Name: Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Poznaj metody produkcji i krystalizacji domeny wiążącej IKK NEMO w celu określenia jej struktury. Protokół wykorzystuje adaptery helikalne do stabilizacji konformacji białka, co umożliwia badania strukturalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. D. Maddenowi za wiele pomocnych dyskusji podczas tego projektu. Dziękujemy prof. D. Bolonowi za dar plazmidu zawierającego zoptymalizowaną cewkę spiralną GCN4. Dziękujemy dr B. Guo za plazmidy NEMO. Dziękujemy Christinie R. Arnoldy, Tamar Basiashvili i Amy E. Kennedy za zademonstrowanie procedury. Dziękujemy BioMT Crystallography Core Facility oraz wydziałom Chemii oraz Biochemii i Biologii Komórki w Dartmouth za korzystanie ze sprzętu krystalograficznego oraz personelowi BioMT za ich wsparcie. W badaniach wykorzystano linię AMX National Synchrotron Light Source II, należącej do Biura Użytkowników Nauki Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) obsługiwanej dla Biura Nauki Departamentu Energii przez Brookhaven National Laboratory na podstawie umowy nr 1. DE-SC0012704. Dziękujemy pracownikom NSLS II za wsparcie. Praca ta została sfinansowana z grantów NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 i P20GM113132 oraz grantu Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

<ol><li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+NF-kappaB%3A+players%2C+pathways%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li>
<li>Bassères, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li>
<li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+and+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li>
<li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway%3A+implications+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK%2FNF-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).</li>
<li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+Years+of+NF-%CE%BAB%3A+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li>
<li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li>
<li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+NEMO%2FIKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li>
<li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO%3A+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK%CE%B2+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li>
<li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li>
<li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).</li>
<li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fv-clasp%3A+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility%2C+stability%2C+and+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li>
<li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coils%3A+The+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tagged-TEV+protease%3A+construction%2C+optimisation+of+production%2C+purification+and+test+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li>
<li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals%3A+Data+Collection+at+the+New+High-Flux%2C+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((phenix.mr_rosetta%3A+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li>
<li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTickle%2C+IJ+%22STARANISO%22">STARANISO</a>. , (2018).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+treatment+of+negative+intensity+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A%3A+Crystal+Physics%2C+Diffraction%2C+Theoretical+and+General+Crystallography%22%5BJournal%5D)">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li>
<li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+rational+protein+crystallization%3A+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I%CE%BAB+kinase+binding+domain+of+NF-%CE%BAB+essential+modulator+%28NEMO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li>
<li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+F%2C+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Próby krystalizacji NEMO w postaci niezwiązanej zakończyły się niepowodzeniem, w tym próby użycia białka o pełnej długości i kilku konstruktów skracających obejmujących domenę wiążącą IKK. Nasza biofizyczna charakterystyka domeny wiążącej IKK NEMO (reszty 44-111) za pomocą dichroizmu kołowego, spektroskopii NMR i anizotropii fluorescencji wykazała, że konstrukt, choć zdolny do wiązania IKKβ, istniał w stanie wymiany konformacyjnej, nienadającym się do krystalizacji 9,10<sup class="xref"...

