Name: Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę nieinwazyjnego podawania i śledzenia mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza w mózgu myszy po urazie. Technika MRI umożliwia monitorowanie migracji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Granty Ministerstwa Nauki i Technologii na Tajwanie (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063 i MOST 107-2314-B-038-042) oraz Uniwersytet Medyczny w Tajpej (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 i DP2-108-21121-01-N-05-01).

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, z aprobatą Komisji Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym w Tajpej (nr zatwierdzenia. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. Znakowanie MSCs za pomocą nanocząstek SPIO
<ol>
	<li>Aby oznaczyć MSC za pomocą SPIO, dodać 6 ml pożywki do znakowania (25 μg/ml SPIO w zmodyfikowanej pożywce Eagle [DMEM] firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) do kolby T75 zawierającej MSCs (80% konfluencji).</li>
	<li>Inkubować komórki z pożywką etykietującą w inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) bez wstrząsania. Po 24 godzinach delikatnie usuń nośnik do etykietowania za pomocą sterylnej pipety Pasteura z plastikową końcówką podłączoną do próżni. Przemyj komórki jednowarstwowo 2x 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie ślady niezinternalizowanego SPIO.
	<ol>
		<li>Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie oznakowane, sprawdź znakowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym, jeśli SPIO są oznaczone fluoroforem (tj. jak te używane tutaj; <silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C). Alternatywnie, należy wykonać barwienie komórek błękitem pruskim (patrz kroki 6.2–6.4 dla protokołu barwienia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać przylegające komórki przez potraktowanie 3 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C. Po 5 minutach inkubacji dodaj 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM z 10% FBS (v/v), aby dezaktywować trypsynę. Zawiesinę komórek pobrać za pomocą pipety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS. Policz żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. 
	nuta: Osad komórek oznaczonych komórek będzie miał ciemny kolor z powodu obciążenia żelazem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Protokół ten jest odpowiedni do znakowania MSC i obrazowania MRI. Procedura etykietowania MSC6 została wcześniej zoptymalizowana i uwzględniono tutaj tylko kroki mające na celu przygotowanie oznakowanych MSC do śledzenia in vivo, ponieważ śledzenie in vivo jest najważniejsze. Protokół hodowli i znakowania innych typów komórek powinien być zoptymalizowany przez badacza.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek za pomocą PBS do 150 000 komórek (lub liczby, która daje wystarczający sygnał MRI) w 18 μl PBS (lub całkowitej objętości, która zostanie wykorzystana w procedurze podawania donosowego). 
	nuta: Zauważono, że stężenie komórek wyższe niż 150 000 komórek/18 μl PBS prowadzi do agregacji komórek, co może wpływać na efektywność podawania donosowego. Jeśli do podania donosowego potrzebna jest większa liczba komórek, należy zwiększyć całkowitą objętość zawiesiny komórkowej i zwiększyć liczbę podań donosowych, ponieważ podanie donosowe jest procedurą nieinwazyjną i możliwe jest wielokrotne dawkowanie.</li>
</ol>
2. Kontrolowane uderzenie w korę mózgową (CCI)
UWAGA: W tym protokole, samce myszy C57 BL/6 (w wieku 7-8 tygodni) były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do jedzenia i wody.
<ol>
	<li>Aby przygotować każdą mysz na uraz CCI, należy podać zolazepam (50 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg) koktajl znieczulający poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) (1 ml/kg). Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca przy braku reakcji na uszczypnięcie palca. Alternatywnie umieść mysz w komorze zaopatrzonej w 2%-4% izofluranu na 60 sekund. </li>
	<li>Ogol sierść na grzbietowej powierzchni czaszki między uszami za pomocą elektronicznej maszynki do strzyżenia włosów. Kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar za pomocą sterylnego wacika nasączonego jodem. Użyj bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby usunąć jod.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej i zabezpiecz mysz za pomocą nauszników i pasków na nos. Wykonaj nacięcie śródstrzałkowe (około 2,5 cm) w ogolonej skórze za pomocą sterylnych nożyczek, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki.</li>
	<li>Usuń tkankę z kości za pomocą wacika, aby odsłonić czaszkę. Oczyść powierzchnię czaszki za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 3%H2O2 przez 10 s, a następnie wyczyść ją suchym wacikiem. 
	nuta: Szwy czaszki oraz zarówno bregma, jak i lambda mogą być teraz łatwo zidentyfikowane.</li>
	<li>Zidentyfikuj wybrane współrzędne na powierzchni czaszki dla urazu CCI i narysuj okrąg (o średnicy 4 mm) wokół współrzędnych za pomocą ołówka lub odpowiedniego markera. 
