlej 5,25 mililitra do kolejnej 10-mililitrowej probówki wirówkowej i ostudź ją do użycia.

Mieszaninę roztworu HG6PI i kompletnego roztworu adiuwanta Freunda umieścić w urządzeniu do sztucznego emulgowania z dwiema połączonymi szklanymi strzykawkami. W łaźni lodowej popychaj strzykawkę ze stałą prędkością i częstotliwością od dziesięciu do dwudziestu razy na minutę, aby całkowicie zemulgować mieszaninę roztworu peptydu i kompletny roztwór adiuwantowy Freunda. Następnie trzymaj kropelki emulsji w wodzie przez dziesięć minut.

Następnie wstrzyknij podskórnie 150 mikrolitrów zemulgowanych HG6PIs do korzenia ogona myszy. Natychmiast i po 48 godzinach wstrzyknąć myszu śródkroczowo 200 miligramów toksyny krztuścowej. Teraz wstrzyknij normalną mysz DBA1 dobrzusznie bez gaussera w dawce 0,1 miligrama na kilogram masy ciała.

Trzy dni po modelowaniu, po znieczuleniu, wyizoluj śledzionę myszy. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, przecinając i mieląc śledzionę na sicie o oczkach 200. Przemyć zawiesinę komórek PBS.

Odwirować przy 200 gach przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem roztworu tkanki krwi pełnej. Dodaj trzy mililitry pożywki do separacji limfocytów myszy.

A następnie odwiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 300 razy g w temperaturze pokojowej. Aby oczyścić komórki INCT, ponownie zawieś od 10 do siódmych komórek za pomocą 100 mikrolitrów PBS o temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodaj 10 mikrolitrów tetrameru PE CD1 załadowanego alfa gausserem i inkubuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez piętnaście minut w ciemności. Umyj komórki dwukrotnie PBS i zawieś je ponownie w 80 mikrolitrach PBS.

Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-PE i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwadzieścia minut w ciemności. Umyj je dwukrotnie PBS i ponownie zawieś komórki z 500 mikrolitrami PBS. Umieść kolumnę sortującą w polu magnetycznym sortownika MACS i spłucz 500 mikrolitrami PBS.

Dodać przygotowaną zawiesinę komórek do kolumny sortującej, zebrać przepływ i trzykrotnie przepłukać buforem PBS. Usuń pole magnetyczne i dodaj jeden mililitr buforu PBS do kolumny sortującej. Szybko popchnąć tłok ze stałym naciskiem, aby wprowadzić oznakowane komórki do probówki zbiorczej.

I uzyskaj oczyszczone komórki INCT. Licz za pomocą automatycznego licznika komórek. Aby zidentyfikować fenotyp komórek INCT, najpierw weź od jednej dziesiątki do szóstej komórek z oczyszczonych komórek INKT i ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach PBS.

Dodać 0,5 mikrolitra tetrameru alfa gaussera PE CD1 lub 10 mikrolitrów FITC TCR beta do pojedynczej probówki kontroli dodatniej. Dodać 0,5 mikrolitra tetrameru alfa gaussera PE CD1, dodać 10 mikrolitrów FITC TCR beta do probówki na próbkę. Wysiaduj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzydzieści minut w ciemności.

Następnie umyj komórki w PBS, a następnie odwiruj w ilości 200 razy g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dodać jeden mililitr roztworu roboczego do przepuszczalności utrwalania FoxP3. I inkubuj komórki przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie dodaj jeden mililitr 1x roztworu roboczego do permeabilizacji i odwiruj komórki w temperaturze 500 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant. Dodaj jeden mikrolitr mysiego anty-PLZF AlexaFluor 647 i jeden mikrolitr mysiego anty-Tbet PerCP Cy5.5 i inkubuj przez trzydzieści minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie dodaj dwa mikrolitry roztworu roboczego buforu przepuszczalnego i odwiruj 200 razy g przez pięć minut w celu oczyszczenia. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS i zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej.

W tym badaniu, w porównaniu z grupą kontrolną, palce u nóg w grupie modelowej RZS zaczęły wykazywać czerwony obrzęk po modelowaniu ze stopniowym pogorszeniem. Po 14 dniach czerwony obrzęk stawu skokowego osiągnął szczyt, po którym nastąpiła stopniowa ulga. Wyniki patologiczne pokazują, że stopień naciekania komórek zapalnych w tkance maziowej kostki myszy modelowych RZS był różny na różnych etapach.

Szczyt stanu zapalnego wystąpił w 14 dniu po modelowaniu. W grupie modelowej RZS poziomy cytokin prozapalnych w surowicy znacznie wzrosły 11 dni i 14 dni po modelowaniu. Podczas gdy cytokiny przeciwzapalne znacznie się zmniejszyły.

Ten rysunek pokazuje, że wskaźnik INKT2 u normalnych myszy wynosił około pięciu procent. Wskaźnik INK2 wynosił około 82 procent po indukcji in vivo. Wskaźnik INK2 wynosił ponad 92 procent po oczyszczeniu MACS.

Tutaj pokazujemy metodę emulgowania głównego polipeptydu, który widzimy w RZS. Zemulgowane kropelki utrzymuje się w wodzie przez 10 minut. Wyniki są rozproszone. Protokół ten jest nowym dodatkiem do leczenia specjalnych komórek NKT wyhodowanych w RZS.

Które mogą być stosowane w immunoterapii komórkowej lub innych chorobach autoimmunologicznych i nowotworach. Model ten może stymulować ogólną proliferację limfocytów T CD4 i deficyty komórek NKT u pacjentów z RZS, co stanowi podstawę do dogłębnych badań szlaków immunologicznych RZS. W tym protokole toksyna krztuścowa jest wstrzykiwana w przestrzeń międzyotrzewnową podczas modelowania.

Prosimy o noszenie eksperymentalnych ubrań i jednorazowych rękawiczek. I noś wszystkie standardy działania, aby zapobiec ranom kłutym i infekcjom.