Szlak NF-κB jest aktywowany w odpowiedzi na różne bodźce, w tym cytokiny, produkty mikrobiologiczne i stres, w celu regulacji ekspresji docelowych genów odpowiedzialnych za reakcję zapalną i immunologiczną, śmierć komórki lub przeżycie i proliferację1. Patologie, w tym choroby zapalne i autoimmunologiczne oraz nowotwory2,3,4,5 zostały skorelowane z hiperaktywacją szlaku, co sprawiło, że modulacja aktywności NF-κB stała się głównym celem dla rozwoju nowych terapii6,7.
Kanoniczny szlak NF-κB w szczególności różni się od szlaku niekanonicznego, odpowiedzialnego za limorganogenezę i aktywację komórek B, przez zależność tego pierwszego od białka rusztowania NEMO (niezbędny modulator NF-κB8) do składania kompleksu IKK z kinazami IKKα i IKKβ. Kompleks IKK jest odpowiedzialny za fosforylację IκBα (inhibitora κB), która kieruje go do degradacji, uwalniając dimery NF-κB do translokacji do jądra w celu transkrypcji genu1 i dlatego jest atrakcyjnym celem dla rozwoju inhibitorów modulujących aktywność NF-κB.
Nasze badania koncentrują się na charakterystyce interakcji białko-białko pomiędzy NEMO i IKKβ, celując w NEMO w celu opracowania małych cząsteczek inhibitorów tworzenia kompleksu IKK. Minimalna domena wiążąca NEMO, wymagana do wiązania IKKβ, obejmuje reszty 44-111, a jej struktura została określona w kompleksie z peptydem odpowiadającym sekwencji IKKβ 701-7459. NEMO i IKKβ tworzą wiązkę czterech helis, w której dimer NEMO mieści dwie helisy IKKβ (701-745) w wydłużonym otwartym rowku z rozszerzonym interfejsem interakcji. IKKβ(734-742), znana również jako domena wiążąca NEMO (NBD), określa najważniejszy gorący punkt wiązania, w którym dwa niezbędne tryptofany (739,741) zakopują się głęboko w kieszeni NEMO. Szczegóły złożonej struktury mogą pomóc w projektowaniu i optymalizacji inhibitorów małocząsteczkowych ukierunkowanych na NEMO. Jednocześnie trudno jest, aby wiązanie małej cząsteczki lub peptydu odtworzyło w NEMO pełną zmianę konformacyjną (tj. rozległe otwarcie dimera zwiniętej cewki NEMO) spowodowaną wiązaniem długiego IKKβ (701-745), jak obserwowano w krysztale, a struktura niezwiązanego NEMO lub NEMO związanego z inhibitorem małej cząsteczki może stanowić lepszy cel dla projektowania leków opartych na strukturze i optymalizacji inhibitorów.
Pełne konstrukcje NEMO i mniejsze konstrukcje obcinające obejmujące domenę wiążącą IKK okazały się trudne do określenia struktury w formie niezwiązanej za pomocą krystalografii rentgenowskiej i metod magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)10, co skłoniło nas do zaprojektowania ulepszonej wersji domeny wiążącej IKK NEMO. Rzeczywiście, NEMO (44-111) w postaci niezwiązanej jest tylko częściowo pofałdowany i ulega wymianie konformacyjnej, dlatego postanowiliśmy ustabilizować jego dimeryczną strukturę, fałd zwiniętego zwoju i stabilność, zachowując przy tym powinowactwo wiązania do IKKβ. Dołączając trzy heptady idealnych dimerycznych sekwencji zwiniętych cewek11 na końcach N i C białka oraz serię czterech mutacji punktowych, wygenerowaliśmy NEMO-EEAA, konstrukt w pełni dimeryczny i złożony w zwiniętą cewkę, który uratował powinowactwo wiązania IKK do zakresu nanomolowego, jak obserwowano dla pełnej długości NEMO12. Jako dodatkową zaletę mieliśmy nadzieję, że adaptery ze zwiniętą cewką (oparte na sekwencji GCN4) ułatwią krystalizację i ostatecznie pomogą w określeniu struktury promieniowania rentgenowskiego poprzez wymianę molekularną. Adaptery ze zwiniętymi cewkami zostały podobnie wykorzystane zarówno do zwiększenia stabilności, poprawy zachowania roztworu, jak i ułatwienia krystalizacji zwiniętych cewek trimerycznych i fragmentów przeciwciał13,14. NEMO-EEAA łatwo ulega ekspresji i oczyszczaniu z Escherichia. komórki coli z rozszczepialnym znacznikiem histydyny, są rozpuszczalne, złożone w stabilną dimeryczną zwiniętą cewkę i łatwo krystalizują, z dyfrakcją do 1,9 A. Obecność uporządkowanych regionów zwiniętych cewek GCN4 może dodatkowo pomóc w fazowaniu danych z kryształów NEMO-EEAA poprzez wymianę molekularną przy użyciu znanej struktury GCN415.
Biorąc pod uwagę wyniki uzyskane za pomocą apo-NEMO-EEAA, uważamy, że opisane tutaj protokoły mogą być również zastosowane do krystalizacji NEMO-EEAA w obecności małych peptydów (takich jak peptyd NBD) lub inhibitorów małych cząsteczek, w celu zrozumienia wymagań dotyczących inhibicji NEMO i optymalizacji opartej na strukturze początkowych inhibitorów ołowiu do wysokiego powinowactwa. Biorąc pod uwagę plastyczność i dynamiczną naturę wielu domen zwojów zwojów16, zastosowanie adapterów zwojów może znaleźć bardziej ogólne zastosowanie w określaniu struktury.

