Obrazowanie żywotności luminescencji_O2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O_{2 za} pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiska_O2 w ryzosferze roślin wodnych.

Jako najlepszy akceptor elektronów, tlen odgrywa kluczową rolę w systemach biologicznych. Dzięki temu protokołowi można obrazować rozkład tlenu w 2D za pomocą optody. Oprócz wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, metoda ta nie wymaga dodatkowego barwnika referencyjnego, jest niezwykle wytrzymała i pozwala na uzyskanie obrazu strukturalnego.

Metoda ta może być stosowana w różnych obszarach badań, w których tlen odgrywa kluczową rolę, w tym w ekologii, badaniach medycznych, biodruku i drukowaniu wrażliwym na nacisk. Produkcja optody może być trudna, ponieważ ilość koktajlu dodanego do folii nośnej i prędkość oporu urządzenia do powlekania noża może wymagać optymalizacji i praktyki. Dzięki temu wkładowi wideo chcemy udostępnić tę potężną technikę badaczom z innych dziedzin nauki.

Aby przygotować planarną optodę tlenową, najpierw użyj warstwy wody lub 70% etanolu, aby przymocować czystą, bezpyłową folię PET na czystej szklanej płycie. Umieść czyste urządzenie do powlekania nożem o grubości 120 mikrometrów na folii i użyj szklanej pipety, aby nałożyć linię koktajlu czujnika przed urządzeniem. Następnie powoli i równomiernie przeciągnij urządzenie do powlekania nożem po folii PET, aby równomiernie rozprowadzić koktajl.

Następnie wysusz gotową płaską optodę wrażliwą na tlen w powietrzu otoczenia przez godzinę przed wysuszeniem przez noc w ogrzewanej komorze w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza. Do następnego ranka zostanie uzyskana warstwa o grubości około 12 mikrometrów. Przechowuj optodę chronioną przed światłem do czasu dalszego użycia.

Aby przygotować komorę ryzo-kanapkową, użyj światłoutwardzalnego kleju błyskawicznego na bazie akrylu, aby przykleić szkiełka mikroskopowe wzdłuż krawędzi szklanej płyty, pozostawiając jedną długą krawędź otwartą. Przytnij płaską optodę do wymaganego kształtu i rozmiaru, aby zmieściła się w przestrzeni między sklejonymi szkiełkami mikroskopowymi i umieść optodę po wewnętrznej stronie przedniej szklanej płyty powlekaną stroną do góry. Przyklej jedną krawędź folii optodowej do szklanej płytki i dodaj wodę z kranu między szklaną płytkę a folię optodową.

Powoli opuść folię na kropelki wody, pozwalając optoda wyprostować się na powierzchni szkła i za pomocą miękkiej chusteczki ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między optodą a płytką. Następnie wytrzyj szklaną płytkę do sucha i przyklej pozostałe krawędzie folii do płyty. Następnie użyj płaskiej szklanej płytki, aby równomiernie rozprowadzić 0,5 milimetra osadu sitowego na płytce do tej samej grubości, co przekładki szkiełek mikroskopowych.

Ostrożnie wyczyść górną powierzchnię szkiełka mikroskopu, aby upewnić się, że druga szklana płytka prawidłowo uszczelnia komorę i nałóż smar silikonowy na powierzchnię szkiełka mikroskopu. Następnie przykryj osad cienką warstwą wody, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przed umieszczeniem próbki na osadzie należy ostrożnie umyć pojedynczy pęd Littorella uniflora i umieścić pęd na osadzie z liśćmi wystającymi z górnej otwartej strony.

Gdy próbka jest na miejscu, umieść szklaną płytkę z optodą na osadzie i delikatnie dociśnij, aby optoda znalazła się w bliskim kontakcie z korzeniami roślin i otaczającym osadem. Użyj zacisków, aby przymocować płyty do siebie i osuszyć zewnętrzne krawędzie bibułą. Kilkakrotnie dodawaj kilka kropel wody do liści, aby utrzymać nawodnienie rośliny podczas montażu ryzo-kanapki i użyj winylowej taśmy izolacyjnej, aby dokręcić komorę ryzo-kanapki.

Następnie uszczelnij krawędzie modeliną i dodatkową taśmą izolacyjną. Aby przygotować się do obrazowania, po inkubacji usuń folię pokrywającą z obszaru optody i ustaw komorę ryzo-kanapkową ze szklaną ścianą z optodą pionowo przy ścianie akwarium. Za pomocą przekładki dociśnij komorę ryzo-kanapkową do ściany.

