Name: Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji wielu typów komórek z mózgu i rdzenia kręgowego myszy. Technika ta umożliwia izolację populacji komórkowych w badaniach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez fundusze startowe Boston Children's Hospital dla A.B., grant ALSA nr 17-IIP-343 dla M.P., oraz Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Program Badań nad Stwardnieniem Zanikowym Bocznym pod Nagrodą nr W81XWH-17-1-0036 dla M.P. Dziękujemy DFCI Flow Cytometry Core za wsparcie techniczne.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Raka Dana Farber (numer protokołu 16-024).
1. Przygotowanie roztworów potrzebnych do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotuj 1x zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), rozcieńczając 10x HBSS sterylną wodą. Wstępnie schłodzić roztwór na lodzie. Na każdą próbkę potrzeba co najmniej 25 ml roztworu.</li>
	<li>Przygotować izotoniczny roztwór Percollu (IPS) mieszając 10x sterylny HBSS 1:10 z podłożem o gradiencie gęstości (tj. Percoll). Wstępne schładzanie na lodzie. 
	UWAGA: IPS może być przechowywany do 30 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór blokujący (BL) cytometrii przepływowej (FACS) (1% albumina surowicy bydlęcej [BSA], 5% płodowa surowica bydlęca [FBS] w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej [PBS]). Wstępnie schłodzić na lodzie.</li>
</ol>
2. Eutanazja zwierząt przez perfuzję wewnątrzsercową i rozwarstwienie tkanek
UWAGA: W eksperymentach wykorzystano ośmiotygodniowe myszy C57BL/6J, dowolnej płci. Perfuzja z roztworem PBS jest wykonywana w celu wyeliminowania zanieczyszczenia krwi z narządów, przed przystąpieniem do trawienia tkanek.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz za pomocą mieszaniny ketaminy/ksylazyny (90-200 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny). Połóż mysz na plecach i przyklej każdą kończynę do podpory. Sprawdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch odstawienia.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej na poziomie wlotu klatki piersiowej, aby odsłonić mostek. Użyj kleszczy, aby chwycić czubek mostka, a następnie wykonaj jedno 1 cm nacięcie z każdej strony klatki piersiowej. Na koniec przetnij przeponę i otwórz mostek na tyle szeroko, aby uwidocznić serce.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić serce za prawą komorę i unieś je do linii środkowej i lekko wysuń z klatki piersiowej.</li>
	<li>Włóż igłę motylkową 23 G do końcówki lewej komory, w kierunku aorty i mocno przytrzymaj.</li>
	<li>Rozpocznij perfuzję od 1x PBS. Przebij prawą małżowinę uszną za pomocą nożyczek, aby perfuzat mógł opuścić krążenie. Ustaw natężenie przepływu PBS na 3 ml/min. Perflikować co najmniej 15 ml 1x PBS, aby upewnić się, że tkanki są czyste. 
	UWAGA: Blanszowanie wątroby i krezkowych naczyń krwionośnych jest oznaką dobrej perfuzji. W razie potrzeby objętość prefuzji można zwiększyć do momentu, gdy płyn wychodzący z serca zostanie oczyszczony z krwi, w którym to momencie można zatrzymać linię płukania.</li>
	<li>Po perfuzji odetnij mózg od rdzenia kręgowego i usuń mózg z czaszki nożyczkami i kleszczami. Usuń sierść, aby zwiększyć widoczność i kontrolę podczas sekcji oraz uniknąć przenoszenia zanieczyszczeń włosów. Wypłukać rdzeń kręgowy z jego kolumny za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej PBS.</li>
	<li>Przenieś każdą tkankę do dołka na 6-dołkowej płytce wielodołkowej wypełnionej 2 ml lodowatego 1x HBSS i trzymaj na lodzie aż do strawienia.</li>
	<li>Podziel mózg i rdzeń kręgowy na dwie połowy, wzdłuż linii podłużnej. 
	UWAGA: Jedna połowa każdej tkanki jest homogenizowana (patrz sekcje poniżej), aby umożliwić analizy cytometryczne przepływowe; Drugą połowę można przypisać do innego przetwarzania w celu alternatywnych analiz (np. zanurzyć w roztworze utrwalającym paraformaldehyd do histologii).</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne mózgu i rdzenia kręgowego
UWAGA: Objętości opisane w tej sekcji wystarczają do strawienia połowy mózgu lub rdzenia kręgowego.
<ol>
	<li>Użyj nożyczek, aby zmielić tkanki na kawałki o grubości 1-2 mm.</li>
	<li>Odetnij końcówkę pipety o pojemności 1000 μl nożyczkami, aby była wystarczająco duża, aby umożliwić pobranie kawałków tkanki. Wstępnie przepłucz końcówkę pipety za pomocą 1x HBSS. Następnie za pomocą pipety przenieś 2 ml roztworu HBSS zawierającego tkankę mieloną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Wstępne płukanie końcówki pipety jest ważne, aby zapobiec lepieniu się kawałków tkanki wewnątrz końcówki.</li>
	<li>Przemyć studzienkę dodatkowymi 2 ml lodowatego 1x HBSS i przenieść roztwór do odpowiedniej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej kawałki tkanki.</li>
	<li>Odwirować każdą próbkę przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę enzymów 1 zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (NTDK; Tabela materiałów) mieszając 50 μl enzymu P z 1900 μl buforu X na próbkę. Ciepły roztwór enzymatyczny wymieszać 1 w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Inkubować mieszaninę enzymów 1 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut przed użyciem, aby umożliwić pełną aktywację enzymu.</li>
	<li>Odessać supernatant z probówki stożkowej o pojemności 15 ml i dodać 1,95 ml mieszanki enzymów 1 do każdej próbki. Delikatnie przekręć wir, aby upewnić się, że granulka została ponownie zawieszona.</li>
	<li>Próbki inkubować na kole lub wytrząsarce przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W międzyczasie przygotować mieszaninę enzymów 2 NTDK, mieszając 10 μl enzymu A z 20 μl buforu Y na próbkę; wstępnie ogrzać roztwór w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji z mieszaniną enzymów 1 dodać 30 μl mieszanki enzymów 2 do każdej próbki.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj próbki, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl, wstępnie przepłukanej 1x HBSS.</li>