<table><tbody><tr><td>20% w/v &gamma;-PGA (forma Na+, LM)</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD2-100-150</td><td>Do drobnej krystalizacji przesiewowej NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>3,5 kDa MWCO Dializa</td><td>Membrane Spectra/Por</td><td>132724</td><td>Do dializy usuwania imidazolu</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Cell</td><td>Millipose Sigma</td><td>UFSC 05001</td><td>Do stężenia białka</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>Do minimalnego etykietowania nośników</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Millipore Sigma</td><td>9025-65-4</td><td>Do trawienia kwasu nukleinowego</td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Kompetentne komórki</td><td>Agilent Technologies</td><td>Model: 230245</td><td>Ekspresja TEV</td></tr><tr><td>CryoPro</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-073</td><td>Zestaw krioochrony</td></tr><tr><td>D-Glucose (dekstroza)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434</td><td>Do Minimalne etykietowanie nośników</td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>ThermoFisher</td><td>DF043817</td><td>Do wzrostu kultur</td></tr><tr><td>Dithiothreitol > 99%</td><td>Goldbio</td><td>DTT25</td><td>Do redukcji dwusiarczków</td></tr><tr><td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td><td>Novagen</td><td>71400-3</td><td>Ekspresja nieznakowanego NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>FORMULATOR</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Płynna obsługa/ producent sita</td></tr><tr><td>HCl i ndash; Roztwór 1,0 M</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-581</td><td>Do drobnej krystalizacji ekranu NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>Do oczyszczania z wykluczeniem wielkości</td></tr><tr><td>Kolumna HisTrap HP 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17524802</td><td>Do oczyszczania NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>96 MIDAS</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD1-59</td><td>Do badań przesiewowych z matrycą rzadką NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>HT 96 Morfealne</td><td>wymiary molekularne</td><td>MD1-46</td><td>Do badań przesiewowych NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>ThermoFisher</td><td>288-32-4</td><td>Do elucji z kolumny pułapki Hisa</td></tr><tr><td>Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd</td><td>Goldbio</td><td>I2481C5</td><td>Do indukcji kultur</td></tr><tr><td>Płytka krystalizacyjna MRC2</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-083</td><td>Płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>NT8 - Kroplówka</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Krystalizacja</td></tr><tr><td>pET-16b</td><td>Millipore Sigma</td><td>69662</td><td>Do klonowania NEMO-EOAA</td></tr><tr><td>pET-45b</td><td>Millipore Sigma</td><td>71327</td><td>Do klonowania NEMO-EOAA</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>ThermoFisher</td><td>36978</td><td>Do inhibicji proteaz</td></tr><tr><td>Butelka z poliwęglanu do stosowania w wirniku ultrawirówki Typ 45 Ti</td><td>Beckmann Coulter</td><td>339160</td><td>Butelka do ultrawirówki</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 20 000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-609</td><td>Do drobnej krystalizacji przesiewowej NEMO-EOAA</td></tr><tr><td>pRK793 (TEV)</td> <td>Addgene</td><td>Plasmid 8827</td><td>Do produkcji TEV</td></tr><tr><td>QuikChange XL II</td><td>Agilent Technologies</td><td>200522</td><td>Mutageneza ukierunkowana na miejsce</td></tr><tr><td>Wymagany montaż nasadki:</td><td>Zakrętka do butelki Beckmann Coulter 355623</td><td></td><td>Ultracenttrifuge</td></tr><tr><td>ROCK IMAGER</td> Zestaw kulek nasiennych <td>Formulatrix</td><td></td><td>Crystallization Imager</td></tr><tr><td></td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td>Wytwarzanie nasion</td></tr><tr><td>Chlorek sodu &ge; 99%</td> <td>miliporów Sigma</td><td>S9888</td><td>Do buforowania roztworów oczyszczających</td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek fosforyny tris (2-karboksyetylo))</td><td>Goldbio</td><td>Środek redukujący</td> <td>TCEP1</td></tr><tr><td>Ekran Berkeley</td><td>Rigaku</td><td>MD15-Berekely</td><td>Do badań przesiewowych NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Ekran PGA</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD1-50</td><td>Do drobnej krystalizacji ekranu NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Tris &ndash; 1,0 M Roztwór</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-589</td><td>Do drobnej krystalizacji NEMO-EEAA</td></tr><tr><td>Ultrapure Tris Buffer (proszek) format)</td><td>Thermofisher</td><td>15504020</td><td>Do buforowania roztworów oczyszczających</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td>Do denaturacji NEMO-EEAA</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej ikk nemo