	nuta: W tym protokole do indukcji CCI wykorzystano współrzędne przednio-tylne (AP) -2,0 mm i przyśrodkowo-boczne (ML) +1,5 mm.</li>
	<li>Użyj mikrowiertła i okrągłego zadzioru (średnica 0,5 mm), aby rozrzedzić czaszkę w zaznaczonym okręgu. Unikaj wywierania nacisku podczas wiercenia, ponieważ wiercenie w kości może spowodować uszkodzenie miąższu mózgu. Usuń kurz kostny za pomocą czystego i suchego bawełnianego wacika.</li>
	<li>Delikatnie usuń płat kostny za pomocą sterylnych cienkich kleszczy, aby odsłonić oponę twardą, zachowując ją w stanie nienaruszonym. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej, która była używana do przygotowania przed urazem i umieść ją w ramce stereotaktycznej urządzenia CCI.</li>
	<li>Ustabilizuj głowę myszy za pomocą nauszników i pasków na nos. Upewnij się, że główka myszy jest wypoziomowana w kierunku rostralno-ogonowym i w razie potrzeby wyreguluj paski nosowe.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami na skrzynce sterowniczej, aby wyzerować końcówkę impaktora do odsłoniętej powierzchni kory mózgowej. Upewnij się, że końcówka udaru jest wyrównana bezpośrednio nad żądanymi współrzędnymi kory mózgowej, w które ma zostać uderzona, za pomocą pokręteł sterujących X i Y na podstawie impaktora.</li>
	<li>Ustaw parametry eksperymentu za pomocą skrzynki kontrolnej z prędkością 5 m/s, czasem przebywania 250 ms i głębokością urazu 1 mm, aby wywołać łagodne obrażenia myszy.</li>
	<li>Wywołaj obrażenia, naciskając przycisk "uderzenie" na skrzynce sterowniczej. Wymaz wszelkie krwawienia, które wystąpią, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.</li>
	<li>Wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej i zamknij nacięcie za pomocą jedwabnych szwów chirurgicznych. Nie używaj metalowych klipsów do zamykania pola operacyjnego, ponieważ mysz zostanie poddana działaniu pola magnetycznego do rezonansu magnetycznego.</li>
	<li>Stosować miejscowo antybiotyki (bacytracyna, neomycyna) na miejsce operowane, aby zapobiec infekcjom. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej i uważnie ją monitoruj podczas fazy odzyskiwania.</li>
	<li>Ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) należy podawać codziennie przez 3 dni po zabiegu, chyba że podanie ketoprofenu jest sprzeczne z celami badania.</li>
</ol>
3. Podanie donosowe
<ol>
	<li>W 1 dniu po indukcji CCI należy podać zolazepam (50 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg) koktajl znieczulający poprzez wstrzyknięcie dożylne. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona z powodu braku reakcji na uszczypnięcie palca.</li>
	<li>Przygotuj mysz do donosowego podawania MSCs za pomocą leczenia hialuronidazą.
	<ol>
		<li>Chwyć kark myszy i mocno obróć się na plecy, jednocześnie unieruchamiając czaszkę. Umieść końcówkę pipety zawierającej hialuronidazę w sterylnym PBS (4 U/μL) w pobliżu nozdrza myszy pod kątem 45°.</li>
		<li>Podać 3 μl zawiesiny hialuronidazy do każdego nozdrza. Trzymaj mysz unieruchomioną i skierowaną do góry na czystej podkładce przez 5 minut. Powtórz zabieg hialuronidazy 4x (łącznie 100 U zawiesiny hialuronidazy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po leczeniu hialuronidazą należy trzymać leczoną mysz na czystej podkładce skierowanej do góry przez 30 minut.</li>
	<li>Aby dostarczyć MSC do mózgu, przytrzymaj mocno mysz, jak opisano w kroku 3.2.1. Podawać 3 μl/nozdrze zawiesiny MSC w odstępie 3 s. Przytrzymaj mysz w tej samej pozycji przez 30 sekund, aż krople próbki całkowicie znikną. 
	nuta: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas podawania.</li>
	<li>Powtórzyć podawanie w odstępie 2 minut do 3x, 
	nuta: Całkowita liczba komórek, które mają zostać dostarczone, wynosi 150 000, tak że 18 μl zawiesiny komórek można dostarczyć w dawce 3 μl na każde nozdrze, po 3 razy każda.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie ją monitoruj, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
</ol>
4. Rezonans magnetyczny in vivo
UWAGA: Barwienie histologiczne tkanki mózgowej było wcześniej używane do potwierdzania udanego dostarczania komórek macierzystych po podaniu donosowym. Metoda ta może być jednak stosowana jedynie jako punkt końcowy badania, a nie w ujęciu podłużnym. Wykorzystanie sond MRI do znakowania terapeutycznych komórek macierzystych pozwoli na podłużne, nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo za pomocą MRI. Co ważne, protokół ten skutecznie zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt. W tym protokole skanowanie MRI wykonano w 1, 7 i 14 dniu po dostarczeniu MSC.