	<li>Inkubować próbkę na kole lub wytrząsarce przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodaj 10 ml lodowatego 1x HBSS do każdej probówki, aby dezaktywować mieszankę enzymów 1 i mieszankę enzymów 2.</li>
	<li>Odwirować każdą próbkę przez 10 minut w temperaturze 320 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant; dodać lodowaty 1x HBSS do każdej probówki do końcowej objętości 7 ml i delikatnie zawiesić osad przez wirowanie.</li>
	<li>Przejdź do sekcji 5 w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
</ol>
4. Mechaniczna homogenizacja mózgu i rdzenia kręgowego
UWAGA: Objętości opisane w tej sekcji są wystarczające do homogenizacji połowy mózgu lub rdzenia kręgowego. Protokół opisany w tej sekcji może być używany jako metoda alternatywna do opisanej w sekcji 3, w zależności od potrzeb użytkownika, jak omówiono poniżej.
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić szklaną zaprawę młynka do tkanek Dounce (tabela materiałów) ustawionego na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 3 ml wstępnie schłodzonego 1x HBSS do moździerza.</li>
	<li>Przenieś tkankę (mózg lub rdzeń kręgowy) z dołka płytki 6-dołkowej do szklanej zaprawy, upewniając się, że jest zanurzona w 1x HBSS i znajduje się na dnie zaprawy.</li>
	<li>Delikatnie rozgnieć tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B. Przenieś homogenizowaną mieszankę do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Napełnić probówkę do końcowej objętości 10 ml za pomocą wstępnie schłodzonego 1x HBSS i wirować przez 10 minut przy 320 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać lodowaty 1x HBSS do każdej probówki do końcowej objętości 7 ml i delikatnie zawiesić osad przez wirowanie.</li>
	<li>Przejdź do sekcji 5 w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
</ol>
5. Usuwanie gruzu
UWAGA: Usuwanie zanieczyszczeń, składających się głównie z niestrawionej tkanki i osłonek mielinowych, jest kluczowym krokiem umożliwiającym efektywne barwienie homogenatu tkankowego do kolejnych analiz cytometrycznych przepływowych.
<ol>
	<li>Przefiltruj każdą próbkę przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie niestrawione kawałki tkanki. Ten etap jest szczególnie ważny zwłaszcza podczas pracy z tkankami rdzenia kręgowego, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że próbki te zawierają niestrawione fragmenty nerwowe lub opony mózgowe, które mogą wpływać na kolejne etapy.</li>
	<li>Upewnij się, że końcowa objętość wynosi 7 ml w każdej probówce na próbkę. Jeśli nie, napełnij lodowatym 1x HBSS do 7 ml.</li>
	<li>Dodać 3 ml wstępnie schłodzonego IPS do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 10 ml roztworu zawierającego pożywkę o gradiencie gęstości o 30% stężeniu końcowym. Delikatnie zmieszać próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 700 x g w temperaturze 18 °C, upewniając się, że przyspieszenie wirówki jest ustawione na 7, a hamulec na 0, 
	UWAGA: Wirowanie powinno trwać około 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie wyjąć próbki z wirówki. 
	UWAGA: Białawy krążek złożony z gruzków i mieliny powinien być widoczny unoszący się na powierzchni roztworu. Na dnie probówki powinna być widoczna osadka (zawierająca interesujące komórki).</li>
	<li>Ostrożnie zassać cały białawy krążek gruzu, a następnie resztę supernatantu, uważając, aby nie usunąć osadu. Pozostaw około 100 μl roztworu na wierzchu osadu komórkowego, aby uniknąć ryzyka jego przypadkowego przemieszczenia.</li>
	<li>Dodać 1 ml FACS BL, ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl i przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Delikatnie zassać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiednim buforze zgodnym z dalszymi analizami (patrz sekcja 6 dla protokołu stosowanego do oceny wielu typów komórek metodą cytometrii przepływowej).</li>
</ol>
6. Barwienie do oceny wielu typów komórek metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zawiesić osad otrzymany w kroku 5.9 za pomocą 350 μl FACS BL. Dodać blok Fc do każdej próbki w końcowym stężeniu 5 μg/mL. 
	UWAGA: Do jednego barwienia należy użyć co najmniej 100 μl próbki, aby upewnić się, że przetworzono wystarczającą liczbę komórek, aby umożliwić wiarygodne analizy.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do barwienia.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę przeciwciał zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Dodać mieszaninę przeciwciał do każdej probówki, wirować przez 5 s i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do każdej probówki, wirować i wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W międzyczasie należy przygotować mieszaninę streptawidyny zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w mieszaninie streptawidyny przygotowanej w kroku 6.6. Dla każdej próbki należy użyć tej samej objętości, która została użyta do barwienia w kroku 6.4.</li>
	<li>Wirować przez 5 s i inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do każdej probówki, wirować i wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w FACS BL. Użyć 300 μl FACS BL na każde 100 μl barwionej próbki.</li>
	<li>Dodać roztwór 7-amino-aktynomycyny D (7-AAD) do każdej próbki. Użyć 5 μl 7-AAD na każde 300 μl próbki przygotowanej w kroku 6.10.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy cytofluorymetrycznej. Wykonaj analizę w ciągu 16 godzin od przygotowania próbki, aby zagwarantować żywotność komórek na poziomie >60%.</li>
</ol>