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO jest białkiem rusztowania, które odgrywa istotną rolę w szlaku NF-κB poprzez składanie kompleksu IKK z kinazami IKKα i IKKβ. Po aktywacji kompleks IKK fosforyluje cząsteczki IκB, prowadząc do translokacji jądrowej NF-κB i aktywacji docelowych genów. Hamowanie interakcji NEMO/IKK jest atrakcyjnym paradygmatem terapeutycznym do modulacji aktywności szlaku NF-κB, co sprawia, że NEMO jest celem do projektowania i odkrywania inhibitorów. Aby ułatwić proces odkrywania i optymalizacji inhibitorów NEMO, opracowaliśmy ulepszoną konstrukcję domeny wiążącej IKK NEMO, która pozwoliłaby na określenie struktury białka w postaci apo i podczas wiązania z inhibitorami o małej masie cząsteczkowej. W tym miejscu przedstawiamy strategię zastosowaną do projektowania, wyrażania i charakterystyki strukturalnej domeny wiązania IKK w NEMO. Białko ulega ekspresji w komórkach E. coli, rozpuszczanych w warunkach denaturacji i oczyszczanych w trzech etapach chromatograficznych. Omawiamy protokoły otrzymywania kryształów do wyznaczania struktury oraz opisujemy strategie pozyskiwania i analizy danych. Protokoły znajdą szerokie zastosowanie w określaniu struktury kompleksów NEMO i inhibitorów małocząsteczkowych.

Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie domeny wiążącej IKK białka NEMO. 
Protokół zastosowany w niniejszym badaniu w celu uzyskania końcowej sekwencji NEMO-EEAA (Rycina 1A), która pozwoliła na otrzymanie kryształów o jakości dyfrakcyjnej, obejmował ekspresję i charakterystykę wszystkich konstruktów pośrednich, w tym dodanie adapterów typu coiled-coil na N- i/lub C-końcu, mutacje C76A, C95S oraz mutacje E56A, E57A. Rycina 1<stro...

