Name: Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę obrazowania rozkładu tlenu w 2D za pomocą optycznych czujników luminescencyjnych i kamery w dziedzinie częstotliwości. Technika ta umożliwia wizualizację mikrośrodowiska tlenowego w ryizosferze roślin wodnych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sofie Lindegaard Jakobsen (Uniwersytet w Kopenhadze) i Larsowi Borregaardowi Pedersenowi (Uniwersytet w Aarhus) za pomoc techniczną. Finansowanie tego badania uzyskano z grantu Sapere-Aude Advanced z Niezależnego Funduszu Badawczego w Danii (DFF-1323-00065B; MK), granty projektowe z Niezależnego Funduszu Badawczego Dania | Nauki przyrodnicze (DFF-8021-00308B; MK) oraz Nauk Technicznych i Produkcyjnych (DFF-8022-00301B i DFF-4184-00515B; MK), Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF136) oraz Fundację Poul Due Jensen (KK).

Autor Gerhard Holst jest pracownikiem firmy PCO AG, która jest producentem systemu kamer użytego w tym artykule. PCO AG partycypowało finansowo w pokryciu kosztów publikacji i otwartego dostępu do artykułu.

W tym protokole uwzględniony jest cały przepływ pracy od przygotowania optody do analizy obrazuO2. Postępując zgodnie z tym protokołem, obrazy chemiczne można uzyskać za pomocą nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji opartej na domenie częstotliwości. W zależności od zastosowania, płaskie optody mogą być wytwarzane w różnych rozmiarach i grubościach warstwy czujnika, od wytrzymałych płaskich optodów o grubości 50-100 μm i kilku dziesiątych centymetra kwadratowego do szkiełek nakrywkowych mikroskopu z warstwami czujnika o grubości <1 μm 6,40. Potencjał tej metody został zademonstrowany przy szczególnym zastosowaniu, ale nie ogranicza się tylko do obrazowaniaO2 w ryzosferach roślinnych12,28.
Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z metodami obrazowania chemicznego opartymi na intensywności czystej luminescencji. Na obrazowanie czasu życia luminescencji nie ma wpływu, a przynajmniej w znacznie mniejszym stopniu, nierównomierne oświetlenie, nierówna grubość optody i wybielanie zdjęć25. Ponadto w tej metodzie unika się stosowania dodatkowego barwnika referencyjnego powszechnego w obrazowaniu ratiometrycznym17,37. W porównaniu z innymi systemami kamer opartymi na żywotności, takimi jak powszechnie stosowane kamery bramkowanew dziedzinie czasu 8,26, zaprezentowany tutaj nowatorski system kamer i protokół mogą zapewnić porównywalne wyniki. W niedawnej publikacji porównano charakterystyki analityczne tych dwóch systemów i stwierdzono, że system kamer o żywotności luminescencji oparty na domenie częstotliwości jest co najmniej porównywalny z wycofanym z produkcji poprzednikiem opartym na dziedzinie czasu8.
Przedstawiliśmy najprostszą optodęO2 składającą się tylko ze wskaźnika w matrycy polimerowej. Oprócz wielu innych możliwych wskaźnikówO2 20 , które mogą być stosowane, można dołączyć dodatki, tj. środki rozpraszające, takie jak TiO2 lub proszek diamentowy2 w celu zwiększenia sygnału czujnika przy jednoczesnym zmniejszeniu przezroczystości optody. Można również użyć dodatkowych barwników w celu zwiększenia intensywności sygnału poprzez transfer energii41.
W przypadku wytwarzania płaskiej optody zalecamy użycie szczeliny w urządzeniu do powlekania nożem wynoszącej 75 - 120 μm, aby uzyskać końcową grubość warstwy czujnika około 7,5 do 12 μm po odparowaniu rozpuszczalnika (około 10% zastosowanej szczeliny), w przypadku stosowania opisanego składu koktajlu czujnika. Jest to dobry kompromis pomiędzy intensywnością sygnału, która może być modyfikowana przez większe obciążenie barwnikiem, lub poprzez wybór barwników wskaźnikowych i referencyjnych o wyższej jasności, a czasem reakcji. Wzrost grubości warstwy powoduje wydłużenie czasu reakcji, ponieważ wydłuża się czas potrzebny do osiągnięcia przez analit równowagi termodynamicznej w warstwie czujnikowej z otaczającymi mediami12.
Optody, jak opisano tutaj, reagują na zmiany stężeniaO2 w ciągu kilku sekund17 , nadal mając wystarczająco silny sygnał luminescencyjny. Ultracienkie powłoki czujników z czasem reakcji poniżej sekundy mogą być realizowane za pomocą powłokispin-coating 6. Jeśli podpora lub urządzenie do powlekania noża nie są dobrze oczyszczone, może to spowodować powstanie niejednorodnych warstw czujnika. Ponadto, gdy koktajl nie jest całkowicie jednorodny lub nakładany zbyt szybko po rozprowadzeniu przed urządzeniem powlekającym, można zaobserwować taki niepożądany efekt. Dlatego może być potrzebna pewna praktyka, aby przygotować optymalne optody.
Metoda ta może być stosowana do obrazowania próbek, które mogą być w bliskim kontakcie z optodą, takich jak niektóre zwierzęta morskie42, biofilmy6 i gleby31 , by wymienić tylko kilka. Prezentujemy samodzielną konfigurację z obiektywem, jednak kamerę można łatwo połączyć z mikroskopem w celu obrazowania chemicznego o wyższej rozdzielczości43.
Podczas gdy obrazowanie czasu życia luminescencji w dziedzinie czasu umożliwiło tłumienie fluorescencji tła26, jest to problem w przypadku korzystania z nowego systemu kamer opartego na dziedzinie częstotliwości8. Ze względu na ciągłą akwizycję obrazu, kamera ta zarejestruje dowolną fluorescencję tła próbki, która może być wzbudzona przez wybraną diodę LED i emitowana w wybranym oknie widmowym, zgodnie z definicją filtra emisyjnego na obiektywie kamery. Spowoduje to pozornie krótszy czas życia, a co za tym idzie, fałszywe odczyty. W przypadku pracy z próbkami o znacznej fluorescencji wewnętrznej pokrywającej się ze wzbudzeniem i emisją czujnikaO2, konieczne jest zastosowanie dodatkowej izolacji optycznej na wierzchu optody, poprzez pokrycie dodatkowej warstwy zawierającej sadzę 2,17. W ten sposób do kamery dotrze tylko luminescencja emitowana z optody planarnej. W celu sprawdzenia luminescencji tła można wykonać zdjęcie bez optody, które następnie pokaże wyłącznie luminescencję wewnętrzną próbki. Możliwe jest również dodanie środków rozpraszających, takich jak TiO2 lub proszek diamentowy 2,44, do koktajlu czujnika, w celu zwiększenia intensywności luminescencji barwnika wskaźnikowego. Jednak może to również prowadzić do szybszego wybielania zdjęć, a TiO2 jest znanym fotokatalizatorem, który może pogorszyć fotostabilność barwnika41. Kolejnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest światło tła. Podczas obrazowania czasów życia luminescencji należy jak najskuteczniej unikać światła tła. Dlatego ta metoda obrazowania wymaga, aby zestaw był umieszczony w ciemnym otoczeniu, a wszelkie zewnętrzne źródła światła muszą być tymczasowo wyłączone podczas akwizycji obrazu.
Podsumowując, obrazowanie czasu życia luminescencji jest solidną metodą obrazowania chemicznego, którą można dostosować do wielu różnych zastosowań. Protokół ten (patrz sekcja 1 - 5) obejmuje wszystkie niezbędne kroki do wygenerowania obrazuO2 i wykorzystuje obecnie najbardziej elastyczny system obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości, który może zastąpić wycofaną kamerę bramkowaną w dziedzinie czasu do obrazowania 2D O2 z płaskimi optodami.

