Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Ogólnym celem tej procedury jest wydajny wzrost pojedynczych kryształów o jakości dyfrakcji sieciowej rekombinowanego białka endopeptydazy proliny proliny lub rPPEP-1. Bez tej metody rPPEP-1 natychmiast wytwarza silnie przerośnięte kryształy, które nie nadają się do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba dobrze uporządkowanych i dobrze dyfrakcjonujących kryształów do oznaczania strukturalnego rPPEP-1 może być wyprodukowana w krótkim czasie i przy ograniczonym wkładzie materiałowym.

Procedura ta wykorzystuje metodę mikromiasta i może być dostosowana do każdego udanego warunku początkowej krystalizacji rPPEP-1, a także jego substratowych kompleksów peptydowych. Metodę tę można dostosować do produkcji dobrze uporządkowanych kryształów praktycznie każdego białka, które daje przerośnięte kryształy. Może być również stosowany w eksperymentach z siewem krzyżowym, wariancji białek lub w eksperymentach kokrystalizacji małych cząsteczek.

Wizualna demonstracja obsługi metod krystalizacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ nawet niewielkie różnice mogą mieć znaczący wpływ na jakość dyfrakcyjną kryształów. Przeprowadzanie prób krystalizacji w formacie siedzącej kropli przy użyciu standardowych dostępnych na rynku ekranów i robota krystalizacyjnego. Najpierw skoncentruj oczyszczone białko do 12 miligramów na mililitr za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji w odstępach pięciominutowych w temperaturze 4000 razy g i czterech stopniach Celsjusza.

Mieszaj białko po każdym interwale, aby zapobiec wytrącaniu się i pogorszeniu. Określ stężenie białka w 280 nanometrach, używając współczynnika ekstynkcji 25 900 na centymetr molowy. Po wyrównaniu białka do 20 stopni Celsjusza usuń wszystkie cząstki i kurz przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 16000 razy g i 20 stopni Celsjusza.

Do wykonywania przesiewów krystalicznych należy użyć wstępnie napełnionych płytek krystalizacyjnych, szczelnie zamkniętych i przechowywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas ustawiania prób pracuj szybko, ponieważ małe objętości szybko wysychają. Jeśli to możliwe, użyj również komory wilgotnościowej wokół doku robota.

Po wyrównaniu wszystkich płytek krystalizacyjnych do 20 stopni Celsjusza, ustaw sito, pipetując zbiornik białka entu do podstudzienek od dwóch do czterech. Użyj kropli o objętości 300 nanolitrów. Użyj proporcji białka do zbiornika 200:100 dla poddołka drugiego, 150:150 dla poddołka trzeciego i 100:200 dla poddołka czwartego.

Natychmiast zamknij płytkę i umieść ją w komorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Sprawdzaj tace po ustawieniu codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie przeprowadzaj cotygodniową kontrolę. W celu kokrystalizacji kompleksów peptydów substratowych rPPEP-1, wymieszaj rPPEP-1 w ilości 24 miligramów na mililitr w stosunku 1:1 z siedmiokrotnym nadmiarem molowym roztworu peptydu, odłóż liofilizowany proszek rozpuszczony w soli fizjologicznej buforowanej tris.

Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza usuń wszystkie cząstki i kurz przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 16000 razy g i 20 stopni Celsjusza. Przystąpić do krystalizacji przy użyciu tej samej procedury mikrosiewu, co w przypadku niezwiązanego białka rPPEP-1. Silnie przerośnięte kryształy rPPEP-1 pojawiły się po dwóch dniach w stanie zawierającym 2,4 molowego dwuzasadowego fosforanu amonu i 0,1 molowego trisapsealu o pH 8,5.

Aby zoptymalizować warunki początkowe, użyj oprogramowania do obliczenia objętości i schematu pipetowania, aby uzyskać dwa mililitry każdego warunku, co pozwala na 10 ekranów optymalizacji. Warunki obejmują 1,8 do 2,55 molowego fosforanu amonu dwuzasadowego w krokach co 0,15 mola, a także 0,1 molowego trisapsealu pH 7,5 do 9,0 w krokach co 0,5 jednostki pH. Przygotuj siatkę zawierającą 24 warunki z roztworów podstawowych.

