Name: Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj metodę produkcji i krystalizacji ludzkiej kinazy IKK1/α w celu określenia jej struktury. Technika ta umożliwia zrozumienie mechanizmów sygnałowych i wspiera racjonalny projektowanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy personelowi linii badawczych 19ID, 24ID i 13ID w Advanced Photon Source, Lemont, IL, za wsparcie podczas zbierania danych o różnych kryształach. Jesteśmy wdzięczni Dmitrijowi Lyumkisowi z Salk Institute za dostarczenie nam mapy krio-EM o niskiej rozdzielczości na wczesnych etapach budowy mapy/modelu EM, która została wykorzystana do zbudowania wstępnego modelu poszukiwania substytucji molekularnej IKK1. Badania, które doprowadziły do tych wyników, otrzymały finansowanie z grantów NIH AI064326, CA141722 i GM071862 dla GG. SP jest obecnie członkiem Wellcome Trust DBT India Intermediate Fellow.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Wytwarzanie, krystalizacja i struktura roztworu dwóch pokrewnych białek IKK Postanowiliśmy określić strukturę krystaliczną promieniowania rentgenowskiego IKK1 / α z założeniem, że będzie to stosunkowo proste ćwiczenie, biorąc pod uwagę nasze doświadczenie w produkcji białka IKK2 / β, krystalizacji i określaniu struktury. Byliśmy jednak bardzo zaskoczeni, że te dwa spokrewnione białka zachowywały się zupełnie inaczej pod względem łatwości krystalizacji. Pomimo wysiłków kilku renomowanych laboratoriów...