Rozkład i dynamika gazów rozpuszczonych oraz jonów w osadach i glebach dostarczają kluczowych informacji o procesach biogeochemicznych, takich jak oddychanie mikrobiologiczne1,2, radialna utrata tlenu z korzeni roślin3,4,5 oraz chemiczne mikrośrodowisko drobnoustrojów6,7, ryzosfer roślin5,8,9 i nor zwierzęcych10,11,12. Aktywność biologiczna i chemiczna w takich środowiskach ograniczonych dyfuzyjnie może prowadzić do powstania stromych gradientów substratów chemicznych lub produktów procesów biogeochemicznych. W szczególności dostępność O2 ma ogromny wpływ na procesy biogeochemiczne, a tym samym na biologię i ekologię systemu13. Dlatego analiza stężeń O2 z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową ma kluczowe znaczenie w naukach wodnych i lądowych. W pierwszej kolejności opracowano elektrochemiczne i optyczne mikrosensory14,15 do pomiaru tego ważnego anality. Później wprowadzono dwuwymiarowe (2D) obrazowanie O2 za pomocą optod płaskich12,16,17,18,19, co umożliwiło wizualizację i kwantyfikację heterogenicznego rozkładu O2 w glebach i osadach.
Planarne optody O2 składają się z barwnika wskaźnikowego wrażliwego na O220, który jest rozpuszczony w odpowiednim polimerze21. Barwnik wskaźnikowy jest pobudzany przy określonych długościach fal optycznych i podczas relaksacji emituje światło przesunięte w stronę czerwieni w postaci luminescencji. W obecności O2 wzbudzony barwnik wskaźnikowy może przekazać swoją energię cząsteczce O2 podczas kolizji, co określa się mianem wygaszania luminescencji opartego na kolizjach22. W związku z tym intensywność oraz czas życia luminescencji ulegają zmniejszeniu wraz ze wzrostem stężenia O223. W przypadku idealnym zmiana intensywności i czasu życia odpowiada równaniu Sterna-Volmera (równanie 1), wykorzystując intensywność lub czas życia luminescencji w nieobecności (I0; τ0) lub obecności (I, τ) O2 przy danym stężeniu [Q]. Stała Sterna-Volmera (Ksv) jest miarą czułości optody na O2; KSV zależy od zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura i ciśnienie.
(1) <img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg" />
Rejestrowanie takich zmian luminescencji nad płaską folią sensoryczną za pomocą systemu kamer może być wykorzystane do wizualizacji odpowiadających im zmian w rozkładzie O2. Początkowo stosowano proste obrazowanie O2 oparte na intensywności luminescencji18. Jednakże taka metodologia jest bardzo wrażliwa na zakłócenia zewnętrzne, które obniżają wiarygodność wyników ze względu na niejednorodne oświetlenie, wahania źródła wzbudzenia lub kamery, a także nierównomierny rozkład barwnika wskaźnikowego w płaskiej optodzie.
Niektóre z tych ograniczeń można zredukować, stosując płaskie optody do obrazowania ratiometrycznego17,24, w których barwnik wskaźnikowy czuły na O2 jest współimmobilizowany w warstwie polimerowej płaskiej optody wraz z nieczułym barwnikiem referencyjnym, emitującym w innym zakresie spektralnym niż wskaźnik O2. Na podstawie obrazów emisji pozyskanych w dwóch oknach spektralnych, sygnał emisji czuły na O2 jest dzielony przez sygnał referencyjny, co pozwala na wygenerowanie obrazu stosunku (ratio image), który jest mniej podatny na wspomniane wcześniej interferencje5,17. Metoda ta wymaga użycia drugiego barwnika, który w idealnym przypadku może być wzbudzany tym samym źródłem wzbudzenia, ale emituje na innej długości fali (bez znaczącego nakładania się widm), w innym oknie spektralnym kamery (np. w innym kanale kolorystycznym kamery RGB).
Alternatywnie obrazowanie O2 może opierać się na ilościowym określaniu zależnej od O2 zmiany czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego, co nie jest zaburzone przez nierównomierne oświetlenie lub niejednorodności w stężeniu wskaźnika25. Pierwsze systemy obrazowania O2 oparte na czasie życia luminescencji wykorzystywały pomiary w dziedzinie czasu z systemem kamer CCD (charged coupled device) z funkcją bramkowania26, w którym stosowano impulsowe źródło wzbudzenia, a obrazy luminescencji rejestrowano w określonych odstępach czasu w trakcie wzbudzenia lub emisji wskaźnika8,23,27. Na podstawie takich obrazów można wyznaczyć czas życia luminescencji i powiązać go z odpowiadającym mu stężeniem O2 w kalibracji. Następnie obrazy czasu życia luminescencji dla danej próbki dociśniętej do planarnej optody można przekształcić w obrazy odpowiadającego im dwuwymiarowego rozkładu stężenia O2. System ten był wykorzystywany w wielu zastosowaniach, zarówno w laboratorium, jak i in situ16,28, jednak kluczowa kamera CCD z funkcją bramkowania nie jest już dostępna w sprzedaży.
Niedawno wprowadzono inny system kamery do pomiaru czasu życia luminescencji, który pozyskuje obrazy w dziedzinie częstotliwości8. System ten opiera się na ciągle modulowanym źródle światła do wzbudzenia. Może to być fala sinusoidalna lub prostokątna zamiast wzbudzenia impulsowego, które jest stosowane do pozyskiwania obrazów w dziedzinie czasu. Modulacja ta skutkuje modulowaną emisją luminescencji barwnika wskaźnikowego O2, która jest przesunięta w fazie o kąt φ, zależny od czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego (τ) (patrz równanie 2).
(2) <img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg" />
Zmiana między amplitudą wzbudzenia a emisji (tj. tzw. indeks lub głębokość modulacji (amplituda podzielona przez stałą część luminescencji)) zależy również od czasu życia luminescencji. Zatem poprzez ustawienie znanej częstotliwości modulacji, specjalny czujnik obrazu CMOS w kamerze jest w stanie zmierzyć czas życia luminescencji w zakresie od ns do µs, co zostało szczegółowo opisane w innych publikacjach 8,29,30. Ogólny przewodnik po zasadzie działania można znaleźć (korzystając z następującego linku <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
W poniższym protokole prezentujemy zastosowanie nowoczesnego systemu kamer do obrazowania rozkładu stężenia O2 wokół korzeni wodnej rośliny słodkowodnej Littorella uniflora w 2D9,31. Pragniemy podkreślić, że metoda ta w żadnym stopniu nie ogranicza się tylko do tego zastosowania. Optody wrażliwe na tlen lub cząstki sensorowe27 w połączeniu z różnymi metodami obrazowania były wykorzystywane w badaniach medycznych32, w biodruku33, przy zastosowaniu farb wrażliwych na ciśnienie34,35 lub do badania układów fotosyntetycznych2,36,37, wymieniając jedynie niektóre z innych dziedzin zastosowań.