Użyj schematu pipetowania, aby skomponować poszczególne warunki. Pobrać pipety z 200 mikrolitrów każdego roztworu sita siatkowego do dołków 24-dołkowej płytki i wyrównać płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Ręcznie ustaw płytkę krystalizacyjną.

Użyj objętości kropli wynoszącej trzy mikrolitry i stosunku białka do zbiornika 2:1, 1,5:1:5 i 1:2. W tym przypadku należy użyć pipety wyporowej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Natychmiast uszczelnij płytę.

Następnie umieść płytkę w komorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po jednym do czterech dni pojawiają się silnie przerośnięte kryształy rPPEP-1 w czterech warunkach zawierających 2,55 molowego dwuzasadowego fosforanu amonu i 0,1 molowego trisapsealu o pH od 7,5 do 9,0, podczas gdy w pozostałych 20 warunkach nie powstają żadne kryształy. Przeprowadzić procedurę mikrosiewu, aby uzyskać monokryształy rPPEP-1 w tych warunkach.

Aby przygotować bulion z mikronasion, najpierw wybierz pojedynczy przerośnięty kryształ z jednego z udanych warunków. Następnie przenieś 50 mikrolitrów odpowiedniego roztworu macierzystego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej mały, wysoce wypolerowany szklany koralik i jeden mikrolitr roztworu macierzystego na szkiełko podstawowe. Za pomocą zamontowanego nylonowego smaru wyłowić kryształ i przenieść go do kropli na szkiełku podstawowym.

Następnie przenieś ciecz zawierającą kryształ do probówki i wiruj z dużą prędkością przez 30 sekund, upewniając się, że szklany koralik wiruje. Rozcieńczyć materiał siewny w stosunku 1:1000 do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej ten sam świeżo przygotowany stan i dokładnie mieszać przez pięć sekund. Następnie usuń uszczelkę płytki, pokrywając 20 warunków przezroczystymi kroplami.

Odpipetować 0,5 mikrolitra materiału siewnego do dołków. Uszczelnij płytkę i umieść ją w komorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po zastosowaniu tej techniki mikrosiewu monokryształy o wysokiej jakości dyfrakcji pojawiają się od kilku godzin do kilku dni po ustawieniu w różnych warunkach, zawierające od 1,8 do 2,4 molowego fosforanu amonu i 0,1 molowego trisu pH od 7,5 do dziewięciu.

Kryształy osiągają wielkość od 100 do 200 mikronów w największym wymiarze. Wybierz optymalny rozmiar nylonowej pętli dla maksymalnej długości wybranych kryształów, umieszczając pętlę na taśmie uszczelniającej tuż nad kryształem i skupiając się w górę iw dół. Typowy najdłuższy dostęp kryształów rPPEP-1 wynosi około 100 do 200 mikronów.

Przygotuj również odpowiednią kriokondycję. Napełnij dewersy piany ciekłym azotem. Następnie załaduj zacisk fiolki fiolką i wstępnie schłodzić go w wypełnionym ciekłym azotem 800-mililitrowym zbiorniku piankowym

Umieść uchwyt kriokanu oznaczony odpowiednim identyfikatorem i kriorękawem w dwulitrowym zbiorniku piankowym wypełnionym ciekłym azotem. Następnie załaduj różdżkę magnetyczną zamontowaną nylonową pętlą o odpowiednim rozmiarze. Następnie rozetnij taśmę uszczelniającą na płytce krystalizacyjnej ostrym skalpelem i usuń ją kleszczami.

Odpipetować jeden mikrolitr kriowaru na szkiełko podstawowe. Na tym etapie szczególnie ważna jest szybka praca, ponieważ wysuszenie kryształu lub niewielka objętość krioroztworu w pętli może prowadzić do wahań jakości kryształów lub nawet całkowitej utraty dyfrakcji. Wszystkie etapy manipulacji kryształami powinny być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym.

Jeśli kryształ przyklei się do plastikowej powierzchni, odłącz go od podłoża, deformując otaczający plastik za pomocą igły do akupunktury. Usuń kryształ z kropli, wyławiając go za pomocą zamontowanej nylonowej pętli. Szybko przenieś kryształ do kropli kriowarystanu i pozwól mu się zrównoważyć przez jedną sekundę.