Aktywność transkrypcyjna rodziny dimerycznych czynników transkrypcyjnych NF-κB jest niezbędna do różnych funkcji komórkowych, począwszy od stanu zapalnego i odporności, a skończywszy na przetrwaniu i śmierci. Czynności te są ściśle kontrolowane w komórkach, a utrata regulacji prowadzi do różnych stanów patologicznych, w tym zaburzeń autoimmunologicznych i raka1,2,3. W przypadku braku bodźca, aktywność NF-κB jest hamowana przez białka IκB (Inhibitor -κB)4. Fosforylacja specyficznych reszt Ser na białkach IκB oznacza je pod kątem ubikwitynacji, a następnie degradacji proteasomalnej lub selektywnego przetwarzania5. Dwie wysoce homologiczne kinazy Ser/Thr, IKK2/β i IKK1/α, działają jako centralne regulatory aktywności NF-κB, przeprowadzając te zdarzenia fosforylacji6,7.
Interakcje między ligandem a receptorem przekazują sygnał przez szereg mediatorów, prowadząc do aktywacji czynników NF-κB. Proces sygnalizacji NF-κB można ogólnie podzielić na dwie odrębne ścieżki – kanoniczną i niekanoniczną (alternatywną)8. Aktywność IKK2/β przede wszystkim reguluje sygnalizację NF-κB szlaku kanonicznego, który jest niezbędny dla zapalnych i wrodzonych odpowiedzi immunologicznych9. Charakterystyczną cechą tego szlaku jest szybka i krótkotrwała aktywacja IKK2/β10 w obrębie dotychczas niescharakteryzowanego biochemicznie kompleksu IKK — przypuszczalnie składającego się z IKK1 i IKK2, a także składnika regulatorowego, NEMO (NF-κB Essential Modulator)11,12,13. Pomiędzy dwiema katalitycznymi podjednostkami IKK kompleksu IKK, IKK2 jest przede wszystkim odpowiedzialny14 za fosforylację specyficznych reszt prototypowych IκB (α, -β i -γ) związanych z NF-κB, a także nietypowego białka IκB, NF-κB1/p105, które jest prekursorem podjednostki NF-κB p505. Ubikwitynacja i proteasomalna degradacja IκB (lub przetwarzanie p105) wywołane fosforylacją prowadzą do uwolnienia i aktywacji określonego zestawu dimerów NF-κB15. Nieprawidłowa aktywność NF-κB spowodowana nieprawidłową funkcją IKK2 została zaobserwowana w wielu nowotworach, a także w zaburzeniach autoimmunologicznych2,3,16.
W przeciwieństwie do IKK2/β, aktywność IKK1/α reguluje sygnalizację NF-κB szlaku niekanonicznego, co jest niezbędne dla rozwoju i odporności. IKK1 fosforyluje specyficzne reszty NF-κB2/p100 na swoim C-końcowym segmencie IκBδ, co prowadzi do jego przetwarzania i wytwarzania p52. Tworzenie aktywnego transkrypcyjnie heterodimeru p52:RelB inicjuje powolną i trwałą odpowiedź na sygnały rozwojowe7,17,18,19,20. Co ciekawe, wytwarzanie centralnego czynnika NF-κB p52 tego szlaku jest krytycznie zależne od innego czynnika, kinazy indukującej NF-κB (NIK)21,22, ale nie od IKK2 lub NEMO. W komórkach w stanie spoczynku poziom NIK pozostaje niski ze względu na ciągłą degradację zależną od proteasomu23,24,25. Po stymulacji komórek przez "niekanoniczne" ligandy i w niektórych komórkach złośliwych NIK stabilizuje się w celu rekrutacji i aktywacji IKK1/α. Aktywność kinazy zarówno NIK, jak i IKK1 jest niezbędna do efektywnego przetwarzania p100 na p527. IKK1 i NIK fosforylują trzy seryny (Ser866, 870 i 872) NF-κB2/p100 na jego C-końcowym segmencie IκBδ, prowadząc do jego przetworzenia i wytworzenia p52. Nieprawidłowa aktywacja szlaku niekanonicznego jest związana z wieloma nowotworami złośliwymi, w tym ze szpiczakiem mnogim, 26,27,28.
Znanych jest kilka wysoce skutecznych i specyficznych inhibitorów IKK2/β, chociaż jak dotąd żaden z nich nie okazał się skutecznym lekiem. Natomiast inhibitory specyficzne dla IKK1/α są nieliczne. Może to częściowo wynikać z braku informacji strukturalnych i biochemicznych na temat IKK1/α, co ogranicza nasze zrozumienie mechanistycznych podstaw aktywacji NF-κB przez IKK1 w komórkach i racjonalnego projektowania leków. Struktury rentgenowskie IKK2/β dostarczyły nam wglądu w mechanizm aktywacji IKK2/β29; jednak struktury te nie mogły ujawnić, w jaki sposób różne bodźce poprzedzające wyzwalają aktywację IKK1/α lub IKK2/β w celu regulowania odrębnych zestawów aktywności NF-κB 30,31. Aby zrozumieć mechanistyczne podstawy leżące u podstaw odrębnej funkcji sygnalizacyjnej IKK1/α i stworzyć platformę do racjonalnego projektowania leków, skupiliśmy się na określeniu struktury IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin został wycofany z produkcji i zastąpiony przez Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III Pożywka z komórek owadzich</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa SF9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-IKK1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Wcześniej sprzedawane przez Imgenex</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-PentaHis</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitroceluloza może być również stosowana</td></tr><tr><td>Agaroza Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania Bradforda</td><td>Kolumna BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200</td><td></td><td></td> Koncentrator 28989335 <td></td></tr><tr><td>Amicon</td> firmy GE Healthcare<td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Związek A</td><td>Inhibitor IKK Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporyna</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Przedmiot upominkowy</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>siarczan dekstranu</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Niektóre z nich to nowe Cat # w katalogu SIGMA. To, co mieliśmy, pochodziło z Fluki, która miała inny Cat #.</td></tr><tr><td>Ekrany</td><td></td><td></td><td></td>krystalizacji</tr><tr><td>Ekran kryształowy I i II (ekran kryształkowy HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Indeks HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion i PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 i PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 i SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Montaże kryształowe</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>Zaawansowane źródło fotonów (APS) w Departamencie Energii Stanów Zjednoczonych' s Argonne National Laboratory</td><td>Beamline 19 ID</td><td>Zaawansowane źródło fotonów (APS) w Departamencie Energii Stanów Zjednoczonych" s Argonne National Laboratory dostarcza ultrajasne, wysokoenergetyczne, generowane w pierścieniu wiązki promieniowania rentgenowskiego do badań w prawie wszystkich dyscyplinach naukowych.</td></tr></tbody></table>

przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego ikk1/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Klasa bodźców zewnątrzkomórkowych wymaga aktywacji IKK1/α w celu wywołania generacji podjednostki NF-κB, p52, poprzez przetwarzanie jej prekursora p100. p52 funkcjonuje jako homodimer lub heterodimer z inną podjednostką NF-κB, RelB. Te dimery z kolei regulują ekspresję setek genów zaangażowanych w stan zapalny, przeżycie komórek i cykl komórkowy. IKK1/α pozostaje przede wszystkim związany z IKK2/β i NEMO jako kompleks trójskładnikowy. Jednak niewielka jego pula jest również obserwowana jako kompleks (kompleksy) o niskiej masie cząsteczkowej. Nie wiadomo, czy aktywność przetwarzania p100 jest wyzwalana przez aktywację IKK1/α w większej czy mniejszej złożonej puli. Konstytutywną aktywność IKK1/α wykryto w wielu nowotworach i chorobach zapalnych. Aby zrozumieć mechanizm aktywacji IKK1 / α i umożliwić jego wykorzystanie jako celu leku, poddaliśmy ekspresji rekombinowanego IKK1 / α w różnych systemach gospodarza, takich jak E. coli, komórki owadów i ssaków. Udało nam się uzyskać ekspresję rozpuszczalnego IKK1 / α w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem, otrzymując mg ilości białka o wysokiej czystości, krystalizując je w obecności inhibitorów i określając jego strukturę krystaliczną promieniowania rentgenowskiego. Tutaj opisujemy szczegółowe etapy produkcji rekombinowanego białka, jego krystalizacji i określania struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego.

Klonowanie i ekspresja różnych konstruktów IKK1/α 
Pełnowymiarowa ludzka IKK1/α została sklonowana do wektora ekspresyjnego bakulowirusowego pFastBacHTa w obrębie miejsc restrykcyjnych EcoRI i NotI w celu uzyskania IKK1 z N-końcowym znacznikiem heksa-histydynowym. Znacznik można było usunąć poprzez trawienie proteazą TEV. Ponieważ pełnowymiarowa IKK1/α zawiera regiony elastyczne na obu końcach, a regiony elastyczne zazwyczaj utrudniają krystalizację białka, sklonowano ...

Kinaza IκB 1/α (IKK1/α CHUK) to kinaza białkowa Ser/Thr, która bierze udział w niezliczonych aktywnościach komórkowych, głównie poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB. W tym miejscu opisujemy główne etapy niezbędne do produkcji i określenia struktury krystalicznej tego białka.

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Celem niniejszej procedury jest przedstawienie wytycznych dotyczących produkcji, krystalizacji i wyznaczania struktury ludzkiego białka IKK1-alpha, aby zrozumieć mechanistyczne podstawy jego funkcji sygnałowej oraz stworzyć platformy do racjonalnego projektowania leków. Metoda ta powinna pomóc badaczom w wyznaczeniu struktury IKK1, co pozwoli na znalezienie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji immunologicznej. Technika ta opisuje usprawnioną ścieżkę otrzymywania kryształów białek IKK, które są dość trudne do poddania krystalizacji, oraz dostarcza istotnych informacji pozwalających na pokonanie barier w wyznaczaniu ich struktur.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ uzyskanie miligramowych ilości rozpuszczalnego, stabilnego białka wymaga jego ekspresji w komórkach owadów, a krystalizacja jest możliwa jedynie w bardzo wąskim zakresie warunków. Procedura wymiany molekularnej zastosowana przy wyznaczaniu struktury IKK1 może być również bardzo problematyczna, szczególnie ze względu na słabe właściwości dyfrakcyjne kryształów, a nie w obrębie jednostki asymetrycznej zawierającej wiele cząsteczek IKK1 przy braku odpowiednich mod

a-guide-to-production-crystallization-structure-determination-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Struktura krystaliczna kompleksów białko–DNA może dostarczyć informacji na temat funkcji i mechanizmu działania białka, a także charakteru specyficznej interakcji. W niniejszym materiale opisujemy sposób optymalizacji długości, sekwencji i końców dwuniciowego DNA w celu kokrystalizacji z białkiem SeqA z Escherichia coli, które jest negatywnym regulatorem inicjacji replikacji.

Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA w celu krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Protokół opisuje eksperymentalne metody uzyskiwania stabilnego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I poprzez potencjalne β podstawienia 2-mikroglobuliny (β2m) od różnych gatunków. Przeprowadzono porównanie strukturalne MHC I stabilizowanego β homologicznym i heterologicznym 2 m.

Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Poznaj metodę produkcji i krystalizacji ludzkiej kinazy IKK1/α w celu określenia jej struktury. Technika ta umożliwia zrozumienie mechanizmów sygnałowych i wspiera racjonalny projektowanie leków.

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

Przeglądaj więcej filmów