<table><tbody><tr><td>Pompa powietrza z kamieniem napowietrzającym i pompą wodną</td><td>Lokalny sklep</td><td></td><td></td>akwarystyczny</tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>DC4 związek</td><td>silikonowy Dow Corning GmbH</td><td>2793695</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik gazów</td><td>V&ouml; gtlin Instruments GmbH</td><td>red-y kompaktowy miernik GCM</td><td>To tylko jeden z możliwych instrumentów. Kilka firm oferuje urządzenia do mieszania gazów</td></tr>: <tr><td>Szklane płyty i akwaria Lokalne</td><td>akwarium lub sklep</td><td></td><td></td>z narzędziami</tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Bezpłatnie dostępne oprogramowanie do obrazowania (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td></tr><tr><td>Urządzenie do powlekania nożem</td><td> BYK-GARDNER GMBH</td> byk.com <td>2021</td><td>Jest to czterostronny aplikator folii, który umożliwia łatwą zmianę grubości folii. Dostępne są również inne wersje. Zalecamy grubość nakładanej folii w zakresie 75-120 i mikro; m, co daje końcową grubość warstwy czujnika wynoszącą ~10% grubości nałożonej przed odparowaniem rozpuszczalnika.</td></tr><tr><td>Lampa LED, Reflektor PAR38</td><td>Megaman</td><td>MM17572</td><td></td></tr><tr><td>LED LEDHUB</td><td>Omicon Laserage, Niemcy</td><td></td><td>Może być skonfigurowany z różnymi diodami LED. W prezentowanym przykładzie niezbędna jest zielona dioda LED (528 nm)</td></tr><tr><td>LOCTITE AA 3494</td><td>Henkel AG & Co. KGaA</td><td>NA</td><td>Klej błyskawiczny na bazie akrylu</td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software</td><td>Nikon Inc</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania używany do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>pco.flim</td><td>PCO AG, Niemcy</td><td></td><td>Dożywotnia żywotność luminescencji w</td></tr> <tr><td>oparciu o domenę częstotliwościplatyna(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorfenylo)-porfiryna (PtTFPP)</td><td>Frontier Scientific</td><td>PtT975</td> Folia wskaźnikowa z politereftalanu etylenu (PET) <td>O2</td></tr><tr><td></td><td>Goodfellow</td><td>320-992-72</td><td>Takie folie można również znaleźć u innych dostawców i służą jako solidne podparcie</td></tr><tr><td>Polistyren (PS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9003-53-6</td><td>Matryca polimerowa</td></tr><tr><td>Schott Filtr RG610</td><td>www.uviroptics.com</td><td></td><td>Tutaj można uzyskać przykręcanie 52 mm Filtry. Inne źródła oferują kwadratowe filtry szklane ze szkła Schott, które można zamocować przed obiektywem</td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna winylowa</td><td>Scotch, Super 33+</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Makro Planar 2/100 z adapterem Hama C do Nikon</td><td>dostarczany z aparatem</td><td></td><td>Tutaj każdy inny obiektyw może być również używany w połączeniu z adapterem, jeśli obiektyw nie ma mocowania C</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywotności luminescencjio2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Opisujemy metodę obrazowania rozpuszczonego tlenu (O2) w 2D w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (< 50-100 μm) i czasowej (< 10 s). Metoda wykorzystuje czułe folie czujników luminescencyjnych O2 (optody planarne) w połączeniu ze specjalistycznym systemem kamer do obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości. Optody planarne przygotowuje się przez rozpuszczenie barwnika wskaźnikowego wrażliwego naO2 w polimerze i rozprowadzenie mieszaniny na stałym podłożu o określonej grubości za pomocą powłoki nożowej. Po odparowaniu rozpuszczalnika, planarna optoda jest umieszczana w bliskim kontakcie z próbką będącą przedmiotem zainteresowania - tutaj pokazano z korzeniami rośliny wodnej Littorella uniflora. Zależna od stężenia O2 zmiana czasu życia luminescencji barwnika wskaźnikowego w optodzie płaskiej jest obrazowana przez tylną stronę przezroczystej folii nośnej i ścianę akwarium za pomocą specjalnej kamery. Kamera ta mierzy czas życia luminescencji (μs) poprzez przesunięcie kąta fazowego między modulowanym sygnałem wzbudzenia a sygnałem emisyjnym. Metoda ta jest lepsza od metod obrazowania intensywności luminescencji, ponieważ sygnał jest niezależny od stężenia barwnika lub intensywności źródła wzbudzenia i opiera się wyłącznie na czasie zaniku luminescencji, który jest parametrem nieodłącznie odwołującym. W związku z tym nie jest potrzebny dodatkowy barwnik referencyjny ani inne środki odniesienia. Demonstrujemy zastosowanie systemu do makroskopowego obrazowania O2 ryzosfer roślinnych, ale system kamer można również łatwo połączyć z mikroskopem.