<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).</li>
<li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li>
<li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li>
<li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li>
<li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).</li>
<li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li>
<li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia%2FMacrophages+in+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+%28S1R%29+agonist+PRE-084%2C+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid%3A+Brain+biodistribution%2C+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li>
<li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+ecto-5%27-nucleotidase%2FCD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit%3A+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule opisano protokół współoczyszczania i jednoczesnej analizy cytometrycznej przepływu niektórych z najważniejszych komórek OUN z mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Tradycyjnie, analizy histologiczne były stosowane w celu opisania rozmieszczenia nanocząstek lub skuteczności transdukcji wektorów wirusowych w OUN 5,13 lub w celu uzyskania wglądu w zmiany morfologiczne i molekularne zachodzące w określonych typach komórek podczas patologii lub leczen...

Technologie dostarczania genów i leków (takie jak wektory wirusowe i nanocząsteczki) stały się potężnym narzędziem, które można zastosować do uzyskania lepszego wglądu w specyficzne szlaki molekularne zmienione w chorobach neurodegeneracyjnych oraz do rozwoju innowacyjnych podejść terapeutycznych1,2,3. Optymalizacja tych narzędzi opiera się na ilościowym określeniu: (1) zakresu penetracji OUN przy różnych drogach podania oraz (2) ukierunkowania na określone populacje komórek. Analizy histologiczne są zwykle stosowane do wizualizacji fluorescencyjnych genów reporterowych lub fluorescencyjnie znakowanych nanocząstek w różnych obszarach OUN i w różnych typach komórek, identyfikowanych przez barwienie immunologiczne dla określonych markerów komórkowych4,5. Mimo że podejście to dostarcza cennych informacji na temat biodystrybucji podawanego genu lub narzędzi do dostarczania leków, technika ta może być czasochłonna i pracochłonna, ponieważ wymaga: (1) utrwalenia tkanek, kriokonserwacji lub zatapiania i krojenia parafiny; (2) barwienie w poszukiwaniu specyficznych markerów komórkowych, czasami wymagających pobrania antygenu; (3) akwizycja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która zwykle pozwala na analizę ograniczonej liczby różnych markerów w ramach tego samego eksperymentu; (4) przetwarzanie obrazu w celu umożliwienia właściwej kwantyfikacji sygnału będącego przedmiotem zainteresowania.
Cytometria przepływowa stała się powszechnie stosowaną techniką, która wykorzystuje bardzo specyficzne markery fluorescencyjne, aby umożliwić nie tylko szybką ilościową ocenę różnych fenotypów komórkowych w zawiesinach komórkowych, na podstawie ekspresji antygenów powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych, ale także pomiary funkcjonalne (np. szybkość apoptozy, proliferacji, analiza cyklu komórkowego, itp.). Możliwa jest również fizyczna izolacja komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie, co pozwala na dalsze zastosowania (np. hodowla komórkowa, sekwencja RNAseq, analizy biochemiczne itp.)6,7,8.
Homogenizacja tkanek jest krytycznym krokiem niezbędnym do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, co umożliwia wiarygodne i powtarzalne oceny cytometryczne przepływu. Opisano różne metody homogenizacji tkanki mózgowej u dorosłych, głównie w celu wyizolowania komórek mikrogleju9,10,11; można je ogólnie podzielić na dwie główne kategorie: (1) dysocjacja mechaniczna, która wykorzystuje siłę mielenia lub ścinania przez homogenizator Dounce (DH) w celu oderwania komórek od ich nisz i utworzenia stosunkowo zhomogenizowanej zawiesiny pojedynczej komórki, oraz (2) trawienie enzymatyczne, które polega na inkubacji fragmentów tkanki mielonej w temperaturze 37 °C w obecności enzymów proteolitycznych, takich jak trypsyna lub papaina, sprzyjając degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wytworzenia dość homogenizowanej zawiesiny komórkowej12.
Bez względu na to, która metoda zostanie zastosowana, po homogenizacji tkanek zaleca się etap oczyszczania w celu usunięcia mieliny poprzez wirowanie na gradiacji gęstości lub przez selekcję magnetyczną9,12, przed przejściem do dalszych zastosowań.
Tutaj opisujemy metodę przetwarzania tkanek opartą na trawieniu papainowym (PD), po którym następuje oczyszczanie na gradiencie gęstości, zoptymalizowaną pod kątem uzyskania żywotnych heterogenicznych zawiesin komórkowych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego w sposób wrażliwy na czas i odpowiedni do cytometrii przepływowej. Ponadto opisujemy 9-kolorowy panel cytometrii przepływowej i strategię bramkowania, którą przyjęliśmy w laboratorium, aby umożliwić jednoczesną dyskryminację różnych populacji OUN, żywych/martwych komórek lub dodatniego wyniku dla reporterów fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne lub barwnik rodaminy. Stosując tę analizę cytometrii przepływowej, możemy porównać różne metody przetwarzania tkanek, tj. PD i DH, pod względem zachowania żywotności komórek i wydajności różnych typów komórek.
Szczegóły, które tutaj dostarczamy, mogą pomóc w podjęciu decyzji o protokole homogenizacji i kombinacji przeciwciał do użycia w panelu cytometrii przepływowej, w oparciu o konkretny typ komórki (komórki) będący przedmiotem zainteresowania i dalsze analizy (np. aplikacje wrażliwe na temperaturę, śledzenie określonych markerów fluorescencyjnych, hodowla in vitro, analizy funkcjonalne).

