Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji
November 19th, 2019
Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.
Opracowanie selektywnych narzędzi do dostarczania genów i leków w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych wymaga kwantyfikacji i charakterystyki celowania w komórki, po ponownym podaniu, wektorów wirusowych lub nanocząstek. Mają przepustowość i możliwości multipleksowania cytometrii przepływowej, umożliwiają prostą i jednoczesną identyfikację wielu typów komórek z mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Procedurę zademonstruje Francisco Javier Molina Estevez, post-doc z Alexander's Laboratory.
Po pobraniu mózgu i rdzenia kręgowego od ośmiotygodniowej myszy C57 Black 6, umieść tkanki w pojedynczych dołkach sześciodołkowej płytki, zawierającej dwa mililitry lodowatego HPSS na studzienkę na lodzie. Podziel każdą pobraną tkankę na dwie równe części. I użyj nożyczek, aby zmielić połowę każdej próbki tkanki na kawałki o grubości od jednego do dwóch milimetrów.
Gdy wszystkie tkanki zostaną rozdrobnione, należy wstępnie wypłukać zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów w HPSS i użyć pipety do przeniesienia każdej zawiesiny tkanki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz studzienki dodatkowymi dwoma mililitrami HPSS na studzienkę. I wyciągnij pranie w odpowiednich stożkowych rurkach o pojemności 15 mililitrów.
Osadzać próbki przez odwirowanie. I wymieszaj 50 mikrolitrów enzymu P z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych z 1 900 mikrolitrami buforu X z zestawu na próbkę. Podgrzej mieszaninę enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.
I odessać supernatant z każdej probówki do pobierania tkanek. Gdy mieszanina enzymów jest gotowa, dodaj 1,95 mililitra roztworu do każdej próbki. I delikatnie wiruj, aby ponownie zawiesić granulki.
Następnie inkubować próbki na kole przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wymieszać 10 mikrolitrów enzymu A z 20 mikrolitrami buforu Y na próbkę. Wstępnie podgrzej drugi roztwór enzymu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu do każdego roztworu tkankowego pod koniec inkubacji z wytrząsaniem. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, wstępnie przepłukanej HPSS, aby delikatnie wymieszać każdą próbkę.
I włóż próbki do koła na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcje enzymatyczne za pomocą 10 mililitrów lodowatego HPSS. I osadzać próbki przez odwirowanie.
Pod koniec wirowania ponownie zawiesić granulki w siedmiu mililitrach lodowatego HPSS na probówkę. I delikatnie zwiruj każdą próbkę, zanim przytrzymasz probówki na lodzie. W celu homogenizacji tkanek dodaj trzy mililitry wstępnie schłodzonego HPSS do wstępnie schłodzonej szklanej zaprawy młynka do tkanek i przenieś drugą połowę jednej z pobranych próbek tkanki mózgu lub rdzenia kręgowego do zaprawy.
Delikatnie maceruj tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B. I przenieś homogenizowaną mieszaninę do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Napełnij probówkę do końcowej objętości 10 mililitrów wstępnie schłodzonym HPSS do odwirowania. I ponownie zawiesić granulat w siedmiu mililitrach świeżego HPSS z wirowaniem, przed trzymaniem próbki na lodzie.
W celu usunięcia zanieczyszczeń dodać trzy mililitry wstępnie schłodzonego izotonicznego roztworu Percollu do każdej strawionej lub homogenizowanej próbki. I delikatnie zwirować próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane. Następnie odwirować próbki i ostrożnie usunąć białawy krążek zanieczyszczeń i mieliny unoszący się na powierzchni roztworu.
Po wyrzuceniu zanieczyszczeń należy zebrać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki, nie naruszając granulek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze roztworu FACS BL w celu przeniesienia do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Po tej integracji z roztworem Percoll ważne jest, aby bardzo ostrożnie usunąć krążek zanieczyszczeń i supernatant bez usuwania osadu komórkowego, aby uniknąć utraty próbki.
Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w 350 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę. W przypadku analizy cytometrycznej przepływowej izolowanych typów komórek, należy inkubować próbki z pięcioma mikrogramami na mililitr bloku FC na probówkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed dodaniem odpowiedniego przeciwciała do każdej probówki zgodnie ze stałym protokołem przedstawionym w tabeli. Wiruj każdą probówkę przez pięć sekund, aby wymieszać.
I umieść próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, chroniąc je przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki jednym mililitrem PBS na probówkę i odwirować. Ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości streptawidyny w każdej probówce.
Po wirowaniu w celu wymieszania próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. I umyj komórki jednym mililitrem PBS na probówkę, jak pokazano. Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę.
I oznacz każdą próbkę pięcioma mikrolitrami 7-AAD. Następnie przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, do czasu analizy cytofluorometrycznej. Metoda homogenizacji daje wyższą wydajność komórek zarówno z mózgu, jak i rdzenia kręgowego, ale większość pobranych komórek jest zazwyczaj martwa, co powoduje, że tylko około 14% żywych komórek zostaje wyleczonych z mózgu i około 10% wyleczonych z rdzenia kręgowego.
W przeciwieństwie do tego, metoda trawienia papainy skutkuje ogólnie lepszym zachowaniem żywotności komórek. Analiza zawiesin komórek mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą dziewięciokolorowej cytometrii dwuprzepływowej ujawnia obecność CD45 + CD11b + mikrogleju i makrofagów. I limfocyty CD45 + CD11b w obu tkankach.
Populacje komórek CD45 można następnie rozróżnić według ich dodatniego wpływu na markery astrocytów lub oligodendrocytów lub ekspresję markerów powierzchni ferionalnej i śródbłonka. Stosując metodę homogenizacji, od 32 do 38% żywotnych komórek jest pochodzenia krwiotwórczego. Podczas gdy metoda trawienia enzymatycznego powoduje nabycie bardzo dużej frakcji niehematopoetycznych komórek CD45.
Co ciekawe, CD45 + CD11b + mikroglej i makrofagi reprezentują najliczniejszą frakcję komórek żywotnych w metodzie homogenizacji. Metoda trawienia daje jednak bardziej niejednorodną reprezentację typów komórek, w tym astrocytów, oligodendrocytów, komórek śródbłonka i neuronów. Protokół ten jest wszechstronny i może być wykorzystany do kilku dalszych zastosowań, takich jak kwantyfikacja lub izolacja określonych subpopulacji komórek, hodowla pierwotna, analiza biochemiczna lub sekwencjonowanie RNA.
Wdrożyliśmy ten protokół do oceny ekspresji genów i sygnatur funkcjonalnych różnych populacji OUN podczas tej progresji lub po leczeniu w mysim modelu endotroficznego stwardnienia bocznego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę cytometrii przepływowej służącą do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek z mózgu i rdzenia kręgowego myszy. Technika ta może być wykorzystana do izolowania lub charakteryzacji czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych oraz do oceny ukierunkowania komórek po podaniu wewnątrzorganizmowym wirusowych wektorów lub nanocząstek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Tło
- Selektywne narzędzia dostarczania genów i leków są niezbędne w leczeniu zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Ilościowa ocena i charakterystyka ukierunkowania komórek są kluczowe dla skutecznego leczenia.
- Cytometria przepływowa oferuje możliwości wysokiego przepływu i multiplexingu.
- Ta metoda umożliwia bezpośrednią identyfikację wielu typów komórek.
Cel badania
- Opracowanie metody identyfikacji różnych typów komórek w mózgu i rdzeniu kręgowym myszy.
- Ułatwienie izolacji czystych populacji komórek do badań.
- Ilościowa ocena zakresu ukierunkowania komórek przez wektory wirusowe lub nanocząsteczki.
Stosowane metody
- Zbieranie tkanek mózgu i rdzenia kręgowego od myszy C57 Black 6.
- Używanie lodowatego HPSS do zachowania tkanek.