Jako przykład zastosowania nowego systemu obrazowania prezentujemy obrazowanie 2D O2 złożonej próbki biologicznej (tj. ryzosfery rośliny wodnej Littorella uniflora).
W pierwszej kolejności metoda opisuje wytwarzanie płaskiej błony sensorycznej, tzw. optody planarnej. Jak pokazano na Rysunku 1, taka optoda składa się z cienkiej warstwy wskaźnika optycznego w matrycy polimerowej, naniesionej na przezroczyste podłoże. Postępując zgodnie z opisanym protokołem, otrzymuje się jednorodną błonę sensoryczną o równomiernej grubości, zdefiniowanej przez szczelinę urządzenia do powlekania nożowego. Jeśli otrzymana optoda wykazuje niejednorodny rozkład materiału sensorycznego (np. dziury w powłoce, pasy lub agregaty barwnika (można to ocenić wizualnie oraz z pomocą lampy UV)), należy powtórzyć protokół, a wszystkie materiały dokładnie oczyścić za pomocą acetonu.
Po przygotowaniu planarnego optodu można doprowadzić próbkę do bezpośredniego kontaktu z warstwą sensorową optodu, co pokazano tutaj na przykładzie planarnego optodu zintegrowanego w komorze typu rhizo-sandwich, w której korzenie rośliny w otaczającej matrycy osadów mogą być umieszczone w bliskim kontakcie z optodem (Rysunek 2). Jeśli komora rhizo-sandwich została przygotowana prawidłowo, powinna być łatwo przenaszalna z jednego akwarium (inkubacja) do drugiego (pomiar). W przypadku nieprawidłowego wykonania komora rhizo-sandwich może być niestabilna, może dochodzić do utraty osadu lub pojawić się pęcherzyki powietrza. Dlatego zaleca się przeprowadzenie kontroli wizualnej komory rhizo-sandwich bezpośrednio po montażu.
Przedstawiony protokół umożliwia obrazowanie czasu życia luminescencji próbki w kontakcie z płaską optodą w dziedzinie częstotliwości, z wykorzystaniem kamery do obrazowania czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości. Więcej szczegółów na temat tego systemu kamer, takich jak tryb akwizycji obrazu i charakterystyka naukowej kamery CMOS (SCMOS), podano w niedawnych publikacjach8,29.
Sama konfiguracja jest dość prosta i obejmuje jedynie kamerę sterującą źródłem światła (w tym przypadku źródłem wzbudzenia LED) oraz próbkę z optodą (Rycina 3). Należy upewnić się, że wszystkie elementy są prawidłowo podłączone, a próbka jest oświetlona jednorodnie. Podczas wykonywania pomiarów należy unikać światła tła.
Przed obrazowaniem próbki optoda musi zostać skalibrowana. Jak pokazano na Rycina 4A, zmierzony czas życia luminescencji maleje wraz ze wzrostem stężenia O2 zgodnie z quasi-wykładniczym zanikiem. Zależność tę można również opisać za pomocą uproszczonego modelu dwumiejscowego (Rycina 4B i równanie 3). W podanym przykładzie parametry niezbędne do późniejszego obliczenia stężenia O2 wynosiły: τ0 = 56.26 µs, Ksv = 0.032 hPa-1 oraz f = 0.86.
Przeprowadzenie kalibracji jest również idealnym sposobem na sprawdzenie, czy system działa poprawnie. Jeśli wszystkie komponenty zostały zainstalowane zgodnie z opisem (lub zgodnie z wytycznymi producenta), zmierzony czas życia powinien wykazywać taką samą zależność od O2, jaką przedstawiono na Rysunku 4. Ponadto, dla tej samej kombinacji materiałów sensorowych O2 (polimeru i barwnika), zmierzona wartość τ0 powinna mieścić się w tym samym zakresie (± kilka µs), co w pomiarach przedstawionych tutaj (zależność ta jest głównie wpływana przez temperaturę eksperymentalną). W przypadku braku możliwości uzyskania podobnej krzywej kalibracyjnej należy upewnić się, że wszystkie kroki zostały wykonane prawidłowo. Czasami optoda zostaje przypadkowo zamocowana stroną czułą skierowaną w stronę szklanej ścianki, a nie próbki, lub pozyskane obrazy są prześwietlone bądź niedoświetlone.