Następnie wyłowić kryształ z kropli za pomocą zamontowanej nylonowej pętli tak szybko, jak to możliwe. Natychmiast zanurz wydobyty kryształ w ciekłym azocie. Gdy ciekły azot wokół zamontowanej pętli przestanie wrzeć, umieść pętlę w fiolce.

Umieścić fiolkę na uchwycie kriokanu. Po załadowaniu do uchwytu sześciu fiolek należy umieścić rękaw kriogeniczny wokół uchwytu. Przechowuj kryształy w zbiorniku wypełnionym ciekłym azotem do czasu użycia.

Aby przeprowadzić zbieranie danych, ostrożnie wyjmij zamontowany kryształ z kriokanu za pomocą zacisku i przechowuj go w piance do transportu. Przesuń ogranicznik wiązki i detektor do pozycji parkowania i przesuń kriodyszę o kilka milimetrów w górę. Zamontuj podstawę kriocapa na głowicy goniometru, przytrzymując podstawę palcami, jednocześnie szybko wyjmując fiolkę.

Następnie przesuń kriodyszę i ogranicznik wiązki z powrotem na miejsce i wyśrodkuj kryształ. Przez cały czas należy uważać, aby nie dotknąć ogranicznika wiązki lub detektora. Kontynuuj zbieranie zestawu danych 180 stopni z kątem oscylacji 0,1 stopnia, jak pokazano tutaj.

Pokazano tutaj silnie przerośnięte kryształy rPPEP-1 uzyskane ze wstępnego badania przesiewowego przy użyciu komercyjnych ekranów krystalizacji w 1,4 cytrynianu sodu trójzasadowego, 0,1 mola sodu HEPES, pH 7,5. Pokazano tutaj kryształy uzyskane ze wstępnego badania przesiewowego z tacydynamem 60% objętości do objętości, pH 7,0, 0,1 mola propanu BIS-TRIS, pH 7,0. Kryształy pojawiły się również w dwuzasadowym fosforanie amonu o masie 2,4 mola, trisie 0,1 molowym, pH 8,5.

Po zastosowaniu procedury optymalizacji mikrosiewu, monokryształy zostały zawarte w kilku warunkach, w tym 2,1 molowego fosforanu amonu dwuzasadowego, 0,1 molowego tris, pH 8 i 2,25 molowego fosforanu amonu dwuzasadowego, 0,1 molowego trisa, pH 8. Kryształy zamontowane w nylonowych pętlach mają wielkość od 100 do 200 mikronów i po oględzinach mikroskopowych wydają się mieć pojedynczą siatkę. Analiza dyfrakcji rentgenowskiej pokazuje, że kryształy te rzeczywiście wykazują pojedynczą sieć i załamują promienie rentgenowskie do rozdzielczości bliskiej atomom.

Rozwiązanie struktury krystalicznej rekombinowanego kompleksu peptydów substratowych PPEP-1 daje wgląd w sposób wiązania substratu przez PPEP-1. Peptyd substratowy może dyfundować do grupy wiążącej substrat PPEP-1 w jego otwartym potwierdzeniu. Następnie, gdy nastąpiłoby zamknięcie pętli, substrat oddziałuje z PPEP-1 poprzez wiązania wodorowe i unikalną alifatyczno-aromatyczną sieć łańcucha bocznego znajdującą się na pętli S.

Substrat wiąże się w unikalnej podwójnie zagiętej konformacji z załamaniami na wiązaniu peptydowym skwierczącym i wiązaniu peptydowym P2 prime do P3 prime. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać pojedyncze kryształy dyfrakcyjne rekombinowanego PPEP-1 do badań strukturalnych. Podobne podejścia można zastosować w przypadku innych białek, uzyskując silnie przerośnięte kryształy i dalej zróżnicowaną temperaturę inkubacji oraz rozcieńczenie C-stocku.

Ze względu na swoją wszechstronność i proste zastosowanie, ta prosta technika powinna być wypróbowana w każdym procesie optymalizacji kryształów.