<ol>
	<li>Aby przygotować mysz do badania MRI, znieczulij mysz izofluranem (5% izofluranu w 1 l/minO2 do indukcji, 1,5%-2% izofluranu do konserwacji). Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że mysz osiągnie wymagany poziom znieczulenia.</li>
	<li>Umieść mysz na uchwycie obrazu i zabezpiecz jej pozycję za pomocą stuknięć lub innej odpowiedniej metody. Przesuń uchwyt na środek cewki MRI (magnes 7 T/40 cm) i podłącz złącze monitorowania.</li>
	<li>Aby uzyskać skany zależne od T2* przy użyciu sekwencji spin-echo, ustaw czas powtarzania (TR) na 1500 ms, a czas echa (TE) na 2,8 ms.</li>
	<li>Użyj pola widzenia (FOV) 16 mm x 16 mm, matrycy akwizycji 128 x 128 (MTX) i grubości warstwy 0,75 x 0,8 mm2 z czterema średnimi sygnałami i kątem obrotu 90° (FA).</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania wycofaj uchwyt myszy ze środka cewki MRI. Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie ją monitoruj, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
	<li>Do śledzenia i ilościowego oznaczania oznaczonych MSC na obrazach ważonych T2* należy użyć oprogramowania ITK-SNAP (wersja 3.8.0)7.
	<ol>
		<li>Przenieś surowe dane ze skanów MRI z komputera urządzenia do rezonansu magnetycznego do komputera używanego do analizy w formacie DICOM (digital imaging and communications in medicine).</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie ITK-SNAP i załaduj obrazy MRI, klikając przycisk Plik. Następnie kliknij Otwórz główny obraz w menu. Naciśnij przycisk Otwórz obraz w oknie wyświetlacza, a następnie zlokalizuj i otwórz obrazy MRI za pomocą przycisku Przeglądaj. 
		nuta: Wizualizacja oznaczonych komórek na obrazach MRI będzie wyglądać jak obszary hipointensywne. Jeśli konieczne jest dostosowanie kontrastu obrazu, wybierz Narzędzia | Kontrast obrazu.</li>
		<li>Utwórz segmentacje obszarów hipointensywnych i zmian chorobowych lub innych części mózgu, wybierając opcję Aktywna etykieta w sekcji etykiet segmentacji. Używaj różnych kolorów etykiet dla różnych segmentów (jeśli potrzebna jest segmentacja więcej niż jednej części).</li>
		<li>Użyj narzędzia Wielokąt na głównym pasku narzędzi, aby obrysować hipointensywne obszary reprezentujące MSC oznaczone SPIO. Wybierz opcję Akceptuj, znajdującą się poniżej obrazu MRI. Segmentowane obszary będą wyświetlane w tym samym kolorze, co aktywna etykieta przypisana do tego konkretnego segmentu. Powtórz ten krok segmentacji dla wszystkich wycinków MRI.</li>
		<li>Opracuj mapę 3D segmentowanych obszarów, aby przedstawić rozkład MSC w całym mózgu, wybierając narzędzie Skalpel u dołu paska narzędzi 3D, znajdującego się w sekcji Etykiety segmentacji u dołu przybornika ITK-SNAP. Następnie naciśnij przycisk Akceptuj u dołu utworzonej mapy 3D.</li>
		<li>Aby przeprowadzić analizę ilościową (średnia objętość i intensywność) segmentowanych obszarów hipointensywnych reprezentujących oznaczone komórki, naciśnij przycisk Segmentacja w górnym panelu i wybierz Objętość i statystyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Fiksacja mózgu myszy i kriosekcja
<ol>
	<li>Aby naprawić mózg myszy, wykonaj perfuzję przezsercową z 4% paraformaldehydem (PFA) po ostatnim skanowaniu MRI, jak opisano wcześniej8.
	<ol>
		<li>Odetnij głowę i wyciągnij mózg8. Utrwalić mózg 4% PFA przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwodnić mózg, zanurzając go w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurzyć mózg w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić w temperaturze -20 °C. Mózg za pomocą mikrotomu kriostatu należy podzielić na plastry o grubości 14 μm i zamontować na szkiełkach. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
6. Barwienie błękitu pruskiego
UWAGA: Barwienie błękitem pruskim jest powszechnie używane do wykrywania zawartości żelaza w komórkach znakowanych SPIO. W tym przypadku barwienie błękitem pruskim służy do potwierdzenia, że hipointensywne sygnały na obrazach MRI odpowiadają MSC znakowane SPIO, a nie artefaktom. Barwienie błękitem pruskim jest jedną z najbardziej czułych metod histochemicznych stosowanych do wykrywania żelaza w tkankach i może być stosowane do identyfikacji nawet pojedynczej granulki żelaza w komórkach.
