Name: Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy biocząstek do analizy chemotaktycznej roju ludzkich neutrofili in vitro. Technika umożliwia ilościowe obrazowanie migracji komórek i dostęp do uwalnianych mediatorów zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Departamentu Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej Williama G. Lowrie oraz Kompleksowego Centrum Raka na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Dane przedstawione w tym raporcie pochodzą z obrazów przetworzonych za pomocą Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) dostępnego w Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Placówka ta jest częściowo wspierana przez grant P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Autorzy dziękują zdrowym ochotnikom, którzy uprzejmie oddali swoją krew. Próbki krwi zostały pobrane po świadomej zgodzie ochotników zgodnie z protokołem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) #2018H0268 zweryfikowanym przez Komitet Nauk Biomedycznych na Uniwersytecie Stanowym Ohio.
1. Mikrofabrykacja mikromacierzy biocząstek
<ol>
	<li>Korzystając ze standardowych procedur fotolitografii, wygeneruj główną płytkę krzemową.
	<ol>
		<li>Wygeneruj dowód pożądanego projektu za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), a następnie wyślij do producenta fotomaski w celu wyprodukowania chromowanej fotomaski. Zastosowana tutaj konstrukcja to prostokątne tablice o wymiarach 4 mm x 4 mm i średnicy 30 μm wypełnione okręgami o rozstawie 150 μm od środka do środka. Ten projekt można dowolnie modyfikować dla różnych zastosowań.</li>
		<li>Pokryj warstwę ujemnego fotorezystu o grubości 40 μm na płytce krzemowej. Wafelek pieczemy w temperaturze 65°C przez 5 minut, a wafelek w temperaturze 95°C przez 10 minut.</li>
		<li>Wystaw wafel na działanie światła UV przez chromowaną fotomaskę o mocy 150–160 mJ/cm2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Wafel pieczemy w temperaturze 65 °C przez 5 min i w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Zanurz wafel w wywoływaczu fotorezystu na 10 min i spłucz alkoholem izopropylowym. Na tym etapie wzór powinien być widoczny na płytce (Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu w stosunku 10:1 i jego utwardzacz (tj. 20 g prepolimeru i 2 g utwardzacza) i wlać nieutwardzoną mieszaninę polidimetylosiloksanu (PDMS) na płytkę wzorcową na szalce Petriego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Nieutwardzoną mieszaninę PDMS należy poddać próżni, aż nad płytką wzorcową nie będzie pęcherzyków powietrza. Utwardzać w temperaturze 65 °C przez noc.</li>
	<li>Za pomocą skalpela przeciąć zewnętrzną część wzorzystej części wafla i powoli usunąć utwardzoną płytę PDMS. Umieść płytę PDMS na czystej desce do krojenia wzorzystą stroną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Wybij poszczególne stemple z płyty PDMS za pomocą stempla do biopsji o średnicy 8 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Na jedno szkiełko podstawowych potrzebnych będzie osiem pieczątek.</li>
	<li>Umieść każdy stempel stroną zadrukowaną do dołu na taśmie samoprzylepnej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wcześniej przygotuj 1,6 mg/ml roztworu CP w wodzie.
	<ol>
		<li>Dodaj odpowiednią ilość proszku CP do wody (np. 0,8 g do 500 ml).</li>
		<li>Mieszaj na talerzu mieszającym w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu, gdy całe ciało stałe rozpuści się w wodzie. Roztwór CP można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 6 miesięcy.</li>
		<li>W razie potrzeby należy sprawić, aby roztwór CP był fluorescencyjny, dodając poli-L-lizynę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (PLL-FITC).
