Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Za pomocą tego systemu możemy zebrać submilimetrowe skupiska ludzkiej tkanki tłuszczowej, w których całe mikrośrodowisko komórek regeneracyjnych jest nienaruszone. Cały układ mikronaczyniowy jest również nienaruszony, więc możemy użyć tego rodzaju mikroorganów do przeszczepów in vivo, do hodowli in vitro i do izolacji komórek w celu dalszej charakterystyki. Głównym powodem zastosowania systemu w laboratorium badawczym jest to, że proces jest całkowicie wolny od enzymów, a więc pozwala na szybkie i wydajne przetwarzanie ludzkiej tkanki tłuszczowej przy zachowaniu mikroarchitektury i będzie to mikrokrążenie tkanki całkowicie nienaruszone.

W ten sposób możemy bezpośrednio badać produkt terapii komórkowej, który okazał się już bardzo przydatny w klinice. Ta technologia systemu zamkniętego jest łatwą w użyciu techniką śródoperacyjnego pobierania, przetwarzania i ponownego wstrzykiwania rafinowanej tkanki tłuszczowej i może być z powodzeniem stosowana w kosmetyce, ortopedii, proktologii, a także ginekologii. Metoda ta pozwala na dalsze badania wpływu tłuszczu na regenerację tkanek.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Biancę Vezzani, stażystkę podoktorską oraz Mario Gomeza-Salazara, który jest doktorantem. Pracując w warunkach aseptycznych, w ciągu 16 godzin od zbioru, umieść próbkę abdominoplastyki na szmatce chirurgicznej ze skórą skierowaną do góry. Użyj jednorazowej kaniuli do infiltracji tkanek, aby wstrzyknąć od 50 do 100 mililitrów 0,9% roztworu chlorku sodu o temperaturze 37 stopni Celsjusza do podskórnej tkanki tłuszczowej.

Podłącz 10-mililitrową strzykawkę Luer lock do jednorazowej kaniuli do liposukcji i chwytając próbkę w obszarze skóry w pobliżu krawędzi próbki, ostrożnie wprowadź kaniulę do tkanki tłuszczowej. Gdy kaniula znajdzie się w tkance, wyjmij tłok i przesuwaj kaniulę promieniowo w próbce tkanki tłuszczowej. Ważne jest, aby podczas lipoaspiracji mocno obchodzić się z tkanką tłuszczową.

Jeśli nie zostanie zebrana wystarczająca ilość tłuszczu, rozważ wykonanie dodatkowego wstrzyknięcia soli fizjologicznej. Gdy strzykawka jest pełna lipo-aspiratu, ostrożnie wyjmij kaniulę z tkanki i zastąp pełną strzykawkę nową pustą strzykawką, aż do zebrania łącznie 60 mililitrów aspiratu. W celu mikrofragmentacji lipoaspiratu wyjmij urządzenie z opakowania i sprawdź, czy jednostka główna jest podłączona do worka na odpady.

Umieść worek na odpady na ziemi i upewnij się, że zawory są przymocowane do zaślepek jednostki procesowej. Przebij port przyłączeniowy worka, aby podłączyć kolec końcowy przewodu wejściowego do worka soli fizjologicznej i umieść worek z solą fizjologiczną wyżej niż jednostka przetwarzająca. Sprawdź, czy wszystkie pięć zacisków podłączonych do rurek obwodów jest otwartych, umieść jednostkę przetwarzającą w pozycji pionowej, pozwól, aby roztwór soli fizjologicznej wypełnił jednostkę przetwarzającą i potwierdź, że przepływ dociera do worka na odpady.

Potrząśnij jednostką przetwarzającą, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i umieść ją w pozycji pionowej z niebieską nasadką skierowaną do góry. Zamknij zacisk obok linii wejściowej i podłącz strzykawkę z lipoaspiratem do samozamykającego zaworu niebieskiej nasadki wejściowej, aby rozpocząć wstrzykiwanie lipoaspiratu. Trzymając jednostkę przetwarzającą w pozycji pionowej, powoli naciskaj tłok strzykawki, aż cały lipoaspirat zostanie przeniesiony do urządzenia.

Po wstrzyknięciu całego lipoaspiratu otwórz zacisk wejściowy, aby przywrócić przepływ soli fizjologicznej i energicznie potrząsaj jednostką przetwarzającą przez co najmniej dwie minuty, regularnie sprawdzając przepływ roztworu soli fizjologicznej do worka na odpady. Gdy roztwór soli fizjologicznej w jednostce przetwarzającej stanie się przezroczysty, umieść urządzenie szarą nasadką do góry i zamknij zaciski znajdujące się na odpływie w pobliżu zarówno niebieskiej, jak i szarej nasadki. Przetworzona tkanka będzie unosić się na górze.