Wykorzystując parametry kalibracyjne, możliwe jest określenie stężenia O2 poprzez obrazowanie czasu życia luminescencji (τ). Zostało to zaprezentowane na Rysunku 5A,B, gdzie obrazowano rozkład stężenia O2 w ryzosferze Littorella uniflora odpowiednio w ciemności oraz po ekspozycji na światło o natężeniu 500 µmol fotonów m-2 s-1 przez 12 h. Ze względu na aktywność fotosyntetyczną rośliny, stężenie O2 w ryzosferze wzrosło po naświetleniu. Oprócz obrazów czasu życia, przy zachowaniu stałej geometrii obrazowania, można uzyskać obrazy „strukturalne” pod wpływem zewnętrznego oświetlenia. W ten sposób obrazy O2 można precyzyjnie skorelować z obrazem strukturalnym (Rysunek 5C), przekrojami poprzecznymi lub obszarami zainteresowania. Jako przykład, z obrazów uzyskanych odpowiednio w ciemności i w świetle wyodrębniono profile stężenia O2 w poprzek pojedynczego korzenia (Rysunek 5D).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg" /> 
Rycina 1: Wykonanie płaskiego optodu O2. (A) Folia PET zostaje przymocowana do szklanej płytki, a urządzenie do powlekania nożowego zostaje umieszczone na folii. (B) Przygotowana mieszanina sensorowa jest rozprowadzana na folii PET w formie cienkiej linii przed urządzeniem do powlekania nożowego. (C) Urządzenie do powlekania nożowego jest przesuwane w dół, aby rozprowadzić mieszaninę sensorową w postaci cienkiej warstwy na folii PET, co po odparowaniu rozpuszczalnika daje gotowy do użycia płaski optod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg" /> 
Rysunek 2: Montaż komory rhizo-sandwich z zintegrowanym płaskim optodem O2. (A) Optod zostaje przymocowany do jednej z szklanych płytek za pomocą filmu wodnego. (B) Optod zostaje przyklejony do płytki taśmą izolacyjną. (C) Osad zostaje wsypany do przeciwległej płytki z dołączonymi dystansami (tj. szkiełkami przedmiotowymi). (D) Korzenie roślin zostają umieszczone na równomiernie rozprowadzonym osadzie. (E) Komora rhizo-sandwich zostaje zamknięta i tymczasowo przymocowana zaciskami. (F) Całkowicie zamknięta i zmontowana komora rhizo-sandwich. (G) Aby chronić optod przed ekspozycją na światło lampy inkubacyjnej i uniknąć wzrostu glonów, nad zmontowaną komorą rhizo-sandwich umieszcza się plastikową osłonę. (H) Komora rhizo-sandwich inkubowana w akwarium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg" /> 
Rysunek 3: Układ obrazowania zawierający kamerę do pomiaru czasu życia luminescencji w dziedzinie częstotliwości, z obiektywem ustawionym na próbkę z optodą od tyłu przez przezroczyste ścianki akwarium i komory rhizo-sandwich. Przewód światłowodowy źródła wzbudzenia LED jest ustawiony tak, aby równomiernie oświetlać próbkę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg" /> 
Rycina 4: Krzywe kalibracyjne dla planarnej optody O2. (A) Różne czasy życia fosforescencji zmierzone przy odpowiednich stężeniach O2 w wypełnionej wodą komorze kalibracyjnej. (B) Wykres Sterna-Volmera z danych kalibracyjnych dopasowanych przy użyciu uproszczonego modelu dwumiejscowego dla dynamicznego wygaszania kolizyjnego (równanie 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg" /> 
Rycina 5: Obrazowanie czasu życia rozkładu O2 w ryzosferze rośliny wodnej Littorella uniflora. (A) Rozkład O2 po utrzymywaniu rośliny w świetle przez 12 h przy natężeniu około 500 µmol photons m-2 s-1. (B) Rozkład O2 po utrzymywaniu rośliny w ciemności przez 1 h. (C) Obraz strukturalny korzeni rośliny widziany przez optodę płaską. (D) Poprzeczny profil stężenia O2 (lokalizacja zaznaczona żółtą linią na panelach A i B) po 12 h w świetle (kolor czerwony) i 1 h w ciemności (kolor czarny). Adaptowano za zgodą (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O2 za pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiskaO2 w ryzosferze roślin wodnych.

Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Jako najlepszy akceptor elektronów, tlen odgrywa kluczową rolę w systemach biologicznych. Dzięki temu protokołowi można obrazować rozkład tlenu w 2D za pomocą optody. Oprócz wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, metoda ta nie wymaga dodatkowego barwnika referencyjnego, jest niezwykle wytrzymała i pozwala na uzyskanie obrazu strukturalnego.Metoda ta może być stosowana w różnych obszarach badań, w których tlen odgrywa kluczową rolę, w tym w ekologii, badaniach medycznych, biodruku i drukowaniu wrażliwym na nacisk. Produkcja optody może być trudna, ponieważ ilość koktajlu dodanego do folii nośnej i prędkość oporu urządzenia do powlekania noża może wymagać optymalizacji i praktyki. Dzięki temu wkładowi wideo chcemy udostępnić tę potężną technikę badaczom z innych dziedzin nauki.Aby przygotować planarną optodę tlenową, najpierw użyj warstwy wody lub 70% etanolu, aby przymocować czystą, bezpyłową folię PET na czystej szklanej płycie. Umieść czyste urządzenie do powlekania nożem o grubości 120 mikrometrów na folii i użyj szklanej pipety, aby nałożyć linię koktajlu czujnika przed urządzeniem. Następnie powoli i równomiernie przeciągnij urządzenie do powlekania nożem po folii PET, aby równomiernie rozprowadzić koktajl.Następnie wysusz gotową płaską optodę wrażliwą na tlen w powietrzu otoczenia przez godzinę przed wysuszeniem przez noc w ogrzewanej komorze w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza. Do następnego ranka zostanie uzyskana warstwa o grubości około 12 mikrometrów. Przechowuj optodę chronioną przed światłem do czasu dalszego użycia.Aby przygotować komorę ryzo-kanapkową, użyj światłoutwardzalnego kleju błyskawicznego na bazie akrylu, aby przykleić szkiełka mikroskopowe wzdłuż krawędzi szklanej płyty, pozostawiając jedną długą krawędź otwartą. Przytnij płaską optodę do wymaganego kształtu i rozmiaru, aby zmieściła się w przestrzeni między sklejonymi szkiełkami mikroskopowymi i umieść optodę po wewnętrznej stronie przedniej szklanej płyty powlekaną stroną do góry. Przyklej jedną krawędź folii optodowej do szklanej płytki i dodaj wodę z kranu między szklaną płytkę a folię optodową.Powoli opuść folię na kropelki wody, pozwalając optoda wyprostować się na powierzchni szkła i za pomocą miękkiej chusteczki ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między optodą a płytką. Następnie wytrzyj szklaną płytkę do sucha i przyklej pozostałe krawędzie folii do płyty. Następnie użyj płaskiej szklanej płytki, aby równomiernie rozprowadzić 0,5 milimetra osadu sitowego na płytce do tej samej grubości, co przekładki szkiełek mikroskopowych.Ostrożnie wyczyść górną powierzchnię szkiełka mikroskopu, aby upewnić się, że druga szklana płytka prawidłowo uszczelnia komorę i nałóż smar silikonowy na powierzchnię szkiełka mikroskopu. Następnie przykryj osad cienką warstwą wody, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przed umieszczeniem próbki na osadzie należy ostrożnie umyć pojedynczy pęd Littorella uniflora i umieścić pęd na osadzie z liśćmi wystającymi z górnej otwartej strony.Gdy próbka jest na miejscu, umieść szklaną płytkę z optodą na osadzie i delikatnie dociśnij, aby optoda znalazła się w bliskim kontakcie z korzeniami roślin i otaczającym osadem. Użyj zacisków, aby przymocować płyty do siebie i osuszyć zewnętrzne krawędzie bibułą. Kilkakrotnie dodawaj kilka kropel wody do liści, aby utrzymać nawodnienie rośliny podczas montażu ryzo-kanapki i użyj winylowej taśmy izolacyjnej, aby dokręcić komorę ryzo-kanapki.Następnie uszczelnij krawędzie modeliną i dodatkową taśmą izolacyjną. Aby przygotować się do obrazowania, po inkubacji usuń folię pokrywającą z obszaru optody i ustaw komorę ryzo-kanapkową ze szklaną ścianą z optodą pionowo przy ścianie akwarium. Za pomocą przekładki dociśnij komorę ryzo-kanapkową do ściany.Umieść