		<ol>
			<li>Podwielokrotność około 10 ml roztworu CP. Dodać niewielką ilość PLL-FITC (0,05 mg) do podanej objętości. Ilość można zmienić, aby dostosować jasność fluorescencji zgodnie z potrzebami.</li>
			<li>Wirować roztwór CP oznaczony FITC przez 20 s lub do momentu, gdy roztwór uzyska jednolity, bladożółty kolor. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ze stemplami skierowanymi do góry, zagruntować każdy stempel 100 μl roztworu CP 1,6 mg/ml, upewniając się, że między roztworem CP a stemplem nie tworzą się pęcherzyki powietrza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Odwróć stemple na warstwę roztworu CP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Usunąć stemple z roztworu CP po 1 godzinie.</li>
	<li>Przetrzyj każdą mokrą stempel stroną zadrukowaną w dół na czystym szklanym szkiełku 6–8 razy, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Pieczątki należy poddać obróbce próżniowej przez 1–2 minuty.</li>
	<li>Przyklej ośmiodołkową przekładkę obrazową o średnicy 9 mm na górze czystego szkiełka jako prowadnicę do umieszczania stempla. Dzięki tej ramce dystansowej każde szkiełko może mieć osiem mikroukładów.</li>
	<li>Umieść stempel stroną zadrukowaną do dołu na szkiełku podstawowym pośrodku każdej studzienki przekładki obrazowej (tj. użyj łącznie ośmiu stempli).</li>
	<li>Umieść zrównoważoną odważnik o wadze 5,6 ± 0,1 g na wierzchu każdego stempla i odczekaj 10 minut na stemplowanie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H). Wymagana jest zrównoważona waga, aby zapewnić równomierne dociśnięcie stempla do szkiełka podstawowego i zapewnić równomierne przeniesienie CP na szkiełko</li> podstawowe.
	<li>Usuń odważniki i stemple ze szkiełka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). Pozostaw warstwę CP do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed dodaniem bioczęści, jak opisano w kroku 1.17. Jeśli CP jest oznaczony FITC, skuteczność stemplowania można sprawdzić w tym momencie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 488 nm przed przejściem do kroku 1.17 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1M).</li>
	<li>Przytnij pustą płytę PDMS do rozmiaru przekładki obrazowania i użyj stempla do biopsji 8 mm, aby utworzyć dołki w PDMS, które są wyrównane z dołkami przekładki do obrazowania. Przyklej płytę PDMS do szkiełka za pomocą przekładki obrazowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J).</li>
	<li>Rozmrozić roztwór biocząstek (np. E. coli lub zymozan) i rozcieńczyć do 500 μg/ml w wodzie do wstrzykiwań (WFI). 
	UWAGA: Biocząstki nie muszą być opsonizowane. Receptory powierzchniowe neutrofili bezpośrednio rozpoznają cząsteczki na tych biocząstkach19,20,21.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu biocząstek do każdej studzienki PDMS na szkiełku podstawowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1K).</li>
	<li>Kołysz szklaną zjeżdżalnią przez 30 minut.</li>
	<li>Dokładnie spłucz studzienki wodą. Mikromacierz biocząstek może być przechowywana w środowisku wolnym od pyłu w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. W tym momencie wzór należy sprawdzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy długości fali 594 nm przed przejściem do kroku 2.1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1N).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pobrać co najmniej 2 ml świeżej krwi w probówkach K2-EDTA od pożądanego dawcy. Oczekiwana wydajność neutrofili wynosi 1–2 x 106 komórek/1 ml krwi pełnej. Test obrazowania wymaga około 1,5 x 105 neutrofili, a analiza supernatantu wymaga 1 x 106 neutrofili. Zużyć krew w ciągu 4 godzin.</li>
	<li>Oddziel czerwone krwinki (RBC), dodając środek agregujący erytrocyty w stosunku 1:5 do krwi pełnej. Odczekaj 45 minut, aż półprzezroczysta warstwa (kożuchowa sierść) oddzieli się od warstwy erytrocytów.</li>
	<li>Usunąć płaszcz kożuchowy i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą 1 ml kożucha kożuchowego: 9 ml PBS.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 190 x g i temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w stężeniu 5 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Użyj zestawu do ujemnej selekcji immunomagnetycznej, aby wyizolować neutrofile.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał/1 ml zawiesiny komórek. Odczekaj 10 min.</li>