<ol>
	<li>Myj szkiełka sekcji mózgu wodą destylowaną przez 5 minut.</li>
	<li>Barwienie błękitu pruskiego należy wykonać, zanurzając szkiełka na 30 minut w roztworze barwiącym, który zawiera równe części kwasu solnego (10%) i żelazocyjanku potasu (10%) przygotowanych bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Umyć 3x wodą destylowaną, po 5 min każde. Przeciwbarwić sekcje szybkim jądrowo kolorem czerwonym przez 5 minut. Opłucz szkiełka 2x wodą destylowaną.</li>
	<li>Sekcje należy stopniowo odwadniać, zanurzając szkiełka w 95% i 100% alkoholu na 2 minuty każda. Dodaj szkiełko nakrywkowe z żywicznym podłożem montażowym.</li>
	<li>Użyj mikroskopu świetlnego, aby wykryć wybarwione komórki w sekcjach mózgu. 
	nuta: Żelazo w oznaczonych komórkach pojawi się jako osady w kolorze niebieskim.</li>
</ol>

<ol><li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad8%2FBMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li>
<li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li>
<li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).</li>
<li>Karussis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunological+effects+of+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).</li>
<li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%2C+macrophages%2C+and+microglia+to+the+brain+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease.</a> Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).</li>
<li>Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Homing+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+to+Injury+Site+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures%3A+significantly+improved+efficiency+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cell+transplantation+in+stroke+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury.</a> Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).</li>
<li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+CNS+repair+following+TBI%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).</li>
<li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory%2Fimmune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li>
<li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+%28MSCs%29+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li>
<li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo%3A+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li>
<li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li>
<li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation%3A+a+multi-scale+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).</li>
<li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li>
<li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół przedstawia ogólne procedury znakowania MSC SPIO i śledzenia MRI MSCs znakowanych SPIO po podaniu donosowym. Protokół daje możliwość badania migracji i biodystrybucji MSCs po dostarczeniu in vivo w mózgu, przy użyciu metody nieinwazyjnej.
MSCs są atrakcyjnymi kandydatami do terapii opartych na komórkach macierzystych zaburzeń i urazów OUN ze względu na ich zdolność do wydzielania czynników troficznych, które 1) uruchamiają procesy neuroregeneracyjne i 2) zapewniają neuroprotekcję, dzięki ich działaniu przeciwzapalnemu w obszarze urazu 9,10,11,12 . Chociaż długoterminowe śledzenie MRI i wykrywanie MSC znakowanych SPIO może być ograniczone ze względu na rozcieńczenie międzykomórkowego SPIO z podziałem komórkowym, znakowane komórki mogą być wykrywane przez okres do kilku tygodni po przeszczepie w mózgach modeli zwierzęcych13.
Opisano tu również protokół znakowania MSCs z nanocząstkami SPIO pokrytymi dekstranem bez środków transfekcyjnych. Inne protokoły zostały wykorzystane w literaturze 14,15,16. Jednak we wszystkich przypadkach protokoły te powinny być dostosowane do typu komórki, wielkości SPIO, czasu inkubacji i stężenia SPI. Wykazano, że MSCs mają upośledzony potencjał różnicowania chondrogennego, ale nie różnicowanie adipogenne po znakowaniu SPIO17. Dlatego zdecydowanie zaleca się wykonanie testów różnicowania przed dostarczeniem komórek macierzystych w celu oceny wpływu SPIO na siłę różnicowania komórek macierzystych. W poprzednim badaniu wykazano, że znakowanie MSC tym samym typem SPIO i stężeniem zastosowanym w tym badaniu nie wpłynęło na siłę różnicowania osteogennego lub adipogennegoMSCs 6.
Donosowa droga terapeutycznego dostarczania komórek macierzystych w przypadku zaburzeń i urazów mózgu jest obiecującym podejściem do klinicznego zastosowania komórek macierzystych. Jednak wewnętrzne i molekularne mechanizmy, które dyktują zachowanie komórek macierzystych w jamie nosowej, pozostają niejasne. Chociaż droga donosowa jest szeroko badana pod kątem dostarczania małych cząsteczek, rozmiar i zachowanie biodystrybucji łodygi terapeutycznej różnią się od małych cząsteczek. Obecny protokół pokazuje, że MSC mają tendencję do migracji w kierunku miejsca urazu po porodzie donosowym.
W tym przypadku obrazy ważone T2* zostały wykorzystane do śledzenia MSC oznaczonych SPIO. W innych raportach wykorzystano obrazowanie echa gradientowego. Jednak artefakty podatności są często obserwowane w obrazowaniu echa gradientowego z powodu międzykomórkowego SPIO. W obecnym protokole lokalizacja obszarów hipointensywnych reprezentujących MSC znakowane SPIO na obrazach T2 * była taka sama, jak lokalizacja SPIO w sekcjach mózgu, wykryta w badaniu histologicznym (Figura 3). Wskazuje to na odpowiednią czułość obrazowania echa spinowego zależnego od T2* dla śledzenia MSC w mózgu znakowanego SPIO.