<table><tbody><tr><td>10X HBSS (bez wapnia, chlorku magnezu i siarczanu magnezu)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>70 mm Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom ACSA/ACSA2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-535</td><td>APC sprzężona</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9647-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CD11b szczurze przeciwciało</td> <td>anty-mysieInvitrogen</td><td>47-0112-82</td><td>APC-eFluor 780 sprzężone</td></tr><tr><td>szczurze przeciwciało anty-mysie CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>562939</td><td>BV421 sprzężone</td></tr><tr><td>szczurze przeciwciało anty-mysie CD45</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td>Brilliant Violet 510 sprzężone</td></tr><tr><td>CD90.1/Thy1.1 szczurze przeciwciało anty-mysie</td><td>Biolegend</td><td>202518</td><td>PE/Cy7 sprzężone</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 szczurze przeciwciało</td> <td>anty-myszyProbówki</td><td></td> stożkowe <td>sprzężone Biolegend 1005325 PE/Cy7</td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Probówki</td> stożkowe CellTreat <td>229411</td><td></td></tr><tr><td>(50 ml)</td>Zestaw młynka do tkanek <td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Dounce (zawiera moździerz oraz tłuczki A i B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9063-1SET</td><td></td></tr><tr><td>Fc (CD16/CD32) Blokowe przeciwciało anty-mysie szczura</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>O4 przeciwciało przeciw myszy/szczurom/ludziom</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-895</td><td>Sprzężony z biotyną</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10266569</td><td>sprzedawany jako niesterylny odczynnik</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>65455529</td><td>odczynnik sterylny (do stosowania w zastosowaniach wymagających sterylności)</td></tr><tr>Odczynnik <td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>GE17-5445-01</td><td>zawierający bardzo mało śladowych ilości endotoksyny</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S3258</td><td>Alexa Fluor 680 sprzężony</td></tr></tbody></table>

jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Ostatnie postępy w dziedzinie wektorów wirusowych i nanomateriałów otworzyły drogę dla nowych, nowatorskich podejść do badania lub manipulowania ośrodkowym układem nerwowym (OUN). Jednak dalsza optymalizacja tych technologii przyniosłaby korzyści dzięki metodom umożliwiającym szybkie i sprawne określenie zakresu celowania w OUN i komórkę po podaniu wektorów wirusowych lub nanocząstek w organizmie. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje wysoką przepustowość i możliwości multipleksowania cytometrii przepływowej, aby umożliwić prostą kwantyfikację różnych podtypów komórek wyizolowanych z mózgu lub rdzenia kręgowego myszy, a mianowicie mikrogleju / makrofagów, limfocytów, astrocytów, oligodendrocytów, neuronów i komórek śródbłonka. Stosujemy to podejście, aby podkreślić krytyczne różnice między dwiema metodami homogenizacji tkanek pod względem wydajności, żywotności i składu komórek. Może to poinstruować użytkownika, aby wybrał najlepszą metodę w zależności od interesującego typu komórki i konkretnego zastosowania. Metoda ta nie nadaje się do analizy rozmieszczenia anatomicznego, ponieważ tkanka jest homogenizowana w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Pozwala jednak na pracę z żywotnymi komórkami i może być łączona z sortowaniem komórek, otwierając drogę do kilku zastosowań, które mogą rozszerzyć repertuar narzędzi w rękach neurobiologa, począwszy od ustanawiania kultur pierwotnych pochodzących z czystych populacji komórek, po analizy ekspresji genów i testy biochemiczne lub funkcjonalne na dobrze zdefiniowanych podtypach komórek w kontekście chorób neurodegeneracyjnych. po leczeniu farmakologicznym lub terapii genowej.

Porównaliśmy dwie różne metody homogenizacji (DH w porównaniu z PD) zastosowane do mózgu i rdzenia kręgowego myszy, aby przetestować wydajność w odzyskiwaniu różnych żywotnych typów komórek odpowiednich do dalszych zastosowań. W tym celu wykorzystaliśmy 9-kolorowy panel cytometrii przepływowej zaprojektowany do charakterystyki w jednej próbce różnych typów komórek OUN, w tym mikrogleju, limfocytów, neuronów, astrocytów, oligodendrocytów i śródbłonka.
Tkanki mózgu i rdzenia kręgowego pobrano od...

