Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Protokół ten ułatwia pomyślne określenie struktury domeny wiązania IKK NEMO w jej niezwiązanej formie. Oraz szczegóły jego produkcji i krystalizacji. Protokół wykorzystuje tę stabilizację natywnego potwierdzenia fragmentu domeny wiążącej IKK NEMO, poprzez adaptery cewki spiralnej, które ułatwiają krystalizację i określenie struktury.

Biologia strukturalna NEMO, jako celu, zapewnia ważną przewagę w rozwoju inhibitorów NEMO do leczenia chorób zapalnych i autoimmunologicznych oraz raka. Protokół ten może zostać rozszerzony na określanie struktury kompleksów NEMO, z peptydami lub inhibitorami małocząsteczkowymi w celu odkrywania lub optymalizacji leków. Ponowne fałdowanie i koncentracja białka na etapie produkcji białka mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania czystego dimeru NEMO.

Ograniczenie agregacji i zapewnienie rozpuszczalności w warunkach krystalizacji. Procedury zademonstrują Tamar i Amy, doktorantki naszego laboratorium. Zacznij od dodania 20 mililitrów wspaniałego roztworu bulionu.

I 20 mikrolitrów 100 miligramów na mililitr roztworu podstawowego ampicyliny. Do 125 mililitrowej kolby Erlenmeyera. Następnie kilka mikrolitrów zapasu glicerolu komórkowego, z przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza, BL21DE3 kompetentnych komórek.

Przekształcone za pomocą wektora. Po wstrząśnięciu kulturą starterową przez noc, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obrotach na minutę, rozcieńczyć komórki do OD600 0,1 i 250 mililitrów wspaniałego bulionu. I dodaj ampicylinę do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr.

Gdy OD600 w kulturze osiągnie 0,8 do 1, dodaj IPTG do hodowli, do stężenia 500 mikromolowych. I hoduj komórki przez cztery godziny, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż OD600 osiągnie od sześciu do 10. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie.

I ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach buforu do lizy. Podziel ponownie zawieszone komórki na dwie podwielokrotności o pojemności od 20 do 25 mililitrów. I użyj prasy francuskiej, aby nałożyć około 25 000 funtów na cal kwadratowy nacisku na komórki, dwa do trzech razy na podwielokrotność, w zimnym pomieszczeniu.

Następnie dodaj mocznik do lizatów komórkowych, do końcowego stężenia ośmiu molowych. I inkubuj roztwór komórkowy na platformie kołyszącej przez dwie do 16 godzin, w temperaturze pokojowej. Następnego ranka przenieś lizaty do probówek ultrawirówek, do co najmniej trzech czwartych napełnienia na probówkę.

I odwirować lizaty przez 45 minut. Zdekantować supernatanty do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. I załadować supernatant inkubowany mocznikiem do kolumny IMAC w ilości trzech mililitrów na minutę.

Gdy cały supernatant przepłynie przez kolumnę, przemyć kolumnę na 10 objętości kolumny, z buforem wiążącym, w ilości trzech mililitrów na minutę. I przeprowadzić elucję gradientową białka NEMO-EEAA od 10 do 500 milimolowych imidazolu, w 12-kolumnowym gradiencie objętościowym. Zbieranie jednomililitrowych porcji eluatu na płytkę do zbierania frakcji.

Po analizie strony SDS wyciągnij frakcje zawierające czyste białko docelowe i zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda, zgodnie ze standardowym protokołem. Wybierz frakcje, które wymykają się, zawierające białko. Aby rozszczepić znacznik HIS6 i usunąć nadmiar imidazolu z próbki, należy dodać proteazę TEV w stosunku wagowym 1 do 10 rozszczepionego białka do docelowej próbki białka.

I rozdylatuj próbkę przez noc w czterech litrach 20-milimolowego Tris. 150-milimolowego roztworu chlorku sodu i dwóch milimolowych roztworów DTT. Następnego ranka załaduj rozszczepioną przez TEV próbkę NEMO-EEAA do drugiej kolumny IMAC z prędkością jednego mililitra na minutę.

Zbieranie przepływu w ułamkach mililitrowych, na talerzu zbiorczym frakcji 96 misek. Przemyć kolumnę pięcioma objętościami 20-milimolowego roztworu Tris, 150-milimolowego roztworu chlorku sodu i 10-milimolowego roztworu imidazolu w ilości jednego mililitra na minutę. Po ostatnim przemyciu wymyć TEV i rozszczepić HIS6 NEMO-EEAA, z trzema objętościami kolumn po 20 milimolowych Tris, 150 milimolowym chlorkiem sodu, 500 milimolowym imidazolem i dwumilimolowym roztworem DTT, do kolby o pojemności 50 mililitrów.

Przeciągnąć przepływ przez frakcje, zawierające rozszczepiony konstrukt NEMO-EEAA i zagęścić próbkę za pomocą koncentratora z mieszanymi komórkami do pięciu mililitrów. Po całonocnej dializie, jak pokazano, załadować pięć mililitrów próbki na kolumny chromatograficzne wykluczające o wymiarach 16 milimetrów na 60 centymetrów. Powtarzanie w razie potrzeby, w zależności od objętości próbki.

W jednym mililitrze na minutę i przy dwóch milimolowych Tris, 100 milimolowym roztworze chlorku sodu i dwóch milimolowym roztworze DDT. Po pobraniu frakcji, odpowiadających dimerycznej NEMO-EEAA, należy zagęścić próbkę w koncentratorze komórek z mieszadłem, z membraną odciętą o masie cząsteczkowej wynoszącą trzy kilodaltony, do końcowego stężenia 113 mikromolowych. Następnie podwielokrotnie białka do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.