Podsumowując, opisany protokół jest korzystny dla badań in vivo nad śledzeniem komórek macierzystych urazów i zaburzeń mózgu. Śledzenie podłużne komórek macierzystych in vivo tradycyjnie odbywa się poprzez składanie zwierząt w ofierze w wielu punktach czasowych. Obecny protokół zapewnia nieinwazyjne i skuteczne podejście do dostarczania i śledzenia MSC, co stanowi potencjalną procedurę terapii opartej na komórkach macierzystych w przypadku urazów i zaburzeń mózgu w warunkach klinicznych.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnymi kandydatami do terapii opartej na komórkach macierzystych w leczeniu zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i urazów u ludzi. Co więcej, MSC zostały wykorzystane jako nośnik do dostarczania białek terapeutycznych w miejscach urazu1,2. W ostatnich latach opracowano obiecujące innowacje w celu ustalenia: 1) nowych dróg dostarczania komórek oraz 2) śledzenia komórek w terapiach zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego opartych na komórkach macierzystych. Donosowe dostarczanie komórek macierzystych do mózgu zależy od zdolności komórek do ominięcia płytki cribriform i częściowego wejścia do opuszki węchowej drogą miąższową3. Połączenie podawania donosowego i znakowania MSCs nanocząstkami superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO) stanowi obiecujące podejście do zastosowań klinicznych MSCs w leczeniu zaburzeń OUN, ponieważ nanocząstki SPIO są bezpiecznymi sondami do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i umożliwiają nieinwazyjne, czułe śledzenie podłużne MSCs po dostarczeniu za pomocą MRI3,4,5. Ponadto podawanie donosowe jest bezpieczną i nieinwazyjną drogą, która umożliwia wielokrotne podawanie w krótkim czasie.
Ten artykuł opisuje bardzo czułą i nieinwazyjną technikę śledzenia MSCs in vivo po dosaniu donosowym w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI), który wykorzystuje komórki znakowane SPIO i MRI. Jedną z ważnych zalet znakowania SPIO jest czułe wykrywanie SPIO w tkance za pomocą rezonansu magnetycznego, co umożliwia skuteczne i nieinwazyjne śledzenie komórek. Zastosowane tutaj nanocząstki SPIO są dostępne na rynku i oznaczone fluoroforem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), który pozwala na wykrycie SPIO w tkance bez barwienia immunologicznego lub dodatkowego przetwarzania. Ponadto możliwe jest prowadzenie podłużnego śledzenia w czasie rzeczywistym i badanie biodystrybucji dostarczonych MSC.

<table><tbody><tr><td>Materiały do hodowli komórkowych (tworzywa sztuczne)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Vary Wymienne</td><td>z dowolnego źródła</td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze do mikrotomów</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x) z GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do zatapiania zamrożonych próbek tkanek (O. C. T.)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>12662-029</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop dzikiego pola</td><td>Olympus Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Forcept</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>gentamycyna (10 mg / ml)</td><td>GIBCO</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>Pet Club</td><td>PC-400</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do urazów głowy</td><td>Precyzyjne systemy i oprzyrządowanie</td><td>Model TBI-0310</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>ITK-SNAP Software</td><td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Naukowy Instytut Obliczeń i Obrazowania (SCI) na Uniwersytecie Utah</td><td>ITK-SNAP 3.8.0</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina ( Ketavet)</td> <td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Narodowe Centrum Zwierząt Laboratoryjnych, Tajwan</td><td>C57BL6</td><td>Szczep myszy typu dzikiego wykorzystany w badaniu</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>Nakanishi</td><td>NE50</td><td>Połącz z zadziorami do generowania okna kostnego</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Mysz (C57BL/6) Mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>GIBCO</td><td>S1502-100</td><td></td></tr><tr><td>Skaner MRI</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Saline (PBS)</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod 7,5%</td><td>Purdue produkt L.P.</td><td></td><td>Peeling chirurgiczny</td></tr><tr><td>Pruska niebieska plama</td><td>Abcam</td><td>ab150674</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPIO)</td><td>BioPAL</td><td>Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td><td>znakowanie komórek macierzystych do śledzenia in vivo za pomocą MRI</td></tr><tr><td>Monofilament do szwów</td><td>Ethicon</td><td>G697</td> Zegar <td>szwów</td></tr><tr><td></td><td>Wisewind</td><td></td><td>Wymienny z dowolnym źródłem</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Terapie oparte na komórkach macierzystych w leczeniu urazów mózgu, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), są obiecującym podejściem do badań klinicznych. Jednak przeszkody techniczne, takie jak inwazyjne dostarczanie komórek i śledzenie przy niskiej skuteczności przeszczepów, pozostają wyzwaniami w translacyjnej terapii opartej na łodygach. W artykule opisano nową technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych opartą na znakowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) nanocząstkami superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), a także podawaniu donosowym znakowanych MSC. Te nanocząstki są osadzone w izotiocyjanianach fluoresceiny (FITC) i można je bezpiecznie znakować MSC, które są następnie dostarczane do mózgów myszy z indukcją TBI drogą donosową. Są one następnie nieinwazyjnie śledzone in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) w czasie rzeczywistym. Do ważnych zalet tej techniki, która łączy SPIO do znakowania komórek i podawania donosowego, należą: (1) nieinwazyjne śledzenie MSC in vivo po podaniu przez długie okresy śledzenia, (2) możliwość wielokrotnego dawkowania ze względu na nieinwazyjną drogę dostarczania MSC oraz (3) możliwe zastosowania u ludzi, ze względu na bezpieczeństwo SPIO, nieinwazyjny charakter metody śledzenia komórek za pomocą MRI, i drogi podania.