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Opracowanie selektywnych narzędzi do dostarczania genów i leków w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych wymaga kwantyfikacji i charakterystyki celowania w komórki, po ponownym podaniu, wektorów wirusowych lub nanocząstek. Mają przepustowość i możliwości multipleksowania cytometrii przepływowej, umożliwiają prostą i jednoczesną identyfikację wielu typów komórek z mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Procedurę zademonstruje Francisco Javier Molina Estevez, post-doc z Alexander's Laboratory.Po pobraniu mózgu i rdzenia kręgowego od ośmiotygodniowej myszy C57 Black 6, umieść tkanki w pojedynczych dołkach sześciodołkowej płytki, zawierającej dwa mililitry lodowatego HPSS na studzienkę na lodzie. Podziel każdą pobraną tkankę na dwie równe części. I użyj nożyczek, aby zmielić połowę każdej próbki tkanki na kawałki o grubości od jednego do dwóch milimetrów.Gdy wszystkie tkanki zostaną rozdrobnione, należy wstępnie wypłukać zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów w HPSS i użyć pipety do przeniesienia każdej zawiesiny tkanki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz studzienki dodatkowymi dwoma mililitrami HPSS na studzienkę. I wyciągnij pranie w odpowiednich stożkowych rurkach o pojemności 15 mililitrów.Osadzać próbki przez odwirowanie. I wymieszaj 50 mikrolitrów enzymu P z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych z 1 900 mikrolitrami buforu X z zestawu na próbkę. Podgrzej mieszaninę enzymów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.I odessać supernatant z każdej probówki do pobierania tkanek. Gdy mieszanina enzymów jest gotowa, dodaj 1,95 mililitra roztworu do każdej próbki. I delikatnie wiruj, aby ponownie zawiesić granulki.Następnie inkubować próbki na kole przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wymieszać 10 mikrolitrów enzymu A z 20 mikrolitrami buforu Y na próbkę. Wstępnie podgrzej drugi roztwór enzymu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 30 mikrolitrów roztworu do każdego roztworu tkankowego pod koniec inkubacji z wytrząsaniem. Użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, wstępnie przepłukanej HPSS, aby delikatnie wymieszać każdą próbkę.I włóż próbki do koła na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcje enzymatyczne za pomocą 10 mililitrów lodowatego HPSS. I osadzać próbki przez odwirowanie.Pod koniec wirowania ponownie zawiesić granulki w siedmiu mililitrach lodowatego HPSS na probówkę. I delikatnie zwiruj każdą próbkę, zanim przytrzymasz probówki na lodzie. W celu homogenizacji tkanek dodaj trzy mililitry wstępnie schłodzonego HPSS do wstępnie schłodzonej szklanej zaprawy młynka do tkanek i przenieś drugą połowę jednej z pobranych próbek tkanki mózgu lub rdzenia kręgowego do zaprawy.Delikatnie maceruj tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B. I przenieś homogenizowaną mieszaninę do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Napełnij probówkę do końcowej objętości 10 mililitrów wstępnie schłodzonym HPSS do odwirowania. I ponownie zawiesić granulat w siedmiu mililitrach świeżego HPSS z wirowaniem, przed trzymaniem próbki na lodzie.W celu usunięcia zanieczyszczeń dodać trzy mililitry wstępnie schłodzonego izotonicznego roztworu Percollu do każdej strawionej lub homogenizowanej próbki. I delikatnie zwirować próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane. Następnie odwirować próbki i ostrożnie usunąć białawy krążek zanieczyszczeń i mieliny unoszący się na powierzchni roztworu.Po wyrzuceniu zanieczyszczeń należy zebrać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki, nie naruszając granulek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze roztworu FACS BL w celu przeniesienia do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Po tej integracji z roztworem Percoll ważne jest, aby bardzo ostrożnie usunąć krążek zanieczyszczeń i supernatant bez usuwania osadu komórkowego, aby uniknąć utraty próbki.Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w 350 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę. W przypadku analizy cytometrycznej przepływowej izolowanych typów komórek, należy inkubować próbki z pięcioma mikrogramami na mililitr bloku FC na probówkę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed dodaniem odpowiedniego przeciwciała do każdej probówki zgodnie ze stałym protokołem przedstawionym w tabeli. Wiruj każdą probówkę przez pięć sekund, aby wymieszać.I umieść próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, chroniąc je przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki jednym mililitrem PBS na probówkę i odwirować. Ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości streptawidyny w każdej probówce.Po wirowaniu w celu wymieszania próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. I umyj komórki jednym mililitrem PBS na probówkę, jak pokazano. Po odrzuceniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach świeżego FACS BL na probówkę.I oznacz każdą próbkę pięcioma mikrolitrami 7-AAD. Następnie przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, do czasu analizy cytofluorometrycznej. Metoda homogenizacji daje wyższą wydajność komórek zarówno z mózgu, jak i rdzenia kręgowego, ale większość pobranych komórek jest zazwyczaj martwa, co powoduje, że tylko około 14% żywych komórek zostaje wyleczonych z mózgu i około 10% wyleczonych z rdzenia kręgowego.W przeciwieństwie do tego, metoda trawienia papainy skutkuje ogólnie lepszym zachowaniem żywotności komórek. Analiza zawiesin komórek mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą dziewięciokolorowej cytometrii dwuprzepływowej ujawnia obecność CD45 + CD11b + mikrogleju i makrofagów. I limfocyty CD45 + CD11b w obu tkankach.Populacje komórek CD45 można następnie rozróżnić według ich dodatniego wpływu na markery astrocytów lub oligodendrocytów lub ekspresję markerów powierzchni ferionalnej i śródbłonka. Stosując metodę homogenizacji, od 32 do 38% żywotnych komórek jest pochodzenia krwiotwórczego. Podczas gdy metoda trawienia enzymatycznego powoduje nabycie bardzo dużej frakcji niehematopoetycznych komórek CD45.Co ciekawe, CD45 + CD11b + mikroglej i makrofagi reprezentują najliczniejszą frakcję komórek żywotnych w metodzie homogenizacji. Metoda trawienia daje jednak bardziej niejednorodną reprezentację typów komórek, w tym astrocytów, oligodendrocytów, komórek śródbłonka i neuronów. Protokół ten jest wszechstronny i może być wykorzystany do kilku dalszych zastosowań, takich jak kwantyfikacja lub izolacja określonych subpopulacji komórek, hodowla pierwotna, analiza biochemiczna lub sekwencjonowanie RNA.Wdrożyliśmy ten protokół do oceny ekspresji genów i sygnatur funkcjonalnych różnych populacji OUN podczas tej progresji lub po leczeniu w mysim modelu endotroficznego stwardnienia bocznego.