		<li>Dodać 100 μl kulek magnetycznych/1 ml zawiesiny komórek. Odczekaj 10 min.</li>
		<li>Dodaj zawiesinę komórek do rurki z okrągłym dnem i umieść w cylindrycznym magnesie. Odczekaj 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać supernatant do probówki wirówkowej. Dodaj do 10 ml PBS. Wirować przez 5 minut w temperaturze 190 x g i temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Aspirowany supernatant. Zawiesić biały osad w IMDM z 0,4% albuminą surowicy ludzkiej.</li>
	<li>Wybarwić jądra 20 μg/ml Hoechst 33342 przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 5 ml IMDM z 0,4% albuminą surowicy ludzkiej do spłukania. Wirować przez 5 minut w temperaturze 190 x g i temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zawieś komórki przy 7,5 x 105 komórek/ml w IMDM z 0,4% albuminą surowicy ludzkiej.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do studzienki PDMS zawierającej mikromacierz biocząstek. Upewnij się, że zawiesina komórek jest dobrze wypukła nad górną częścią PDMS i nie zawiera żadnych pęcherzyków.</li>
	<li>Uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm. Przykryj otwór PDMS szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe pęsetą, aby nadmiar zawiesiny komórkowej uciekł do krawędzi studzienki. Użyj chusteczki, aby usunąć nadmiar zawiesiny komórek.</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie testu i analizy obrazu
<ol>
	<li>Załaduj matrycę mikrocząstek z komórkami na stacji obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopu wyposażonego w inkubator klatkowy ustawiony na 37 °C, 5% CO2 i 90% wilgotności względnej.</li>
	<li>Użyj poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej i jasnego pola, aby rejestrować obrazy w 10-krotnym powiększeniu co 10 s przy 405 nm, 594 nm i jasnym polu. W typowym eksperymencie obrazy są zbierane do 2 godzin.</li>
	<li>Użyj zautomatyzowanego oprogramowania do śledzenia komórek, aby śledzić migrację poszczególnych neutrofili w kierunku klastra biocząstek.
	<ol>
		<li>Użyj trybu autoregresji oprogramowania do śledzenia komórek do wykrywania plam. Ustaw promień plamki na 5 μm (przybliżony rozmiar jądra neutrofili). Ustaw minimalną długość ścieżki na 120 s i maksymalny rozmiar odstępu na jedną klatkę.</li>
		<li>Z danych wygenerowanych przez oprogramowanie do śledzenia komórek wyodrębnij pliki zawierające pozycję i prędkość neutrofili. Pliki te mogą być używane z oprogramowaniem do tworzenia wykresów do generowania ścieżek migracji neutrofili (odpowiednio <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C) oraz mapy cieplnej prędkości w funkcji czasu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj obrazów fluorescencyjnych 405 nm, aby śledzić wielkość roju w czasie w wybranym oprogramowaniu do analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) wokół każdego klastra biocząstek, w którym roi się od neutrofili. Zachowaj ten sam rozmiar zwrotu z inwestycji, aby przeanalizować każdy klaster biocząstek.</li>
		<li>Przeanalizuj średnią intensywność fluorescencyjną obrazów 405 nm w ramach każdego zwrotu z inwestycji w czasie.</li>
		<li>Wygeneruj krzywą kalibracyjną średniej intensywności fluorescencji do wielkości roju, wykonując ręczne pomiary przy różnych rozmiarach roju od 0 μm2 do maksymalnej wielkości roju. Użyj tej kalibracji, aby obliczyć wielkość roju w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zbieranie supernatantów i wykrywanie białek
<ol>
	<li>Inkubować neutrofile w studzienkach zawierających mikromacierz biocząstek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny. Pobieraj próbki w żądanych punktach czasowych. Zazwyczaj próbki pobiera się po 0, 0,5, 1 i 3 godzinach. Aby przekroczyć granicę wykrywalności w teście macierzy białkowej, dla każdego punktu czasowego użyto całej objętości supernatantu z pojedynczego dołka (200 μl). Każdy punkt czasowy był analizowany w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu jasnego pola sprawdź, czy na mikromacierzy tworzą się roje.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl i załadować do probówki filtracyjnej wirówki o wielkości 0,45 μm.</li>
	<li>Odwirować supernatant w temperaturze 190 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut i zebrać przefiltrowaną objętość.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetwarzania.</li>
	<li>Użyj zestawu mikromacierzy, który wykrywa szereg ludzkich białek do przetwarzania próbek.