Następnie napełnij 10-mililitrową strzykawkę Luer lock roztworem soli fizjologicznej i podłącz strzykawkę do zaworu ładującego niebieskiej nasadki. Podłącz pustą 10-mililitrową strzykawkę typu Luer lock z tłokiem całkowicie włożonym do zaworu szarej nasadki. Mocno wstrzyknąć sól fizjologiczną do jednostki przetwarzającej z niebieskiej nakrętki, sprawdzając, czy strzykawka podłączona do szarego zaworu jest w konsekwencji napełniana przetworzoną tkanką.

Po wstrzyknięciu całej soli fizjologicznej ostrożnie wyjąć obie strzykawki i powtarzać infuzję soli fizjologicznej, aż cała przetworzona tkanka zostanie pobrana. Po zakończeniu przetwarzania wyjmij wszystkie strzykawki, zamknij wszystkie zaciski, odłącz worek z solą fizjologiczną i zutylizuj urządzenie zgodnie z lokalnymi protokołami. Po zebraniu całej przetworzonej tkanki przenieść mikrorozdrobnioną tkankę tłuszczową do sterylnego pojemnika i dodać do pojemnika równą objętość pożywki wytrawiającej.

Umieścić szczelnie zamknięty pojemnik w łaźni wodnej wstrząsającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, ustawić na 120 obrotów na minutę przez 45 minut, zatrzymując trawienie równą objętością roztworu blokującego pod koniec inkubacji. Sekwencyjnie przefiltrować próbkę, najpierw przez sitko o średnicy 100 mikrometrów, a następnie przefiltrować przez sitko o średnicy 70 mikrometrów i odwirować przefiltrowaną zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 200 razy g. Zawiesiliśmy osad w około 5 mililitrach buforu do lizy erytrocytów na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Zatrzymaj lizę równą objętością roztworu blokującego i przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Następnie zbieramy mikrorozdrobnione komórki tkanki tłuszczowej przez odwirowanie i zawieszamy osad w świeżym roztworze blokującym z mieszaniem mąki w celu zliczenia. Po dysocjacji i barwieniu przeciwciałami, mikrofragmentaryczne komórki tłuszczowe można przenieść do cytometru przepływowego w celu analizy i/lub sortowania komórek.

Mechaniczna dysocjacja lipoaspiratów manualnych powoduje wytworzenie mikrofragmentarycznej tkanki tłuszczowej, która składa się z agregatu adipocytów otaczających sieć mikronaczyniową. Analiza immunofluorescencyjna żelatyny osadzonej w kriofiksowanej mikrofragmentacji tkanki tłuszczowej uwydatnia strukturę, ukazującą sieć naczyniową zaznaczoną przez marker komórek śródbłonka receptor aglutyniny 1 Ulex Europaeus i składającą się głównie z małych naczyń włosowatych. Warto zauważyć, że perycyty eksprymujące antygen glejowy neuronów 2 lub receptor beta płytkowego czynnika wzrostu są normalnie rozmieszczone, otaczając komórki śródbłonka.

Wykluczając CD31-dodatnie śródbłonko i CD45-dodatnie komórki krwiotwórcze, można zidentyfikować obecność CD146-dodatnich CD34 perycytów oraz CD146-ujemnych i CD34-dodatnich komórek przybyszowych w MAT. Manualna lipoaspiracja jest krytyczną częścią procedury i musi być wykonana w sterylnych warunkach nie później niż 16 godzin po abdominoplastyce. Mikrofragmentacja tkanki tłuszczowej może być dalej przetwarzana przez barwienie immunohistochemiczne, hodowlę in vitro lub analizę sekretomu w celu uzyskania głębszego wglądu w biologię tkanki tłuszczowej.

Technika ta pozwala na badanie różnych tkanek w ich naturalnym, natywnym, trójwymiarowym układzie jako rodzaj małych organoidów, które są wystarczająco małe, aby można je było przeszczepić myszom lub utrzymać w długotrwałej hodowli. Używamy tego systemu głównie do eksperymentalnego podejścia do różnych mikrośrodowisk specyficznych dla narządów. Nasi dawcy tkanki tłuszczowej nie są znani jako nosiciele zakażeń zakaźnych.

Jednakże w przypadku braku dalszych badań przesiewowych wszystkie tkanki ludzkie należy uznać za potencjalnie skażone i odpowiednio się z nimi obchodzić.