Umieść dożywotnią kamerę luminescencji opartą na dziedzinie częstotliwości, wyposażoną w obiektyw, przed akwarium i obszarem zainteresowania. Podłącz odpowiedni filtr emisyjny do obrazowania barwnika wskaźnikowego do obiektywu kamery i zamocuj światłowód w źródle wzbudzenia LED. Następnie ustaw prowadnicę tak, aby równomiernie oświetlała planarną folię optodową pokrywającą obszar zainteresowania.

W oprogramowaniu do obrazowania wybierz kamerę i wybierz diodę LED w oprogramowaniu sterującym diodami LED. Ustaw intensywność diody LED zgodnie z potrzebami i zaznacz opcję analogowy i synchronizuj, aby potwierdzić, że dioda LED jest wyzwalana przez zewnętrzną logikę tranzystor-tranzystor. Ręcznie ustaw ostrość aparatu i wyreguluj przysłonę obiektywu oraz ustaw wewnętrzne źródło modulacji, falę sinusoidalną dla przebiegu wyjściowego, dodatkowe próbkowanie fazy, próbki ośmiofazowe, odwrotną kolejność faz, odczyt tap AB i częstotliwość modulacji pięciu kiloherców.

Dostosuj czas ekspozycji, aż odczyt statystyk obszaru zainteresowania dla znormalizowanego obrazu o intensywności luminescencji znajdzie się w zakresie od 0,68 do 0,72. Następnie kliknij przycisk Przechwyć odniesienie, aby rozpocząć pobieranie referencyjnej serii pomiarowej. Aby skalibrować optodę, użyj urządzenia do mieszania gazów, aby przepłukać wodę w akwarium kalibracyjnym mieszanką azotu z powietrza otoczenia o znanym stężeniu tlenu, monitorując stężenie tlenu za pomocą zewnętrznej sondy z czujnikiem tlenu.

Następnie należy wykonać serię obrazów przy różnych stężeniach tlenu w komorze kalibracyjnej, aby uzyskać odpowiednie dopasowanie krzywej do uzyskanych danych kalibracyjnych. Po skalibrowaniu systemu wyłącz światła, stosując napromieniowanie na roślinę i wszystkie inne źródła światła, a następnie dostosuj czas akwizycji w oparciu o intensywność obrazu, aby upewnić się, że sygnał nie jest ani przesycony, ani zbyt słaby, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu w całym okresie użytkowania. Po uzyskaniu wszystkich obrazów czasu życia tlenu włącz ponownie światła, aby uzyskać obraz strukturalny i uzyskaj obraz za pomocą linijki w polu view, aby umożliwić późniejsze skalowanie uzyskanych obrazów.

Przed obrazowaniem próbki należy skalibrować optodę. Po rozpadzie quasi-wykładniczym zmierzony czas życia luminescencji zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia tlenu. Zależność tę można również opisać za pomocą uproszczonego modelu dwulokacyjnego.

Po skalibrowaniu optody możliwe jest określenie stężenia tlenu poprzez obrazowanie czasu życia luminescencji, jak zaobserwowano na tych obrazach, na których rozkład stężenia tlenu w ryzosferze Littorella uniflora został zobrazowany po ekspozycji na światło 500 fotonów mikromolowych na metr kwadratowy na sekundę przez 12 godzin i po 12 godzinach w ciemności. Oprócz obrazów z całego okresu użytkowania, obrazy strukturalne mogą być również rejestrowane przy zewnętrznym oświetleniu, przy jednoczesnym utrzymaniu stałej geometrii obrazowania, aby umożliwić precyzyjne skorelowanie obrazowania tlenu z obrazem strukturalnym. Na przykład profile stężenia tlenu w pojedynczym korzeniu można następnie wyodrębnić z obrazów uzyskanych w ciemności i świetle.

Bardzo ważne jest, aby mieć dobry kontakt między matrycą próbki a optodą, aby uniknąć niepotrzebnych artefaktów. Jeśli masz wątpliwości, przerób kanapkę. Natychmiastowa akwizycja obrazu w sposób nieniszczący umożliwia monitorowanie środowiska tlenowego.

Metodę tę można równie dobrze łączyć z innymi optodami do pomiaru pH lub innymi analitami. Pamiętaj, aby wykonać produkcję optode w dygestorium, ponieważ koktajl czujnika zawiera chloroform. Optody planarne mogą być używane do identyfikacji zbiorowisk drobnoustrojów w osadzie.

Po zobrazowaniu kanapkę można otworzyć, aby pobrać próbki z tych gorących punktów do analizy społeczności mikrobiologicznej.