$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od umieszczenia elementów młynka do tkanek na lodzie. To urządzenie zawiera moździerz i dwa tłuczki o różnych średnicach.
Wlej schłodzony bufor soli do moździerza, a następnie dodaj tkankę mózgową myszy.
Bufor utrzymuje równowagę osmotyczną, zachowując strukturę i funkcję komórki.
Zmiel tkankę wieloma delikatnymi pociągnięciami za pomocą tłuczka o mniejszej średnicy, który mechanicznie ścina tkankę na mniejsze kawałki.
Następnie uderz tłuczkiem o większej średnicy, ułatwiając dalszy rozkład tkanki na komórki składowe.
Przenieś mieszaninę do probówki i odwiruj.
Usunąć supernatant.
Dodaj schłodzony bufor soli i wir, aby rozbić grudki komórek i mielinę.
Następnie dodaj pożywkę o gradiencie gęstości i odwiruj.
Ze względu na różnice w kształcie i masie komórki osiądą w dolnej warstwie, podczas gdy szczątki i mielina gromadzą się w górnej warstwie.
Odrzucić supernatant.
Dodać odpowiedni roztwór, aby uzyskać zawiesinę wielokomórkową do dalszego wykorzystania.
W celu homogenizacji tkanek dodaj 3 mililitry wstępnie schłodzonego HBSS do wstępnie schłodzonej szklanej zaprawy młynka do tkanek Dounce i przenieś połowę jednego z pobranych mózgów do moździerza. Delikatnie zmaceruj tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B i przenieś homogenizowaną mieszaninę do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Napełnij probówkę do końcowej objętości 10 mililitrów wstępnie schłodzonym HBSS do odwirowania i ponownie zawieś osad w 7 mililitrach świeżego HBSS z wirowaniem przed trzymaniem próbki na lodzie. W celu usunięcia zanieczyszczeń dodać 3 mililitry wstępnie schłodzonego roztworu izotonicznego do każdej strawionej lub homogenizowanej próbki i delikatnie zagrodzić próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane.
Następnie odwirować próbki i ostrożnie usunąć białawy krążek zanieczyszczeń i mieliny unoszący się na powierzchni roztworu. Po wyrzuceniu zanieczyszczeń należy zebrać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki, nie naruszając granulek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 1 mililitrze roztworu FACS/BL w celu przeniesienia do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówek
.
Po odwirowaniu z roztworem cząstek należy bardzo ostrożnie usunąć krążek zanieczyszczeń i supernatant, bez przemieszczania osadu komórkowego, aby uniknąć utraty próbki.
Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w 350 mikrolitrach świeżego FACS/BL na probówkę.