dożywotnią kamerę luminescencji opartą na dziedzinie częstotliwości, wyposażoną w obiektyw, przed akwarium i obszarem zainteresowania. Podłącz odpowiedni filtr emisyjny do obrazowania barwnika wskaźnikowego do obiektywu kamery i zamocuj światłowód w źródle wzbudzenia LED. Następnie ustaw prowadnicę tak, aby równomiernie oświetlała planarną folię optodową pokrywającą obszar zainteresowania.W oprogramowaniu do obrazowania wybierz kamerę i wybierz diodę LED w oprogramowaniu sterującym diodami LED. Ustaw intensywność diody LED zgodnie z potrzebami i zaznacz opcję analogowy i synchronizuj, aby potwierdzić, że dioda LED jest wyzwalana przez zewnętrzną logikę tranzystor-tranzystor. Ręcznie ustaw ostrość aparatu i wyreguluj przysłonę obiektywu oraz ustaw wewnętrzne źródło modulacji, falę sinusoidalną dla przebiegu wyjściowego, dodatkowe próbkowanie fazy, próbki ośmiofazowe, odwrotną kolejność faz, odczyt tap AB i częstotliwość modulacji pięciu kiloherców.Dostosuj czas ekspozycji, aż odczyt statystyk obszaru zainteresowania dla znormalizowanego obrazu o intensywności luminescencji znajdzie się w zakresie od 0,68 do 0,72. Następnie kliknij przycisk Przechwyć odniesienie, aby rozpocząć pobieranie referencyjnej serii pomiarowej. Aby skalibrować optodę, użyj urządzenia do mieszania gazów, aby przepłukać wodę w akwarium kalibracyjnym mieszanką azotu z powietrza otoczenia o znanym stężeniu tlenu, monitorując stężenie tlenu za pomocą zewnętrznej sondy z czujnikiem tlenu.Następnie należy wykonać serię obrazów przy różnych stężeniach tlenu w komorze kalibracyjnej, aby uzyskać odpowiednie dopasowanie krzywej do uzyskanych danych kalibracyjnych. Po skalibrowaniu systemu wyłącz światła, stosując napromieniowanie na roślinę i wszystkie inne źródła światła, a następnie dostosuj czas akwizycji w oparciu o intensywność obrazu, aby upewnić się, że sygnał nie jest ani przesycony, ani zbyt słaby, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu w całym okresie użytkowania. Po uzyskaniu wszystkich obrazów czasu życia tlenu włącz ponownie światła, aby uzyskać obraz strukturalny i uzyskaj obraz za pomocą linijki w polu view, aby umożliwić późniejsze skalowanie uzyskanych obrazów.Przed obrazowaniem próbki należy skalibrować optodę. Po rozpadzie quasi-wykładniczym zmierzony czas życia luminescencji zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia tlenu. Zależność tę można również opisać za pomocą uproszczonego modelu dwulokacyjnego.Po skalibrowaniu optody możliwe jest określenie stężenia tlenu poprzez obrazowanie czasu życia luminescencji, jak zaobserwowano na tych obrazach, na których rozkład stężenia tlenu w ryzosferze Littorella uniflora został zobrazowany po ekspozycji na światło 500 fotonów mikromolowych na metr kwadratowy na sekundę przez 12 godzin i po 12 godzinach w ciemności. Oprócz obrazów z całego okresu użytkowania, obrazy strukturalne mogą być również rejestrowane przy zewnętrznym oświetleniu, przy jednoczesnym utrzymaniu stałej geometrii obrazowania, aby umożliwić precyzyjne skorelowanie obrazowania tlenu z obrazem strukturalnym. Na przykład profile stężenia tlenu w pojedynczym korzeniu można następnie wyodrębnić z obrazów uzyskanych w ciemności i świetle.Bardzo ważne jest, aby mieć dobry kontakt między matrycą próbki a optodą, aby uniknąć niepotrzebnych artefaktów. Jeśli masz wątpliwości, przerób kanapkę. Natychmiastowa akwizycja obrazu w sposób nieniszczący umożliwia monitorowanie środowiska tlenowego.Metodę tę można równie dobrze łączyć z innymi optodami do pomiaru pH lub innymi analitami. Pamiętaj, aby wykonać produkcję optode w dygestorium, ponieważ koktajl czujnika zawiera chloroform. Optody planarne mogą być używane do identyfikacji zbiorowisk drobnoustrojów w osadzie.Po zobrazowaniu kanapkę można otworzyć, aby pobrać próbki z tych gorących punktów do analizy społeczności mikrobiologicznej.

