Name: Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Naucz się metody mikrosiewu do hodowli wysokiej jakości kryształów rekombinowanej metaloproteazy PPEP-1 z Clostridium difficile. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie kryształów nadających się do analizy dyfrakcyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy personelowi linii badawczej X06DA w Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Szwajcaria za wsparcie podczas zbierania danych synchrotronowych. Jesteśmy wdzięczni Monice Gompert za doskonałe wsparcie techniczne. Projekt był wspierany przez Uniwersytet w Kolonii i grant INST 216/682-1 FUGG od Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych. Stypendium doktoranckie z International Graduate School in Development, Health and Disease dla C.P. jest potwierdzone. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o dofinansowanie nr 283570 (BioStruct-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krystalografia rentgenowska pozostaje najszybszą i najdokładniejszą metodą wyznaczania struktur białek o niemal atomowej rozdzielczości trójwymiarowej28. Wymaga ona jednak wyhodowania dobrze uporządkowanych monokryształów. Są one często trudne do uzyskania, a stan krystaliczny jest sztuczny. Niemniej jednak porównanie struktur białek wyznaczonych za pomocą krystalografii rentgenowskiej z tymi wyznaczonymi innymi metodami, zwłaszcza NMR, wykazuje zazwyczaj bardzo dobrą zgodność. W przypadku PPEP-1 niedawno opub...

Clostridium difficile jest jedną z głównych przyczyn szpitalnych zakażeń biegunką związaną z antybiotykami1. Ta Gram-dodatnia bakteria beztlenowa jest przenoszona przez formę przetrwalników drogą fekalno-oralną. W ciągu ostatniej dekady nowe szczepy "epidemiczne" lub "hiperwirulentne" (np. BI/NAP1/027) spowodowały drastyczny wzrost liczby nowych zakażeń i śmiertelności w Ameryce Północnej i Europie2. Choroba związana z C. difficile (CDAD) jest zagrażającym życiu zapaleniem jelita grubego o wysokiej śmiertelności3. Objawy wahają się od biegunki4 do rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego5 i często śmiertelnej toksycznej okrężnicy6.
Leczenie CDAD jest trudne, ponieważ zjadliwe szczepy są wielolekooporne, a częstość nawrotów jest wysoka7. W chwili obecnej terapia obejmuje antybiotyki metronidazol, fidaksomycynę lub wankomycynę, a w powtarzających się przypadkach przeszczep mikrobioty kałowej. Pilnie potrzebne są nowe strategie terapeutyczne8. Odnotowuje się pewien postęp, ponieważ terapeutyczne przeciwciało monoklonalne Bezlotoxumab, skierowane przeciwko toksynie C. difficile B9, niedawno pomyślnie przeszło badania kliniczne III fazy i zostało złożone w celu uzyskania zgody FDA i EMA. Dodatkowo, nowe antybiotyki są obecnie testowane na różnych etapach badań klinicznych10.
Aby opracować skuteczne leczenie, muszą zostać zidentyfikowane nowe cele terapeutyczne. Niedawno odkryta proteaza C. difficile endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1; CD2830/ZMP1; E.C. 3.4.24.89) jest tak obiecującym celem, ponieważ brak PPEP-1 w szczepie knock-out zmniejsza zjadliwość C. difficile in vivo11. PPEP-1 jest wydzielaną metaloproteazą12,13 rozszczepiającą dwie adhezyny C. difficile na ich C-końcu13, uwalniając w ten sposób przylegające bakterie z ludzkiego nabłonka jelitowego. Dlatego bierze udział w utrzymaniu równowagi między fenotypem siedzącym i ruchliwym C. difficila. Aby opracować selektywne inhibitory przeciwko PPEP-1 i zrozumieć, w jaki sposób rozpoznaje on swoje substraty, niezbędna jest dogłębna wiedza na temat jego trójwymiarowej struktury. Rozwiązaliśmy pierwszą strukturę krystaliczną PPEP-1 samodzielnie i w kompleksie za pomocą peptydu substratowego14. PPEP-1 jest pierwszą znaną proteazą, która selektywnie rozszczepia wiązania peptydowe między dwiema resztami proliny15. Wiąże substrat w sposób podwójnie zagięty i stabilizuje go poprzez rozszerzoną alifatyczno-aromatyczną sieć reszt zlokalizowanych w pętli S, która pokrywa miejsce aktywne proteazy14. Ten tryb wiązania substratu jest unikalny dla PPEP-1 i do tej pory nie znaleziono go w ludzkich proteazach. To sprawia, że jest to obiecujący cel dla leków, a niezamierzone efekty inhibitorów są bardzo mało prawdopodobne.
Aby w przyszłości opracować i przebadać selektywne inhibitory PPEP-1, potrzebna jest duża ilość czystego i monodyspersyjnego białka PPEP-1. Ponadto, aby określić sposób wiązania pierwszych inhibitorów, konieczne będzie określenie struktur kokrystalicznych z PPEP-1. W naszych rękach PPEP-1 stale wytwarza przerośnięte kryształy. W związku z tym opracowaliśmy procedurę optymalizacyjną do produkcji pojedynczych kryształów PPEP-1 o jakości dyfrakcyjnej. W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy wytwarzanie, oczyszczanie, krystalizację i strukturę roztworu PPEP-114. Używamy wewnątrzkomórkowej ekspresji w Escherichia coli wariantu PPEP-1 bez sekwencji sygnału wydzielania, chromatografii powinowactwa i chromatografii wykluczania wielkości z usunięciem znacznika oczyszczania, a następnie mikrosiewu16 do ekranu optymalizacyjnego i określenia struktury za pomocą anomalnej dyspersji o pojedynczej długości fali (-SAD)17. Protokół ten można dostosować do produkcji i określania struktury innych białek (np. metaloproteaz), a w szczególności do białek wytwarzających przerośnięte kryształy. Na życzenie można dostarczyć plazmidowe DNA konstruktu (pET28a-NHis-rPPEP-1) oraz dane dyfrakcyjne do celów edukacyjnych.

