Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

Celem tej procedury jest dostarczenie wskazówek dotyczących produkcji, krystalizacji i oznaczania strukturalnego ludzkiego IKK1-alfa w celu zrozumienia mechanistycznych podstaw jego funkcji sygnalizacyjnej i ustanowienia platform do racjonalnego projektowania leków. Metoda ta powinna pomóc naukowcom w określeniu struktury IKK1, co dostarczyłoby odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji immunologicznej. Technika ta opisuje uproszczoną ścieżkę do uzyskania kryształów białek IKK, które są raczej oporne na krystalizację i dostarczają różnych krytycznych informacji w pokonywaniu wąskich gardeł w określaniu struktur.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ generowanie miligramowych ilości rozpuszczalnego, dobrze zachowującego się białka wymaga jego ekspresji w komórkach owadów, a krystalizację można przeprowadzić tylko w bardzo wąskim oknie warunków. Procedura substytucji molekularnej stosowana do określania struktury IKK1 może być również bardzo trudna, zwłaszcza ze względu na słabą zdolność odchylania kryształów, a nie w miejscu jednostki asymetrycznej zawierającej wiele cząsteczek IKK1 przy braku odpowiednich modeli wyszukiwania. Procedury zademonstrują Kyle Shumate i Sonjiala Hotchkiss, studenci z mojego laboratorium.

Pierwszego dnia umieść komórki Sf9 w dwóch mililitrach pożywki z komórek owadów Sf903 w każdym dołku sześciodołkowej płytki i inkubuj w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Przepuszczaj komórki, gdy osiągną gęstość od dwóch do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr w zawiesinie, rozcieńczając ją do świeżych pożywek, o gęstości około sześć razy 10 do pięciu. Drugiego dnia rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji Sf9 w 100 mikrolitrach SF-903 lub pożywki dla owadów Grace's.

Następnie krótko zmieszaj mieszaninę. W oddzielnej probówce rozcieńczyć jeden mikrogram rekombinowanego bakmidu oczyszczonego z zestawu w 100 mikrolitrach tego samego podłoża. Połączyć rozcieńczone DNA i odczynnik do transfekcji.

Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut usuń pożywkę z dołka. Następnie dodaj jeden mililitr świeżego podłoża. Następnie dodaj rozcieńczoną mieszaninę odczynników do transfekcji DNA kroplami na komórki, dostosowując wielkość kropli tak, aby nie usuwała przylegających komórek.

Po sześciu godzinach dodaj 1,5 mililitra świeżej pożywki na wierzch komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza, sprawdzając studzienki okresowo co 12 godzin pod kątem oznak infekcji wirusowej. Piątego dnia usuń pożywkę zawierającą komórki, 60 do 72 godzin po zakażeniu.

Po przeniesieniu pożywki do probówek wirować przez pięć minut w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu zapisz supernatant, który jest stosem wirusa P1. Pierwszego dnia należy ponownie zawiesić wcześniej przygotowane osady ogniw His-IKK1 w 40 mililitrach buforu do lizy.

Umieść zawiesinę komórek na lodzie i poddaj je lizie za pomocą sonikacji w 60% do 70% cyklach pracy i pięciu do 10 impulsach o czasie trwania 30 sekund w odstępie dłuższym niż jedna minuta. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze większej lub równej 28 000 g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu żywicy agarozowej niklowo-NTA, zgodnie z protokołem tekstowym, wymyj znakowane przez Hisa białko alfa IKK1 pod przepływem grawitacyjnym przy użyciu 20 mililitrów buforu elucyjnego.

Zbierz od jednej do 1,5 mililitra frakcji. Po połączeniu frakcji zawierających białko należy trawić próbkę z proteazą TEV przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rankiem drugiego dnia inkubować białko z jednym milimolem ATP w obecności chlorku magnezu, beta-glicerofosforanu, fluorku sodu i ortowanadanu sodu przez jedną godzinę w temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przefiltruj roztwór białka przez filtr 0,45 mikrona. Następnie załadować około sześciu mililitrów próbki do 120-mililitrowej kolumny preparatywnej wykluczającej wielkość, podłączonej do zautomatyzowanego systemu chromatografii cieczowej. Po zrównoważeniu przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę i zebrać frakcje dwumililitrowe.

Podczas biegu monitoruj elucję przy 280 i 254 nanometrach. Po wyciągnięciu czystych frakcji należy skoncentrować w 30-kilodaltonowym koncentratorze odśrodkowym o odciętej masie cząsteczkowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dozować 25-mikrolitrowe porcje skoncentrowanego białka i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.