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Protokół ten ułatwia pomyślne określenie struktury domeny wiązania IKK NEMO w jej niezwiązanej formie. Oraz szczegóły jego produkcji i krystalizacji. Protokół wykorzystuje tę stabilizację natywnego potwierdzenia fragmentu domeny wiążącej IKK NEMO, poprzez adaptery cewki spiralnej, które ułatwiają krystalizację i określenie struktury.Biologia strukturalna NEMO, jako celu, zapewnia ważną przewagę w rozwoju inhibitorów NEMO do leczenia chorób zapalnych i autoimmunologicznych oraz raka. Protokół ten może zostać rozszerzony na określanie struktury kompleksów NEMO, z peptydami lub inhibitorami małocząsteczkowymi w celu odkrywania lub optymalizacji leków. Ponowne fałdowanie i koncentracja białka na etapie produkcji białka mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania czystego dimeru NEMO.Ograniczenie agregacji i zapewnienie rozpuszczalności w warunkach krystalizacji. Procedury zademonstrują Tamar i Amy, doktorantki naszego laboratorium. Zacznij od dodania 20 mililitrów wspaniałego roztworu bulionu.I 20 mikrolitrów 100 miligramów na mililitr roztworu podstawowego ampicyliny. Do 125 mililitrowej kolby Erlenmeyera. Następnie kilka mikrolitrów zapasu glicerolu komórkowego, z przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza, BL21DE3 kompetentnych komórek.Przekształcone za pomocą wektora. Po wstrząśnięciu kulturą starterową przez noc, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obrotach na minutę, rozcieńczyć komórki do OD600 0,1 i 250 mililitrów wspaniałego bulionu. I dodaj ampicylinę do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr.Gdy OD600 w kulturze osiągnie 0,8 do 1, dodaj IPTG do hodowli, do stężenia 500 mikromolowych. I hoduj komórki przez cztery godziny, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż OD600 osiągnie od sześciu do 10. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie.I ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach buforu do lizy. Podziel ponownie zawieszone komórki na dwie podwielokrotności o pojemności od 20 do 25 mililitrów. I użyj prasy francuskiej, aby nałożyć około 25 000 funtów na cal kwadratowy nacisku na komórki, dwa do trzech razy na podwielokrotność, w zimnym pomieszczeniu.Następnie dodaj mocznik do lizatów komórkowych, do końcowego stężenia ośmiu molowych. I inkubuj roztwór komórkowy na platformie kołyszącej przez dwie do 16 godzin, w temperaturze pokojowej. Następnego ranka przenieś lizaty do probówek ultrawirówek, do co najmniej trzech czwartych napełnienia na probówkę.I odwirować lizaty przez 45 minut. Zdekantować supernatanty do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. I załadować supernatant inkubowany mocznikiem do kolumny IMAC w ilości trzech mililitrów na minutę.Gdy cały supernatant przepłynie przez kolumnę, przemyć kolumnę na 10 objętości kolumny, z buforem wiążącym, w ilości trzech mililitrów na minutę. I przeprowadzić elucję gradientową białka NEMO-EEAA od 10 do 500 milimolowych imidazolu, w 12-kolumnowym gradiencie objętościowym. Zbieranie jednomililitrowych porcji eluatu na płytkę do zbierania frakcji.Po analizie strony SDS wyciągnij frakcje zawierające czyste białko docelowe i zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda, zgodnie ze standardowym protokołem. Wybierz frakcje, które wymykają się, zawierające białko. Aby rozszczepić znacznik HIS6 i usunąć nadmiar imidazolu z próbki, należy dodać proteazę TEV w stosunku wagowym 1 do 10 rozszczepionego białka do docelowej próbki białka.I rozdylatuj próbkę przez noc w czterech litrach 20-milimolowego Tris. 150-milimolowego roztworu chlorku sodu i dwóch milimolowych roztworów DTT. Następnego ranka załaduj rozszczepioną przez TEV próbkę