Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Metoda ta może pomóc w określeniu rozkładu zasad lobitycznej komórki macierzystej po dostarczeniu donosowym do mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia nieinwazyjne dostarczanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych do mózgu. Możliwe są również wielokrotne dawki, aby zmaksymalizować efekty terapeutyczne przeszczepionych komórek w fazie przewlekłej po urazach.

Technika ta maksymalizuje liczbę komórek dostarczanych do miejsca urazu i minimalizuje progresję komórek lobitowych do innych tkanek. Chociaż technika ta zapewnia wgląd w zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w terapii urazowych uszkodzeń mózgu, może być również wykorzystywana do badania nieurazowych uszkodzeń mózgu. W przypadku znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych super paramagnetycznym tlenkiem żelaza, dodaj sześć mililitrów pożywki do 80% zlewającej się hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych w kolbie T 75 na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia ostrożnie odessać super natant i umyć komórki dwa razy sześcioma mililitrami PBS na pranie. Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie oznakowane, sprawdź kulturę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby wywołać uraz CCI, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, użyj elektronicznych maszynek do strzyżenia, aby zgolić sierść z grzbietowej powierzchni czaszki i kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar sterylnym wacikiem nasączonym jodem.

Użyj bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby usunąć jod po ostatnim wymazie i umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej. Zabezpiecz mysz paskami do uszu i nosa i wykonaj 2,5-centymetrowe nacięcie śródstrzałkowe w ogolonej skórze, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki. Za pomocą wacika usuń tkankę pokrywającą czaszkę i czyść powierzchnię czaszki przez 10 sekund bawełnianym wacikiem nasączonym 3% nadtlenkiem wodoru.

Osusz czaszkę świeżym wacikiem i za pomocą ołówka narysuj czteromilimetrowy okrąg wokół wybranych współrzędnych na odsłoniętej kości. Za pomocą mikrowiertła wyposażonego w okrągły wiertło o średnicy 0,5 milimetra ostrożnie rozrzedź czaszkę w zaznaczonym okręgu bez wywierania nacisku. Usuń pył kostny za pomocą czystego i suchego bawełnianego wacika i użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie usunąć powstały płat kostny.

Po odsłonięciu opony twardej przenieś mysz do ramy stereotaktycznej urządzenia CCI i zabezpiecz zwierzę za pomocą pasków do uszu i nosa tak, aby głowa znajdowała się poziomo w kierunku rostrocaudalnym. Postępując zgodnie z instrukcjami na skrzynce sterowniczej, wyzeruj końcówkę udaru do odsłoniętej powierzchni kory mózgowej za pomocą kół sterujących X i Y na podstawie impaktora, aby wyrównać końcówkę udaru bezpośrednio nad żądanymi współrzędnymi kory, które mają zostać uderzone. Użyj skrzynki kontrolnej, aby ustawić parametry eksperymentu na prędkość pięciu metrów na sekundę, czas przebywania 250 milisekund i głębokość urazu wynoszącą jeden milimetr, aby wywołać łagodne obrażenia.

Następnie naciśnij przycisk uderzeniowy na skrzynce sterowniczej. Przetrzyj wszelkie krwawienia, które wystąpią, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika i wyjmij mysz z ramy. Zamknij nacięcie jedwabnymi szwami chirurgicznymi i nałóż miejscowe antybiotyki na miejsce przed umieszczeniem myszy na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.

Dzień po urazie potraktuj super paramagnetyczną hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych znakowaną tlenkiem żelaza trzema mililitrami trypsyny. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza rozpocznij reakcję z siedmioma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki DMEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i zbierz zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Osadzaj komórki przez odwirowanie i ponownie zawieszaj osad w PBS w celu zliczenia.

Następnie dostosuj stężenie komórek do 1,5 razy 10 do pięciu komórek na 18 mikrolitrów PBS. W przypadku dostarczania komórek, po potwierdzeniu braku odpowiedzi na szczypanie palca, należy potrząsnąć myszą podczas unieruchamiania czaszki. Umieść końcówkę pipety zawierającej cztery jednostki hialuronidazy na mikrolitr PBS w pobliżu nosa myszy pod kątem 45 stopni i podaj trzy mikrolitry zawiesiny hialuronidazy do każdego nozdrza.