Za pomocą robota odpipetuj od 80 do 100 mikrolitrów odczynnika do krystalizacji do zbiornika 96-dołkowej płytki. Za pomocą robota krystalizacyjnego dozować i mieszać od 0,2 do 0,25 mikrolitra IKK1 i jego kompleksu inhibitorowego z tą samą objętością roztworu zbiornikowego. Natychmiast po ustawieniu kropli należy uszczelnić każdą płytkę optycznie przezroczystymi foliami, aby uniknąć parowania.

Inkubować jedną płytkę w temperaturze 18 stopni Celsjusza, a drugą płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w chłodnym pomieszczeniu. Użyj mikroskopu stereoskopowego z polaryzatorem, aby sprawdzić, czy kryształ pojawia się w każdej kropli, codziennie przez pierwsze siedem dni, a następnie w dłuższych odstępach czasu. Po przygotowaniu IKK1 i jego kompleksu inhibitorów, jak opisano wcześniej, przenieś roztwory studzienek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.

Umieść od jednego do 1,5 mikrolitra roztworu studzienki na czystym szklanym szkiełku nakrywkowym. Dodać równą objętość IKK1 i jego kompleksu inhibitorów do szklanego szkiełka nakrywkowego i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy. Po nałożeniu smaru na pierścienie każdego dołka płytki, odwróć szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na odpowiednim dołku za pomocą kleszczy.

Następnie uszczelnij studzienkę, dociskając szklane szkiełko nakrywkowe. Po ustawieniu wszystkich kropli na płytce 24-dołkowej inkubować w chłodni, w ciemności. Od czasu do czasu sprawdzaj krople pod mikroskopem pod kątem wyglądu i wzrostu kryształów.

Po zakończeniu wzrostu kryształów delikatnie usuń szklane szkiełko nakrywkowe zawierające kryształ i umieść je na twardej powierzchni kroplą kryształu skierowaną do góry. Delikatnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu kriogenicznego A na wierzch kropli i delikatnie wymieszaj, pipetując, aby kryształ nie został dotknięty. Za pomocą mikroskopu powoli usuń trochę płynu z kryształu i zachowaj około pięciu do ośmiu mikrolitrów roztworu.

Delikatnie dodaj 2,5 do czterech mikrolitrów roztworu kriogenicznego B na kroplę i delikatnie wymieszaj, pipetując. Przykryj szklane szkiełko nakrywkowe małą szalką Petriego, aby uniknąć bezpośredniego przepływu powietrza nad kryształem. Po odczekaniu pięciu minut ostrożnie wybierz pojedynczy kryształ z kropli w odpowiednim krioloopie zamontowanym na odpowiedniej podstawie.

Błyskawicznie zamroź kryształ w ciekłym azocie. Następnie przechowuj kryształ zawierający krioloop w krążku zanurzonym w ciekłym azocie w kolbie Dewara, aż będzie gotowy do dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w synchrotronie. Po szeroko zakrojonych próbach z kilkoma różnymi wariantami IKK1 otrzymano kryształy z jednym skróconym konstruktem, który wykazywał odpowiednie właściwości rentgenowskie tylko w obecności inhibitora IKK XII.

Łączny efekt danych rentgenowskich o niskiej rozdzielczości i słabym natężeniu, dużej liczby cząsteczek IKK1 w jednostce asymetrycznej i zmienności konformacyjnej modelu monomeryczno-dimerycznego IKK1, w porównaniu ze znanymi modelami IKK2, utrudnił uzyskanie molekularnego roztworu zastępczego IKK1 i określenie jego struktury. Różne struktury IKK2 wskazywały na różną orientację między monomerami w dimerach, tak że odległość między atomami węgla alfa P578 w dwóch domenach kinazy, w czterech różnych modelach dimerów, wahała się od 39 do 61 angstremów. Uzyskanie użytecznego modelu wyszukiwania było możliwe dzięki mapie mikroskopii krioelektronowej o niskiej rozdzielczości oraz bardzo dokładnemu modelowi domen IKK1, który można było wygenerować w oparciu o strukturę IKK2 o wysokiej rozdzielczości.

Początkowy model wskazywał na orientację domeny kinazy obróconą o 24 stopnie w stosunku do monomeru IKK2 i N-końcowy otwór 58 angstremów. Używając jako modelu jednego z dimerów z otworem 52 angstremów, zlokalizowano sześć dimerów w jednostce asymetrycznej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku miesięcy, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że uzyskanie rozpuszczalnego, aktywnego i dobrze zachowującego się białka jest pierwszym krytycznym krokiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre ogólne zrozumienie wszystkich kroków, które należy wykonać w najdrobniejszych szczegółach, aby odnieść sukces w krystalizacji i określeniu struktury białka IKK1. Poznając tę procedurę, nadal istnieją struktury innych białek z rodziny IKK, które można również określić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sygnalizacji kinaza-mitogen.