Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Opracowanie selektywnych narzędzi do dostarczania genów i leków w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych wymaga kwantyfikacji i charakterystyki celowania w komórki, po ponownym podaniu, wektorów wirusowych lub nanocząstek. Mają przepustowość i możliwości multipleksowania cytometrii przepływowej, umożliwiają prostą i jednoczesną identyfikację wielu typów komórek z mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Procedurę zademonstruje Francisco Javier Molina Estevez, post-doc z Alexander's Laboratory.

Po pobraniu mózgu i rdzenia kręgowego od ośmiotygodniowej myszy C57 Black 6, umieść tkanki w pojedynczych dołkach sześciodołkowej płytki, zawierającej dwa mililitry lodowatego HPSS na studzienkę na lodzie. Podziel każdą pobraną tkankę na dwie równe części. I użyj nożyczek, aby zmielić połowę każdej próbki tkanki na kawałki o grubości od jednego do dwóch milimetrów.

Gdy wszystkie tkanki zostaną rozdrobnione, należy wstępnie wypłukać zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów w HPSS i użyć pipety do przeniesienia każdej zawiesiny tkanki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz studzienki dodatkowymi dwoma mililitrami HPSS na studzienkę. I wyciągnij pranie w odpowiednich stożkowych rurkach o pojemności 15 mililitrów.

Osadzać próbki przez odwirowanie. I wymieszaj 50 mikrolitrów enzymu P z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych z 1 900 mikrolitrami buforu X z zestawu na próbkę. Podgrzej mieszaninę enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.

I odessać supernatant z każdej probówki do pobierania tkanek. Gdy mieszanina enzymów jest gotowa, dodaj 1,95 mililitra roztworu do każdej próbki. I delikatnie wiruj, aby ponownie zawiesić granulki.

Następnie inkubować próbki na kole przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wymieszać 10 mikrolitrów enzymu A z 20 mikrolitrami buforu Y na próbkę. Wstępnie podgrzej drugi roztwór enzymu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu do każdego roztworu tkankowego pod koniec inkubacji z wytrząsaniem. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, wstępnie przepłukanej HPSS, aby delikatnie wymieszać każdą próbkę.

I włóż próbki do koła na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcje enzymatyczne za pomocą 10 mililitrów lodowatego HPSS. I osadzać próbki przez odwirowanie.

Pod koniec wirowania ponownie zawiesić granulki w siedmiu mililitrach lodowatego HPSS na probówkę. I delikatnie zwiruj każdą próbkę, zanim przytrzymasz probówki na lodzie. W celu homogenizacji tkanek dodaj trzy mililitry wstępnie schłodzonego HPSS do wstępnie schłodzonej szklanej zaprawy młynka do tkanek i przenieś drugą połowę jednej z pobranych próbek tkanki mózgu lub rdzenia kręgowego do zaprawy.

Delikatnie maceruj tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B. I przenieś homogenizowaną mieszaninę do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Napełnij probówkę do końcowej objętości 10 mililitrów wstępnie schłodzonym HPSS do odwirowania. I ponownie zawiesić granulat w siedmiu mililitrach świeżego HPSS z wirowaniem, przed trzymaniem próbki na lodzie.

W celu usunięcia zanieczyszczeń dodać trzy mililitry wstępnie schłodzonego izotonicznego roztworu Percollu do każdej strawionej lub homogenizowanej próbki. I delikatnie zwirować próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane. Następnie odwirować próbki i ostrożnie usunąć białawy krążek zanieczyszczeń i mieliny unoszący się na powierzchni roztworu.

Po wyrzuceniu zanieczyszczeń należy zebrać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki, nie naruszając granulek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze roztworu FACS BL w celu przeniesienia do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Po tej integracji z roztworem Percoll ważne jest, aby bardzo ostrożnie usunąć krążek zanieczyszczeń i supernatant bez usuwania osadu komórkowego, aby uniknąć utraty próbki.

Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w 350 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę. W przypadku analizy cytometrycznej przepływowej izolowanych typów komórek, należy inkubować próbki z pięcioma mikrogramami na mililitr bloku FC na probówkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed dodaniem odpowiedniego przeciwciała do każdej probówki zgodnie ze stałym protokołem przedstawionym w tabeli. Wiruj każdą probówkę przez pięć sekund, aby wymieszać.

I umieść próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, chroniąc je przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki jednym mililitrem PBS na probówkę i odwirować. Ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości streptawidyny w każdej probówce.

Po wirowaniu w celu wymieszania próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. I umyj komórki jednym mililitrem PBS na probówkę, jak pokazano. Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę.

I oznacz każdą próbkę pięcioma mikrolitrami 7-AAD. Następnie przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, do czasu analizy cytofluorometrycznej. Metoda homogenizacji daje wyższą wydajność komórek zarówno z mózgu, jak i rdzenia kręgowego, ale większość pobranych komórek jest zazwyczaj martwa, co powoduje, że tylko około 14% żywych komórek zostaje wyleczonych z mózgu i około 10% wyleczonych z rdzenia kręgowego.

W przeciwieństwie do tego, metoda trawienia papainy skutkuje ogólnie lepszym zachowaniem żywotności komórek. Analiza zawiesin komórek mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą dziewięciokolorowej cytometrii dwuprzepływowej ujawnia obecność CD45 + CD11b + mikrogleju i makrofagów. I limfocyty CD45 + CD11b w obu tkankach.

Populacje komórek CD45 można następnie rozróżnić według ich dodatniego wpływu na markery astrocytów lub oligodendrocytów lub ekspresję markerów powierzchni ferionalnej i śródbłonka. Stosując metodę homogenizacji, od 32 do 38% żywotnych komórek jest pochodzenia krwiotwórczego. Podczas gdy metoda trawienia enzymatycznego powoduje nabycie bardzo dużej frakcji niehematopoetycznych komórek CD45.

Co ciekawe, CD45 + CD11b + mikroglej i makrofagi reprezentują najliczniejszą frakcję komórek żywotnych w metodzie homogenizacji. Metoda trawienia daje jednak bardziej niejednorodną reprezentację typów komórek, w tym astrocytów, oligodendrocytów, komórek śródbłonka i neuronów. Protokół ten jest wszechstronny i może być wykorzystany do kilku dalszych zastosowań, takich jak kwantyfikacja lub izolacja określonych subpopulacji komórek, hodowla pierwotna, analiza biochemiczna lub sekwencjonowanie RNA.

Wdrożyliśmy ten protokół do oceny ekspresji genów i sygnatur funkcjonalnych różnych populacji OUN podczas tej progresji lub po leczeniu w mysim modelu endotroficznego stwardnienia bocznego.