simultaneous-flow-cytometric-characterization-multiple-cell-types

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Ilościowe określanie stanu zapalnego komórek w uszkodzonym lub patologicznie zmienionym OUN za pomocą cytometrii przepływowej jest utrudnione przez obecność resztek lipidowych i mielinowych, które mogą mieć rozmiar i ziarnistość zbliżoną do komórek, co obniża czułość i dokładność pomiarów. Opracowaliśmy metodę przygotowania komórek w celu usunięcia resztek mieliny i poprawy detekcji komórek za pomocą cytometrii przepływowej w uszkodzonym rdzeniu kręgowym.

Ilościowa ocena komórek odpornościowych w uszkodzonej tkance rdzenia kręgowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej: nowe zastosowanie metody oczyszczania komórek

Ten film pokazuje izolację wielu typów komórek z tkanki mózgowej myszy. Tkanka jest najpierw mechanicznie ścinana za pomocą młynka do tkanek w roztworze soli, aby utrzymać równowagę osmotyczną. Homogenat tkankowy jest następnie poddawany wirowaniu w gradiencie gęstości w celu usunięcia resztek komórkowych. Komórki są następnie ponownie zawieszane w roztworze w celu dalszej analizy.

Izolacja wielu typów komórek z mózgu myszy przez homogenizację mechaniczną

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza ilościowa zawartości komórek w mysim nerwie kulszowym jest trudna ze względu na niedostatek tkanki. Protokół ten opisuje metodę trawienia i przygotowania tkanek, która zapewnia wystarczającą ilość komórek do analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych z nerwów poszczególnych myszy.

Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy przy użyciu cytometrii przepływowej

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji wielu typów komórek z mózgu i rdzenia kręgowego myszy. Technika ta umożliwia izolację populacji komórkowych w badaniach neurodegeneracyjnych.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Przeglądaj więcej filmów