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl każdej próbki do oddzielnej rurki dializacyjnej dostarczonej z zestawem.</li>
		<li>Umieścić probówki dializacyjne w zlewce zawierającej co najmniej 500 ml PBS (pH = 8,0). Mieszać delikatnie na płytce mieszającej przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 4 °C. Zmienić PBS w zlewce i powtórzyć ten krok.</li>
		<li>Przenieść każdą próbkę do czystej probówki wirówkowej i odwirować przy 9 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia wszelkich osadów. Przenieść każdy supernatant do czystej probówki.</li>
		<li>Biotynylować każdą próbkę, dodając 36 μl 1x odczynnika znakującego z zestawu na 1 mg białka całkowitego w dializowanej próbce do 180 μl dializowanej próbki. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min. Mieszaj delikatnie co 5 minut.</li>
		<li>Do każdej probówki z próbką dodać 3 μl roztworu zatrzymującego dostarczonego z zestawem. Przenieść każdą próbkę do świeżej probówki dializacyjnej i powtórzyć czynności 4.6.2–4.6.3. Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C lub -80 °C, aż do momentu, gdy będziesz gotowy do kontynuowania.</li>
		<li>Szkiełko podstawowe dołączone do zestawu jest przechowywane w temperaturze -20 °C. Pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową. Zmontowany szkiełko należy umieścić w okapie z przepływem laminarnym na 1–2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 400 μl buforu blokującego dostarczonego z zestawem do każdej studzienki zmontowanego szkiełka podstawowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Odwirować przygotowane próbki przez 5 minut przy 9 000 x g w celu usunięcia osadów lub cząstek stałych. Rozcieńczyć 5x buforem blokującym.</li>
		<li>Usuń bufor blokujący z każdej studzienki. Dodać 400 μl rozcieńczonych próbek do odpowiednich studzienek. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej podczas kołysania.</li>
		<li>Zdekantować próbki z każdej studzienki. Umyj 3x 800 μL 1x buforu do mycia, który dostarczyłem wraz z zestawem, w temperaturze pokojowej przez 5 min podczas bujania.</li>
		<li>W czystym pojemniku zanurz zmontowane szkiełko w 1x buforze myjącym I. Myj 2x w temperaturze pokojowej przez 5 min każdy podczas kołysania.</li>
		<li>Dodaj 400 μl 1x streptawidyny sprzężonej z Cy3 do każdej podmacierzy. Przykryj plastikowymi paskami samoprzylepnymi. Chronić przed światłem przez pozostałą część protokołu.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej podczas kołysania.</li>
		<li>Zdekantować roztwór i zdemontować szkiełko podstawowe z komór na próbki.</li>
		<li>W probówce wirówkowej o pojemności 30 ml dołączonej do zestawu ostrożnie dodaj szkiełko szklane i wystarczającą ilość 1x buforu do płukania I, aby przykryć szklane szkiełko. Prać 3x po 10 min w temperaturze pokojowej podczas bujania.</li>
		<li>W probówce wirówkowej o pojemności 30 ml przemyć 2x z 1x buforem płuczącym II przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej podczas kołysania.</li>
		<li>Umyć szkiełko 30 ml ddH2O przez 5 minut. Wyjmij szkiełko z probówki wirówkowej i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut w okapie z przepływem laminarnym. Tak przygotowane szkiełko podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do skanowania.</li>
		<li>Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera mikromatrycowego przy emisji fluorescencji 555 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li>
<li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li>
<li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Gout%3A+Observations+over+a+Half-Century%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li>
<li>Reátegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li>
<li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li>
<li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li>
<li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Bench%3A+Neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair%3A+going+forward+in+reverse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Arraying+neutrophils+in+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li>
<li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li>
<li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Cancer%3A+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+Key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li>
<li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+of+Fungal+Infections%22%5BJournal%5D)">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li>
<li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li>
<li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li>
<li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+inflammation%3A+intercellular+signal+relay+and+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li>
<li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li>
<li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li>
<li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li>
<li>Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%3A+An+open-ended+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li>
<li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opracowaliśmy platformę do mikrostemplowania w celu wygenerowania jednolitych układów biocząstek w celu stymulowania roju neutrofili in vitro. Charakter in vitro naszej platformy pozwala nam obejść komplikacje, które pojawiają się podczas eksperymentów z rojem in vivo, a mianowicie słabą zdolność do analizy mediatorów uwalnianych przez roje neutrofili5. Ponadto modele in vivo są zwykle wykonywane na gryzoniach 11,12,13,15,22,23 lub danio pręgowanym <s...