- Drobienie próbek tkanek na małe kawałki dla analizy.
- Wykorzystanie cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji typów komórek.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja wielu typów komórek z zebranych tkanek.
- Wykazanie skuteczności cytometrii przepływowej w tym kontekście.
- Dostarczenie metody oceny ukierunkowania komórek in vivo.
- Możliwość charakteryzacji populacji komórek istotnych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Metoda cytometrii przepływowej jest cennym narzędziem w badaniach neuronaukowych.
- Ta technika może poprawić zrozumienie chorób neurodegeneracyjnych.
- Oferuje potencjał poprawy strategii dostarczania genów i leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, multiplexed quantification of CNS cell subtypes from mouse brain and spinal cord, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. By comparing homogenization and enzymatic dissociation approaches, it informs method selection based on cell yield, viability, and composition—critical for downstream applications like primary culture, gene expression, and functional assays. The workflow enhances predictive confidence in assessing viral vector or nanoparticle targeting, directly informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying cell-specific targeting of viral vectors or nanoparticles in CNS tissues.
- Operational Value: Enables simultaneous identification of microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons, and endothelial cells in a single assay.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential cell viability and composition between dissociation methods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts on cell surface markers (e.g., CD45, CD11b) for standardized immunophenotyping.
- Operational Value: Produces viable single-cell suspensions compatible with fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional or genomic analysis.
- Scalability: Leverages flow cytometry’s high throughput to process multiple tissue samples and conditions in parallel.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cell targeting data to preclinical validation via isolation of pure populations for gene expression or biochemical assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies which dissociation method preserves specific cell types (e.g., astrocytes, oligodendrocytes via enzymatic digestion; microglia/macrophages via homogenization), reducing ambiguity in target engagement studies.
- Disease Model Relevance: Applied to assess CNS cell populations in mouse models of neurodegenerative disease, supporting pharmacological or gene therapy evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing quantitative cellular data that informs early go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring the extent and specificity of CNS cell targeting following in vivo administration of therapeutic agents.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell suspensions with defined viability and composition, enabling reliable compound or vector screening.
- Analytics: Delivers multiparametric flow cytometry data (e.g., % viable cells, marker co-expression) that enables side-by-side comparison of dissociation methods and treatment conditions.
- Translational Research: Enables isolation of viable cell subtypes for downstream validation, such as RNA sequencing or functional assays, bridging discovery to preclinical mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunophenotyping platform applicable across multiple CNS disease models and therapeutic modalities (viral vectors, nanoparticles, small molecules).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation by providing quantitative, cell-type-specific data on therapeutic agent distribution.
- Operational Value: Standardizes tissue dissociation and immunophenotyping workflows, improving reproducibility across labs and studies.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling rapid method comparison and informed resource allocation to the most viable dissociation approach.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying which cell populations are accessible and viable under each preparation method.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design, compensation, and multicolor immunophenotyping (9-color bio-flow cytometry used in study).
- Depends on access to a neural tissue dissociation kit (Enzyme P, Buffer X, Enzyme A, Buffer Y) and equipment for gentle tissue dissociation (Dounce homogenizer, rocking incubator, centrifuge).
- Necessitates standardized debris removal steps (e.g., Percoll gradient centrifugation) to ensure sample purity and avoid myelin or debris interference in flow cytometry.
- Must account for method-specific trade-offs: homogenization yields higher total cells but lower viability (~10–14%), while enzymatic digestion preserves viability and enriches non-hematopoietic CNS cells.
- Limited to suspended cell analysis; not suitable for spatial or anatomical distribution studies due to tissue homogenization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Enzymatic Brain and Spinal Cord Digestion
3:58
Mechanical Brain and Spinal Cord Homogenization
5:00
Debris Removal
6:19
Flow Cytometric Cell Staining
7:48
Results: Representative Relative Proportions of Different Cell Types Retrieved from the CNS According to the Tissue Homogenization Method
9:38
Conclusion