Dwadzieścia cztery godziny po podaniu donosowym, MSC oznakowane SPIO były widoczne jako obszary silnie hipointensywne, położone przyśrodkowo względem uszkodzenia kory w obrazach ważonych T2* (Rycina 2B), co wskazuje na celowaną migrację SPIO do miejsca urazu. Migracja ta pozostawała widoczna do 14 dni po podaniu, ponieważ stwierdzono, że sygnały hipointensywne były widoczne bez znaczącego osłabienia w tym okresie czasu (Rycina 2B). U poszkodowanych zwierząt leczonych PBS nie stwierdzono obszarów hipointensywnych, co wskazuje, że zaobserwowane obszary hipointensywne odpowiadają MSC znakowanym SPIO, a nie artefaktom sygnału (Rysunek 2ABiodystrybucja znakowanych MSC, obserwowana in vivo za pomocą MRI, została zwizualizowana przy użyciu rekonstrukcji 3D (Rysunek 2C,D). Migrację MSC do uszkodzonej kory potwierdzono histologicznie za pomocą barwienia błękitem pruskim oraz detekcji w kanale FITC dla znakowanych FITC cząsteczek SPIO w oznakowanych MSC (Rycina 3A,B).
<img alt="Znakowanie MSC SPIO dla badania TBI u myszy; schemat, obrazy z mikroskopii, probówka do separacji SPIO." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg protokołu oraz potwierdzenie in vitro pobierania SPIO przez MSCs. (A) MSCs inkubowano z SPIO przez 24 h w celu ich oznakowania. Następnie oznakowane MSCs podano w modelu TBI u myszy drogą donosową (IN). Wykonano MRI w różnych punktach czasowych, aby śledzić oznakowane MSCs. Potwierdzenie wystarczającego oznakowania MSCs za pomocą SPIO uzyskano za pomocą (B) mikroskopii fluorescencyjnej oraz (C) mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem kanału FITC, ponieważ nanocząsteczki SPIO zostały znakowane FITC. (D) Osad komórkowy oznakowanych MSCs miał ciemny kolor ze względu na obciążenie żelazem. FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; SPIO = superparamagnetyczne cząsteczki tlenku żelaza; MSCs = mezenchymalne komórki macierzyste; MRI = obrazowanie rezonansem magnetycznym; IN = donosowo; TBI = urazowe uszkodzenie mózgu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza MRI TBI w ciągu 14 dni, porównująca PBS i MSC znakowane SPIO; obejmuje dopasowanie spektralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: MRI w czasie rzeczywistym umożliwia detekcję i śledzenie migracji MSC znakowanych SPIO w kierunku miejsc urazu w mózgach myszy z indukowanym TBI. (A) Myszy poddano TBI, a następnie leczono za pomocą PBS lub MSC znakowanych SPIO, podanych drogą donosową 24 h po urazie. Przekroje czołowe obrazów ważonych T2* wykazały znakowane MSC jako obszar hipointensywny (grot strzałki) na krawędzi miejsca urazu (obszar obrysowany) w 1., 7. i 14. dniu po podaniu. U myszy leczonych PBS nie występuje obszar hipointensywny. (B) Proces segmentacji obszaru miejsca urazu (zielony) i znakowanych MSC (czerwony) na podstawie czołowych obrazów T2*-MRI. (C) Rekonstrukcja 3D leczenia mózgu myszy na podstawie obrazów ważonych T2*, ilustrująca biodystrybucję MSC znakowanych SPIO w mózgu 14 dni po podaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, barwienie błękitem pruskim, FITC/DAPI, MSC, TBI, obraz mikroskopowy, badanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza histologiczna potwierdza obecność MSC znakowanych SPIO w mózgach leczonych zwierząt. Barwienie błękitem pruskim przekrojów mózgu (A) myszy traktowanej PBS (kontrola) oraz (C) myszy traktowanej MSC znakowanymi SPIO. Komórki SPIO-dodatnie wykryto u myszy traktowanej MSC (komórki w ramkach, niebieskie), podczas gdy u myszy kontrolnej nie stwierdzono obecności komórek dodatnich w miejscu urazu w korze 14 dni po podaniu, co potwierdza obserwacje MRI. Analizę mikroskopii fluorescencyjnej kory (B) myszy kontrolnej traktowanej PBS oraz (D) myszy traktowanej MSC znakowanymi SPIO przeprowadzono 14 dni po podaniu. Analiza wykazała obecność komórek SPIO-dodatnich znakowanych FITC (komórki w ramkach, zielone) w uszkodzonej korze u myszy traktowanej MSC, natomiast w korze myszy traktowanej PBS nie zaobserwowano sygnałów FITC. Paski skali = 50 µm, chyba że zaznaczono inaczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Metoda ta może pomóc w określeniu rozkładu zasad lobitycznej komórki macierzystej po dostarczeniu donosowym do mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia nieinwazyjne dostarczanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych do mózgu. Możliwe są również wielokrotne dawki, aby zmaksymalizować efekty terapeutyczne przeszczepionych komórek w fazie przewlekłej po urazach.Technika ta maksymalizuje liczbę komórek dostarczanych do miejsca urazu i minimalizuje progresję komórek lobitowych do innych tkanek. Chociaż technika ta zapewnia wgląd w zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w terapii urazowych uszkodzeń mózgu, może być również wykorzystywana do badania nieurazowych uszkodzeń mózgu. W przypadku znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych super paramagnetycznym tlenkiem żelaza, dodaj sześć mililitrów pożywki do 80% zlewającej się hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych w kolbie T 75 na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego dnia ostrożnie odessać super natant i umyć komórki dwa razy sześcioma mililitrami PBS na pranie. Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie oznakowane, sprawdź kulturę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby wywołać uraz CCI, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, użyj elektronicznych maszynek do strzyżenia, aby zgolić sierść z grzbietowej powierzchni czaszki i kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar sterylnym wacikiem nasączonym jodem.Użyj bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby usunąć jod po ostatnim wymazie i umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej. Zabezpiecz mysz paskami do uszu i nosa i wykonaj 2,5-centymetrowe nacięcie śródstrzałkowe w ogolonej skórze, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki. Za pomocą wacika usuń tkankę pokrywającą czaszkę i czyść powierzchnię czaszki przez 10 sekund bawełnianym wacikiem nasączonym 3% nadtlenkiem wodoru.Osusz czaszkę świeżym wacikiem i za pomocą ołówka narysuj czteromilimetrowy okrąg wokół wybranych współrzędnych na odsłoniętej kości. Za pomocą mikrowiertła wyposażonego w okrągły wiertło o średnicy 0,5 milimetra ostrożnie rozrzedź czaszkę w zaznaczonym okręgu bez wywierania nacisku. Usuń pył kostny za pomocą czystego i suchego bawełnianego wacika i użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie usunąć powstały płat kostny.Po odsłonięciu opony twardej przenieś mysz do ramy stereotaktycznej urządzenia CCI i zabezpiecz zwierzę za pomocą pasków do uszu i nosa tak, aby głowa znajdowała się poziomo w kierunku rostrocaudalnym. Postępując zgodnie z instrukcjami na skrzynce sterowniczej, wyzeruj końcówkę udaru do odsłoniętej powierzchni kory mózgowej za pomocą kół sterujących X i Y na podstawie impaktora, aby wyrównać końcówkę udaru bezpośrednio nad żądanymi współrzędnymi kory, które mają zostać uderzone. Użyj skrzynki kontrolnej, aby ustawić parametry eksperymentu na prędkość pięciu metrów na sekundę, czas przebywania 250 milisekund i głębokość urazu wynoszącą jeden milimetr, aby wywołać łagodne obrażenia.Następnie naciśnij przycisk uderzeniowy na skrzynce sterowniczej. Przetrzyj wszelkie krwawienia, które wystąpią, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika i wyjmij mysz z ramy. Zamknij nacięcie jedwabnymi szwami chirurgicznymi i nałóż miejscowe antybiotyki na miejsce przed umieszczeniem myszy na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.Dzień po urazie potraktuj super paramagnetyczną hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych znakowaną tlenkiem żelaza trzema mililitrami trypsyny. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza rozpocznij reakcję z siedmioma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki DMEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i zbierz zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Osadzaj komórki przez odwirowanie i ponownie zawieszaj osad w PBS w celu zliczenia.Następnie dostosuj stężenie komórek do 1,5 razy 10 do pięciu komórek na 18 mikrolitrów PBS. W przypadku dostarczania komórek, po potwierdzeniu braku odpowiedzi na szczypanie palca, należy potrząsnąć myszą podczas unieruchamiania czaszki. Umieść końcówkę pipety zawierającej cztery jednostki hialuronidazy na mikrolitr PBS w pobliżu nosa myszy pod kątem 45 stopni i podaj trzy mikrolitry zawiesiny hialuronidazy do każdego nozdrza.Umieść zwierzę twarzą do góry na czystej podkładce na pięć minut, a następnie powtórz zabieg cztery razy, co daje w sumie 100 jednostek leczenia hialuronidazą. Po ostatnim zabiegu umieść mysz z powrotem na podkładce na 30 minut, a następnie unieruchom, jak pokazano. Z unieruchomioną głową podawać trzy mikrolitry zawiesiny mezenchymalnych komórek macierzystych do każdego nozdrza przez okres trzech sekund na podanie roztworu, przytrzymując mysz w tej pozycji przez 30 sekund, aż krople próbki całkowicie znikną.Po dwóch minutach powtórz podawanie do trzech razy, aż zostanie dostarczona cała objętość mezenchymalnych komórek macierzystych. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Aby śledzić migrację mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą rezonansu magnetycznego, umieść znieczuloną mysz na uchwycie obrazowania kamery MR.Następnie zabezpiecz zwierzę na miejscu i przesuń uchwyt na środek cewki MRI. Ustaw czas powtarzania na 1500 milisekund, a czas echa na 2,8 milisekundy. Następnie ustaw pole widzenia na 16 na 16 milimetrów, matrycę akwizycji na 128 na 128, a grubość warstwy na 0,75 na 0,8 milimetra z czterema średnimi sygnałami i kątem obrotu o 90 stopni, aby uzyskać skany ważone gwiazdą T2 za pomocą sekwencji echa spinowego.Po zakończeniu skanowania wycofaj uchwyt myszy ze środka cewki MRI i umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Aby śledzić i określić ilościowo oznaczone mezenchymalne komórki macierzyste na obrazach T2 ważonych gwiazdą, otwórz dane w oprogramowaniu IT Case Snap i wybierz aktywną etykietę. Aby stworzyć segmentacje obszarów hipointensywnych i uszkodzenia lub innych interesujących części mózgu, używając różnych kolorów etykiet dla każdego segmentu.Użyj narzędzia wielokąta na głównym pasku narzędzi, aby wybrać obszary hipointensywne, które reprezentują super paramagnetyczne mezenchymalne komórki macierzyste oznaczone tlenkiem żelaza i kliknij przycisk Akceptuj. Segmentowane obszary będą wyświetlane w tym samym kolorze, co aktywna etykieta przypisana do tego konkretnego segmentu. Gdy wszystkie wycinki zostaną podzielone na segmenty, użyj narzędzia skalpela, aby opracować mapę 3D segmentowanych obszarów, aby przedstawić rozmieszczenie mezenchymalnych komórek macierzystych w całym mózgu.Aby przeprowadzić analizę ilościową średniej objętości i intensywności podzielonych na segmenty obszarów hipointensywnych reprezentujących znakowane komórki, kliknij segmentację i wybierz objętość i statystyki. 24 godziny po podaniu donosowym, super paramagnetyczne mezenchymalne komórki macierzyste znakowane tlenkiem żelaza są wykrywane jako silne obszary hipointensywne przyśrodkowo do uszkodzenia kory mózgowej na obrazach ważonych gwiazdą T2, wskazujące na ukierunkowaną migrację super paramagnetycznego tlenku żelaza do miejsca urazu. Migracja ta pozostaje widoczna do 14 dni po dostawie bez zauważalnego zmniejszenia sygnału.Ranne zwierzęta leczone PBS nie wykazują obszarów hipointensywnych w żadnym momencie, co wskazuje, że obserwowane obszary hipointensywne odpowiadają super paramagnetycznym mezenchymalnym komórkom macierzystym znakowanym tlenkiem żelaza i nie są spowodowane artefaktami sygnałowymi. Biodystrybucję znakowanych mezenchymalnych komórek macierzystych można uwidocznić za pomocą rekonstrukcji 3D, histologicznie za pomocą barwienia błękitem pruskim lub przez detekcję kwitnienia super paramagnetycznego tlenku żelaza znakowanego FITC w znakowanych mezenchymalnych komórkach macierzystych. Pamiętaj, aby zweryfikować wyniki MRI za pomocą estologii lub innych metod.Jako super magnetyczny tlenek żelaza cząsteczki mogą pozostać w tkankach po śmierci komórki, co prowadzi do fałszywie dodatnich sygnałów. Po tej procedurze można zastosować możliwe nieinwazyjne śledzenie w kwantyfikacji, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące doskonalenia zdolności i zatrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych w mózgu. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się medycyną regeneracyjną do zbadania metod poprawy doskonalenia komórek w określonych obszarach mózgu.

tracking-superparamagnetic-iron-oxide-labeled-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.

Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Źródło: Shahror, R. A. et al., Tracking Superparamagnetic iron oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranosal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia donosowe podawanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w modelu mysim. MSCs wchłaniają się do tkanki nosowej, migrują do mózgu za pośrednictwem sygnałów cytokin i wydzielają czynniki neurotroficzne w miejscu urazu, oferując potencjał neuroterapeutyczny do naprawy...

Donosowe podawanie mezenchymalnych komórek macierzystych w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Poznaj metodę nieinwazyjnego podawania i śledzenia mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza w mózgu myszy po urazie. Technika MRI umożliwia monitorowanie migracji komórek.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu (Wideo) | JoVE Journal

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Przeglądaj więcej filmów