<table><tbody><tr><td>Geny / Wektory / szczepy komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a wektor</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Zakrzep rozszczepialny N-końcowy His-tag</td></tr><tr><td>E. coli szczep BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> Gen zoptymalizowany pod kątem kodonów z <td>niedoborem RNazy H</td></tr><tr><td>(dla E. coli) PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>niestandardowe</td><td>aminokwasy 27-220</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwpieniący B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>wodno-silikonowa emulsja</td></tr><tr><td>Agar</td><td>z</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyną</td><td>według</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Klasa buforu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>dowolna</td><td></td><td>klasa buforu</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Klasa buforowa</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan amonu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 100%</td><td></td><td></td> dowolny <td>najczystszy gatunek</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Płyn </td> azot <td>dowolny</td><td></td><td>do przechowywania i kriochłodzenia kryształów</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Uwagi</silny></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt (ogólny)</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>o</td><td></td><td>temperaturze 20 &deg; C - 37 & C</td></tr><tr><td>Naczynia szklane</td><td>dowolne</td><td></td><td>kolby Erlenmeyera z przegrodami (50 ml - 2,8 l)</td></tr><tr><td>Wirówka do dużych objętości kultur</td><td>dowolna</td><td></td><td>wirówka do objętości przetwarzania do 12 l</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>lub dowolny inny sonikator / zakłócacz komórek</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Dowolna</td><td></td><td>wirówka zapewnia prędkość do 150 000 x g</td></tr><tr><td>Żywica NiNTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pusta szklana kolumna ekonomiczna</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>lub dowolna inna pusta szklana lub plastikowa</td></tr><tr><td>kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>System chromatograficzny i Auml; kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>lub dowolny inny system chromatograficzny</td></tr><tr><td>Rurki do dializy Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięcia węży do dializy</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki ultrafiltracji (koncentratory) 10 000 NWCO</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr UV-Vis</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Sprzęt (krystalografia)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta o małej objętości 0,1-10 i mikro; l</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta wyporowa Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Robot do krystalizacji</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka krystalizacyjna TTP IQ z trzema dołkami białkowymi</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>lub dowolna inna 96-dołkowa płytka krystalizacyjna&nbsp;</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka CombiClover Junior Jena</td><td>Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniająca</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe ze szkła silikonowanego</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjne ekrany krystalizacji: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>różnorodne</td><td></td></tr><tr><td>komercyjne ekrany krystalizacji: Czarodziej, PACT++, JCSG++Jena</td> <td>Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Koraliki do nasion</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (nylonowe pętelki)</td><td>Hampton Research</td><td>różne</td><td>rozmiary pętli 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>Fiolka CrystalCap</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Pianka kriogeniczna Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Pianka kriogeniczna Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk do fiolek, prosty</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetyczny, prosty</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Uchwyt na fiolki</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Koder kolorów - biały</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prosty mikrokleszcz</td><td>dowolny</td><td></td><td>do manipulacji taśmą uszczelniającą. etc.</td></tr><tr><td>Igła do akupunktury</td><td>dowolna</td><td></td><td>np. z apteki</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>dowolny</td><td></td><td>do inspekcji płytek krystalizacyjnych i montażu kryształowego, powiększenie do 160X</td></tr></tbody></table>

produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury c. difficile ppep-1 metodą mikrosiewu i-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Potrzebne są nowe terapie do leczenia zakażeń Clostridium difficile, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Metaloproteaza C. difficile PPEP-1 jest celem dla przyszłych prac nad inhibitorami zmniejszającymi zjadliwość patogenu. Do przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej i strukturalnej, a także badań przesiewowych inhibitorów, potrzebne będą duże ilości czystego i aktywnego białka. Opracowaliśmy protokół wydajnej produkcji i oczyszczania PPEP-1 poprzez wykorzystanie E. coli jako gospodarza ekspresji, dającego wystarczające ilości i czystość białka do krystalizacji i określenia struktury. Dodatkowo, za pomocą mikrosiewu, silnie przerośnięte kryształy PPEP-1 mogą być hodowane do dobrze uporządkowanych kryształów odpowiednich do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Metody te mogą być również wykorzystane do produkcji innych rekombinowanych białek oraz do badania struktur innych białek wytwarzających przerośnięte kryształy.

rPPEP-1 ulega nadekspresji w kilku szczepach E. coli, z najwyższą wydajnością w E. coli BL21 (DE3) Star (Rysunek 1C). Po pierwszym etapie chromatografii powinowactwa NiNTA znacznik 6xHhis można z powodzeniem odciąć od większości białka, a w drugim etapie NiNTA niestrawione białko można całkowicie oddzielić od białka trawionego trombiną (ryc. 1D). Na nieoznakowanej kolumnie S200 16/600 rPPEP-1 migruje jako monomer z okazjonalnym frontem, ...

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Ogólnym celem tej procedury jest wydajny wzrost pojedynczych kryształów o jakości dyfrakcji sieciowej rekombinowanego białka endopeptydazy proliny proliny lub rPPEP-1. Bez tej metody rPPEP-1 natychmiast wytwarza silnie przerośnięte kryształy, które nie nadają się do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba dobrze uporządkowanych i dobrze dyfrakcjonujących kryształów do oznaczania strukturalnego rPPEP-1 może być wyprodukowana w krótkim czasie i przy ograniczonym wkładzie materiałowym.Procedura ta wykorzystuje metodę mikromiasta i może być dostosowana do każdego udanego warunku początkowej krystalizacji rPPEP-1, a także jego substratowych kompleksów peptydowych. Metodę tę można dostosować do produkcji dobrze uporządkowanych kryształów praktycznie każdego białka, które daje przerośnięte kryształy. Może być również stosowany w eksperymentach z siewem krzyżowym, wariancji białek lub w eksperymentach kokrystalizacji małych cząsteczek.Wizualna demonstracja obsługi metod krystalizacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ nawet niewielkie różnice mogą mieć znaczący wpływ na jakość dyfrakcyjną kryształów. Przeprowadzanie prób krystalizacji w formacie si

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Źródło: Figueroa, D. M., et.al. Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje produkcję sferoplastów Escherichia coli poprzez najpierw hamowanie podziału komórki w celu wywołania filamentacji, a następnie enzymatyczne trawienie ściany komórkowej. Proces obejmuje kontrolowane dodawanie czynnika chelatującego, DNazy i stabilizatora osmotycznego, aby zapewnić prawidłowe...

Przygotowanie sferoplastów E. coli

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Naucz się metody mikrosiewu do hodowli wysokiej jakości kryształów rekombinowanej metaloproteazy PPEP-1 z Clostridium difficile. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie kryształów nadających się do analizy dyfrakcyjnej.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Przeglądaj więcej filmów