luminescence-lifetime-imaging-o2-with-frequency-domain-based-camera

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) stało się kluczową techniką obrazowania środowiska i oddziaływań specyficznych białek oraz barwników w żywych komórkach. FLIM fluorescencyjnych rotorów molekularnych umożliwia mapowanie lepkości w żywych komórkach.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji rotorów molekularnych w żywych komórkach

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy niezawodną metodę monitorowania inkorporacji nanocząstek do matrycy gospodarza polimeru poprzez enkapsulację pęcznienia. Pokazujemy, że stężenie powierzchniowe kropek kwantowych selenku kadmu można dokładnie zobrazować za pomocą przekrojowego obrazowania fluorescencyjnego.

Zaawansowana analiza składu kompozytów nanocząstkowo-polimerowych z wykorzystaniem bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego

Doskonała stabilność chemiczna i luminescencyjna luminoforów (tle)azotkowych przedstawia go jako obiecującą alternatywę dla obecnie stosowanych luminoforów siarczkowych i tlenkowych. W artykule przedstawiono sposób badania jego lokalnych właściwości luminescencyjnych za pomocą niskoenergetycznej katodoluluminescencji (CL).

Niskoenergetyczna katodomluminescencja dla luminoforów (tle)azotkowych

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Tutaj prezentujemy metodę spektroskopowej charakterystyki cząsteczek organicznych za pomocą czasowo-rozdzielczej spektroskopii fotoluminescencyjnej w skali nanosekundowej do milisekundowej w warunkach beztlenowych. Opisano również metody skutecznego usuwania tlenu z próbek, a tym samym ograniczania wygaszania luminescencji.

Czasowo-rozdzielcza charakterystyka fotofizyczna związków organicznych zbierających potrójnie w środowisku beztlenowym przy użyciu kamery iCCD

Tutaj prezentujemy protokół do optycznego wykrywania informacji chemicznych o wysokiej rozdzielczości wokół wszczepionych urządzeń medycznych z obrazowaniem chemicznym wzbudzonym promieniowaniem rentgenowskim (XELCI). Ta nowatorska technika obrazowania została opracowana w naszym laboratorium, co umożliwia badanie biochemii zakażeń związanych z implantami.

Obrazowanie chemiczne infekcji związanych z implantami o wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą obrazowania chemicznego luminescencji wzbudzonej promieniowaniem rentgenowskim przez tkankę

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj metodę obrazowania rozkładu tlenu w 2D za pomocą optycznych czujników luminescencyjnych i kamery w dziedzinie częstotliwości. Technika ta umożliwia wizualizację mikrośrodowiska tlenowego w ryizosferze roślin wodnych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Obrazowanie żywotności luminescencji_O2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

Przeglądaj więcej filmów