Umieść zwierzę twarzą do góry na czystej podkładce na pięć minut, a następnie powtórz zabieg cztery razy, co daje w sumie 100 jednostek leczenia hialuronidazą. Po ostatnim zabiegu umieść mysz z powrotem na podkładce na 30 minut, a następnie unieruchom, jak pokazano. Z unieruchomioną głową podawać trzy mikrolitry zawiesiny mezenchymalnych komórek macierzystych do każdego nozdrza przez okres trzech sekund na podanie roztworu, przytrzymując mysz w tej pozycji przez 30 sekund, aż krople próbki całkowicie znikną.

Po dwóch minutach powtórz podawanie do trzech razy, aż zostanie dostarczona cała objętość mezenchymalnych komórek macierzystych. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Aby śledzić migrację mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą rezonansu magnetycznego, umieść znieczuloną mysz na uchwycie obrazowania kamery MR.

Następnie zabezpiecz zwierzę na miejscu i przesuń uchwyt na środek cewki MRI. Ustaw czas powtarzania na 1500 milisekund, a czas echa na 2,8 milisekundy. Następnie ustaw pole widzenia na 16 na 16 milimetrów, matrycę akwizycji na 128 na 128, a grubość warstwy na 0,75 na 0,8 milimetra z czterema średnimi sygnałami i kątem obrotu o 90 stopni, aby uzyskać skany ważone gwiazdą T2 za pomocą sekwencji echa spinowego.

Po zakończeniu skanowania wycofaj uchwyt myszy ze środka cewki MRI i umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Aby śledzić i określić ilościowo oznaczone mezenchymalne komórki macierzyste na obrazach T2 ważonych gwiazdą, otwórz dane w oprogramowaniu IT Case Snap i wybierz aktywną etykietę. Aby stworzyć segmentacje obszarów hipointensywnych i uszkodzenia lub innych interesujących części mózgu, używając różnych kolorów etykiet dla każdego segmentu.

Użyj narzędzia wielokąta na głównym pasku narzędzi, aby wybrać obszary hipointensywne, które reprezentują super paramagnetyczne mezenchymalne komórki macierzyste oznaczone tlenkiem żelaza i kliknij przycisk Akceptuj. Segmentowane obszary będą wyświetlane w tym samym kolorze, co aktywna etykieta przypisana do tego konkretnego segmentu. Gdy wszystkie wycinki zostaną podzielone na segmenty, użyj narzędzia skalpela, aby opracować mapę 3D segmentowanych obszarów, aby przedstawić rozmieszczenie mezenchymalnych komórek macierzystych w całym mózgu.

Aby przeprowadzić analizę ilościową średniej objętości i intensywności podzielonych na segmenty obszarów hipointensywnych reprezentujących znakowane komórki, kliknij segmentację i wybierz objętość i statystyki. 24 godziny po podaniu donosowym, super paramagnetyczne mezenchymalne komórki macierzyste znakowane tlenkiem żelaza są wykrywane jako silne obszary hipointensywne przyśrodkowo do uszkodzenia kory mózgowej na obrazach ważonych gwiazdą T2, wskazujące na ukierunkowaną migrację super paramagnetycznego tlenku żelaza do miejsca urazu. Migracja ta pozostaje widoczna do 14 dni po dostawie bez zauważalnego zmniejszenia sygnału.

Ranne zwierzęta leczone PBS nie wykazują obszarów hipointensywnych w żadnym momencie, co wskazuje, że obserwowane obszary hipointensywne odpowiadają super paramagnetycznym mezenchymalnym komórkom macierzystym znakowanym tlenkiem żelaza i nie są spowodowane artefaktami sygnałowymi. Biodystrybucję znakowanych mezenchymalnych komórek macierzystych można uwidocznić za pomocą rekonstrukcji 3D, histologicznie za pomocą barwienia błękitem pruskim lub przez detekcję kwitnienia super paramagnetycznego tlenku żelaza znakowanego FITC w znakowanych mezenchymalnych komórkach macierzystych. Pamiętaj, aby zweryfikować wyniki MRI za pomocą estologii lub innych metod.

Jako super magnetyczny tlenek żelaza cząsteczki mogą pozostać w tkankach po śmierci komórki, co prowadzi do fałszywie dodatnich sygnałów. Po tej procedurze można zastosować możliwe nieinwazyjne śledzenie w kwantyfikacji, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące doskonalenia zdolności i zatrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych w mózgu. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się medycyną regeneracyjną do zbadania metod poprawy doskonalenia komórek w określonych obszarach mózgu.