W przypadku przesiewania na rzadkiej matrycy dodaj 60 mikrolitrów rzadkiego roztworu matrycowego do każdego z 96 dołków dwukomorowej płytki krystalizacyjnej. Do dyfuzji pary typu sit and drop. I dodaj roztwór białka do zrobotyzowanego urządzenia do ustawiania kropli.

Następnie użyj zrobotyzowanego urządzenia do ustawiania kropli, aby dozować 100 nanolitrów roztworu białkowego w ilości 1,65 miligrama na mililitr, w stosunku jeden do jednego z roztworem zbiornikowym w pierwszej kropli, do końcowej objętości 200 nanolitrów. I dodaj 66 nanolitrów roztworu białkowego ze 134 nanolitrami roztworu rezerwuarowego, do końcowej objętości 200 nanolitrów w drugiej kropli. Następnie natychmiast uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą o szerokości trzech cali.

Następnie przechowuj tace w magazynie imagera krystalizacyjnego w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Sprawdzanie obrazów zebranych automatycznie pod kątem obecności kryształów, rozpoczynające się dwa dni po przechowywaniu płytek. W celu wytworzenia materiału siewnego przenieś całą kroplę zawierającą interesujący nas kryształ do 50 mikrolitrów roztworu warunkującego krystalizację w dostarczonej fiolce z zestawu do generowania nasion.

I wiruj wywar siewny, z 20 sekundami pulsowania i 10 sekundami odpoczynku, przez trzy minuty. Następnie seryjnie rozcieńczać materiał siewny, w odstępach od jednego do 10 000, do 1 do 10 000. I przechowuj rozcieńczenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż do dalszego użycia.

Jeden do dwóch dni przed wysyłką do synchrotronu, odetnij taśmę od góry studni z interesującym Cię kryształem. I dodaj 0,5 mikrolitra roztworu krystalizacyjnego zawierającego 12% jeden, dwa propan, DiO krioprotektantant, bezpośrednio do studni. Delikatnie usuń kryształ za pomocą pętli kriogenicznej.

Zapętlić kryształ ze studni i przechowywać kryształ zawierający pętlę kriogeniczną w krążku zanurzonym w ciekłym azocie, do czasu wysyłki w celu dyfrakcji rentgenowskiej. Po otrzymaniu danych dyfrakcji rentgenowskiej przetwarzaj skalowane intensywności na serwerze STAR i ISO. Stosując średnią odcięcia krystalografii rentgenowskiej wynoszącą 1,2 dla powierzchni granicznej dyfrakcji dla danych.

I załaduj do Phoenixa. Aby określić strukturę, użyj struktury rentgenowskiej GCN4 jako modelu wyszukiwania wymiany molekularnej, używając MRage w Phoenix. Struktura 4DMD zostanie zdefiniowana jako zespół.

A rozwiązanie MRage z powodzeniem zbuduje się w części strukturalnej, odpowiadającej adapterowi cewki zwijanej z końcówką końcową NEMO-EEAA. do modelu wyszukiwania, dla obu łańcuchów w ściemniaczu. Nadekspresja białka pojawia się w paśmie, przy markerze masy cząsteczkowej około 14 kilodaltonów, przed pierwszym oczyszczeniem kolumny IMAC.

I wyświetla pasmo monomeru i pasmo dimerów, odpowiednio na 14 i 28 kilodaltonów po pierwszej elucji. Rozszczepienie TEV jest praktycznie całkowite, po elucji, przez drugą kolumnę IMAC. Prawie całkowicie jako dimer, o oczekiwanej masie cząsteczkowej.

Chromatografia wykluczania wielkości wyświetla pojedynczy pik, wymykający się od 60 do 65 mililitrów, którzy reagują na dimer. W wyniku dokładnego przesiewania powstają kryształy, które można wykorzystać do produkcji materiału siewnego do produkcji kryształów NEMO-EEAA w celu gromadzenia danych. Tutaj pokazane są reprezentatywne profile dyfrakcyjne kryształów NEMO-EEAA.

Analiza strukturalna białka NEMO-EEAA ujawnia homodimeryczną, nieregularną, równoległą cewkę zwijaną o długości około 175 angstremów. Regularny obszar cewki zwijanej obejmuje idealną sekwencję adaptera cewki zwijanej na końcu końcowym. I pierwsze dwie siedmiopiersie właściwej sekwencji NEMO.

Zwykła cewka zwinięta jest również obecna na końcu C. Począwszy od pozostałości NEMO 97 i obejmując zacisk C, idealny adapter cewki zwijanej. Struktura związana z IKK beta wyświetla bardziej otwarte potwierdzenie cewki zwijanej, aby pomieścić ligand.

Z większymi odstępami międzyspiralnymi o jeden do 2,2 angstremów w tym regionie. Struktura liganda w NEMO oferuje nowy cel dla projektowania inhibitorów za pomocą metod obliczeniowych. A także do wizualnego badania przesiewowego kieszeni wiążących z bibliotekami małych cząsteczek.

Mamy teraz ścieżkę krystalizacji zmodyfikowanego konstruktu NEMO w kompleksie z ligandami drobnocząsteczkowymi. Aby pomóc w opracowaniu i optymalizacji nowej klasy inhibitorów.