NEMO-EEAA do drugiej kolumny IMAC z prędkością jednego mililitra na minutę.Zbieranie przepływu w ułamkach mililitrowych, na talerzu zbiorczym frakcji 96 misek. Przemyć kolumnę pięcioma objętościami 20-milimolowego roztworu Tris, 150-milimolowego roztworu chlorku sodu i 10-milimolowego roztworu imidazolu w ilości jednego mililitra na minutę. Po ostatnim przemyciu wymyć TEV i rozszczepić HIS6 NEMO-EEAA, z trzema objętościami kolumn po 20 milimolowych Tris, 150 milimolowym chlorkiem sodu, 500 milimolowym imidazolem i dwumilimolowym roztworem DTT, do kolby o pojemności 50 mililitrów.Przeciągnąć przepływ przez frakcje, zawierające rozszczepiony konstrukt NEMO-EEAA i zagęścić próbkę za pomocą koncentratora z mieszanymi komórkami do pięciu mililitrów. Po całonocnej dializie, jak pokazano, załadować pięć mililitrów próbki na kolumny chromatograficzne wykluczające o wymiarach 16 milimetrów na 60 centymetrów. Powtarzanie w razie potrzeby, w zależności od objętości próbki.W jednym mililitrze na minutę i przy dwóch milimolowych Tris, 100 milimolowym roztworze chlorku sodu i dwóch milimolowym roztworze DDT. Po pobraniu frakcji, odpowiadających dimerycznej NEMO-EEAA, należy zagęścić próbkę w koncentratorze komórek z mieszadłem, z membraną odciętą o masie cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony, do końcowego stężenia 113 mikromolowych. Następnie podwielokrotnie białka do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.W przypadku przesiewania na rzadkiej matrycy dodaj 60 mikrolitrów rzadkiego roztworu matrycowego do każdego z 96 dołków dwukomorowej płytki krystalizacyjnej. Do dyfuzji pary typu sit and drop. I dodaj roztwór białka do zrobotyzowanego urządzenia do ustawiania kropli.Następnie użyj zrobotyzowanego urządzenia do ustawiania kropli, aby dozować 100 nanolitrów roztworu białkowego w ilości 1,65 miligrama na mililitr, w stosunku jeden do jednego z roztworem zbiornikowym w pierwszej kropli, do końcowej objętości 200 nanolitrów. I dodaj 66 nanolitrów roztworu białkowego ze 134 nanolitrami roztworu rezerwuarowego, do końcowej objętości 200 nanolitrów w drugiej kropli. Następnie natychmiast uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą o szerokości trzech cali.Następnie przechowuj tace w magazynie imagera krystalizacyjnego w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Sprawdzanie obrazów zebranych automatycznie pod kątem obecności kryształów, rozpoczynające się dwa dni po przechowywaniu płytek. W celu wytworzenia materiału siewnego przenieś całą kroplę zawierającą interesujący nas kryształ do 50 mikrolitrów roztworu warunkującego krystalizację w dostarczonej fiolce z zestawu do generowania nasion.I wiruj wywar siewny, z 20 sekundami pulsowania i 10 sekundami odpoczynku, przez trzy minuty. Następnie seryjnie rozcieńczać materiał siewny, w odstępach od jednego do 10 000, do 1 do 10 000. I przechowuj rozcieńczenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do dalszego użycia.Jeden do dwóch dni przed wysyłką do synchrotronu, odetnij taśmę od góry studni z interesującym Cię kryształem. I dodaj 0,5 mikrolitra roztworu krystalizacyjnego zawierającego 12% jeden, dwa propan, DiO krioprotektantant, bezpośrednio do studni. Delikatnie usuń kryształ za pomocą pętli kriogenicznej.Zapętlić kryształ ze studni i przechowywać kryształ zawierający pętlę kriogeniczną w krążku zanurzonym w ciekłym azocie, do czasu wysyłki w celu dyfrakcji rentgenowskiej. Po otrzymaniu danych dyfrakcji rentgenowskiej przetwarzaj skalowane intensywności na serwerze STAR i ISO. Stosując średnią odcięcia krystalografii rentgenowskiej wynoszącą 1,2 dla powierzchni granicznej dyfrakcji dla danych.I załaduj do Phoenixa. Aby określić strukturę, użyj struktury rentgenowskiej GCN4 jako modelu wyszukiwania wymiany molekularnej, używając MRage w Phoenix. Struktura 4DMD zostanie zdefiniowana jako zespół.A rozwiązanie MRage z powodzeniem zbuduje się w części strukturalnej, odpowiadającej adapterowi cewki zwijanej z końcówką końcową NEMO-EEAA. do modelu wyszukiwania, dla obu łańcuchów w ściemniaczu. Nadekspresja białka pojawia się w paśmie, przy markerze masy cząsteczkowej około 14 kilodaltonów, przed pierwszym oczyszczeniem kolumny IMAC.I wyświetla pasmo monomeru i pasmo dimerów, odpowiednio na 14 i 28 kilodaltonów po pierwszej elucji. Rozszczepienie TEV jest praktycznie całkowite, po elucji, przez drugą kolumnę IMAC. Prawie całkowicie jako dimer, o oczekiwanej masie cząsteczkowej.Chromatografia wykluczania wielkości wyświetla pojedynczy pik, wymykający się od 60 do 65 mililitrów, którzy reagują na dimer. W wyniku dokładnego przesiewania powstają kryształy, które można wykorzystać do produkcji materiału siewnego do produkcji kryształów NEMO-EEAA w celu gromadzenia danych. Tutaj pokazane są reprezentatywne profile dyfrakcyjne kryształów NEMO-EEAA.Analiza strukturalna białka NEMO-EEAA ujawnia homodimeryczną, nieregularną, równoległą cewkę zwijaną o długości około 175 angstremów. Regularny obszar cewki zwijanej obejmuje idealną sekwencję adaptera cewki zwijanej na końcu końcowym. I pierwsze dwie siedmiopiersie właściwej sekwencji NEMO.Zwykła cewka zwinięta jest również obecna na końcu C. Począwszy od pozostałości NEMO 97 i obejmując zacisk C, idealny adapter cewki zwijanej. Struktura związana z IKK beta wyświetla bardziej otwarte potwierdzenie cewki zwijanej, aby pomieścić ligand.Z większymi odstępami międzyspiralnymi o jeden do 2,2 angstremów w tym regionie. Struktura liganda w NEMO oferuje nowy cel dla projektowania inhibitorów za pomocą metod obliczeniowych. A także do wizualnego badania przesiewowego kieszeni wiążących z bibliotekami małych cząsteczek.Mamy teraz ścieżkę krystalizacji zmodyfikowanego konstruktu NEMO w kompleksie z ligandami drobnocząsteczkowymi. Aby pomóc w opracowaniu i optymalizacji nowej klasy inhibitorów.

production-crystallization-structure-determination-ikk-binding-domain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy implementację strategii REPLACE do celowania w interakcje białko-białko. REPLACE to iteracyjna strategia obejmująca podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu przekształcenia zoptymalizowanych inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków.

Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Kinaza IκB 1/α (IKK1/α CHUK) to kinaza białkowa Ser/Thr, która bierze udział w niezliczonych aktywnościach komórkowych, głównie poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB. W tym miejscu opisujemy główne etapy niezbędne do produkcji i określenia struktury krystalicznej tego białka.

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

Opisujemy metody charakterystyki pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie, w tym konwencjonalne i konfokalne obrazowanie za pomocą mikroskopii żywych komórek, skaningową mikroskopię elektronową i wiązanie lipidów oparte na NMR.

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

W tym artykule opisujemy protokoły ekspresji, oczyszczania, krystalizacji i określania struktury N-końcowej domeny receptora ryanodine z diamentowej (Plutella xylostella).

Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Poznaj metody produkcji i krystalizacji domeny wiążącej IKK NEMO w celu określenia jej struktury. Protokół wykorzystuje adaptery helikalne do stabilizacji konformacji białka, co umożliwia badania strukturalne.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Przeglądaj więcej filmów