Neutrofile, najliczniejsza liczba białych krwinek w krwiobiegu1, zyskują na popularności jako potencjalne cele diagnostyczne i terapeutyczne2,3 ponieważ mogą być zaangażowane w różne schorzenia, w tym dnę moczanową4, sepsa3, trauma5,6, rak1,7,8, oraz różne choroby autoimmunologiczne5,9. Roj neutrofili jest wieloetapowym, ściśle regulowanym procesem, którego złożoność sprawia, że jest szczególnie interesującym przedmiotem badań5,10,11. Podczas roju neutrofile izolują miejsce zapalenia od otaczającej zdrowej tkanki5,10,11. Właściwa regulacja roju neutrofili jest niezbędna do przyspieszenia gojenia się ran i ostatecznie rozwiązania stanu zapalnego5,12. Rój neutrofili badano przede wszystkim in vivo u gryzoni12,13,14,15 i danio pręgowany10,11,12,15 modeli. Jednak natura tych modeli zwierzęcych in vivo powoduje ograniczenia5. Na przykład mediatory uwalniane przez neutrofile podczas roju nie są łatwo dostępne do analizy5. Dodatkowo, istnieje wiele potencjalnych źródeł dla danego mediatora in vivo, więc eksperyment in vivo musi wprowadzić niedobór genetyczny, aby zahamować produkcję komórkową i/lub interakcję, aby zbadać rolę tego mediatora w danym procesie13. Eksperyment in vitro pozwala obejść to powikłanie, umożliwiając obserwację neutrofili bez kontekstu dodatkowych komórek. Dodatkowo, badania opisujące ludzką migrację skoordynowaną przez neutrofile są ograniczone16. Na platformie roju in vitro ludzkie neutrofile mogą być bezpośrednio analizowane. Platforma do rojowania in vitro mogłaby poszerzyć wiedzę uzyskaną z badań in vivo, stwarzając możliwości wypełnienia luk powstałych w wyniku ograniczeń badań in vivo.
Aby zaspokoić zapotrzebowanie na platformę in vitro, która naśladuje rój neutrofili in vivo, opracowaliśmy platformę mikrostemplowania, która umożliwia nam tworzenie mikroukładów biocząstek, które stymulują roj neutrofili w sposób kontrolowany przestrzennie. Mikromacierze biocząstek na szkiełkach podstawowych generujemy w dwuetapowym procesie. Najpierw używamy mikrotłoczenia do wygenerowania mikromacierzy plamek kationowego polielektrolitu (CP). Po drugie, dodajemy roztwór biocząstek, które przylegają do plamek CP poprzez oddziaływanie elektrostatyczne. Najpierw modelując warstwę CP, możemy selektywnie modelować ujemnie naładowane biocząstki, aby wygenerować pożądany wzór roju neutrofili. Dodatnio naładowana warstwa utrzymuje ujemnie naładowane biocząstki przez energiczny etap mycia, który usuwa biocząstki z obszarów na szkiełku, które nie mają CP. Dodatkowo zastosowany tutaj CP, kopolimer akrylamidu i czwartorzędowego monomeru kationowego, jest biokompatybilny, więc nie wywołuje odpowiedzi neutrofili. Ma bardzo wysoki ładunek powierzchniowy, który unieruchamia biocząstki o wielkości mikronów na szkiełku podstawowym, hamując w ten sposób neutrofile przed usuwaniem cząstek z wzorzystej pozycji na szkiełku. W ten sposób powstają klastry biocząstek ułożone w mikromacierz. Kiedy dodaliśmy neutrofile do mikromacierzy, utworzyły one stabilne roje wokół klastrów biocząstek. Śledząc migrację neutrofili, odkryliśmy, że rojące się neutrofile aktywnie migrują w kierunku klastrów biocząstek. Ponadto wykorzystaliśmy tę platformę do analizy niektórych mediatorów, które neutrofile uwalniają podczas roju. Znaleźliśmy 16 mediatorów, które są różnie wyrażane podczas roju. Ich stężenia podążają za trzema ogólnymi trendami w czasie: wzrostem, spadkiem lub wzrostem. Nasza platforma do rojenia neutrofili in vitro ułatwia analizę kontrolowanego przestrzennie roju neutrofili u ludzi, a także gromadzenie i analizę mediatorów uwalnianych w wyniku roju neutrofili. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że pacjenci z pewnymi schorzeniami (uraz, choroba autoimmunologiczna i sepsa) mieli neutrofile, które funkcjonowały inaczej niż ci od zdrowych dawców5. W przyszłych badaniach naukowych nasza platforma może zostać wykorzystana do analizy funkcji neutrofili w różnych populacjach pacjentów. Platforma ta może ilościowo analizować złożoną koordynację związaną z rojem neutrofili. Można przeprowadzić dodatkowe badania, aby uzyskać wgląd w funkcję neutrofili w określonej populacji pacjentów lub odpowiedź neutrofili na patogen będący przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>"The Big Easy" Magnes EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>Magnes do stosowania z zestawem do izolacji neutrofili</td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>Inkubator klatkowy Okolab do kontroli temperatury i CO2</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich neutrofili EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17957</td><td>Zestaw do immunomagnetycznej negatywnej selekcji ludzkich neutrofili</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>Odwrócony mikroskop badawczy</td></tr><tr><td>Escherichia coli (szczep K-12) BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Biocząstki w proszku, rozpuścić w wodzie przed dodaniem do Zetag&reg; array</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji Harris Uni-Core 8 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>Do wycinania znaczków PDMS</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>7906</td><td>Środek agregujący erytrocyty do oddzielania kożuchowca od czerwonych krwinek w świeżej krwi ludzkiej</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Jądro barwnika fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Człowiek L1000 Array</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4</td><td>Macierz o wysokiej gęstości do wykrywania 1000 ludzkich białek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5843</td><td>Niska endotoksyna HSA, do przygotowania 2% roztworów w IMDM dla izolowanych neutrofili</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbeccos Iscove'a (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>Do ponownego zawieszenia izolowanych neutrofili</td></tr><tr><td>K2-EDTA probówki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-657-32</td><td>Probówki do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Niskorefleksyjna chromowana maska fotograficzna</td><td>Przednią maskę fotomaski</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wymiary 5 "x 5" x 0,09 "(dł. x szer. x gł.)</td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy</td><td>Perkin Elmer</td><td>ASCNGX00</td><td>Czytnik fluorescencyjny mikrodomen o wzorze białkowym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu mikroskopowego - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>Oprogramowanie do automatycznej analizy</td></tr> <tr><td>śledzenia komórekPakiet zaawansowanego oprogramowania badawczego NiS Elements</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td>Oprogramowanie do automatycznego obrazowania żywych komórek i obliczania wielkości roju</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny poli-L-lizyny (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30 000 - 70 000 MW PLL oznaczony FITC, używany do fluorescencyjnego znakowania roztworu CP</td></tr><tr><td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8-dołkowa, średnica 9 mm, adhezyjna przekładka</td></tr><tr><td>obrazowa Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>590</td><td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &mu; m Test SSP</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td>Służy do przędzenia 40-&mikro; m warstwa fotorezystu na wafli krzemowej</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>Ujemny fotorezystor do produkcji wafla krzemowego</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Photoresist developer. Usuń nieusieciowany SU-8 2025 z płytki krzemowej</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (polidimetylosiloksan, PDMS)</td> <td>Dow</td><td>1673921</td><td>2-częściowy zestaw elastomerów silikonowych do wykonywania mikroznaczków i studzienek PDMS</td></tr><tr><td>System maskowania ekspozycji UV</td><td>Klo&eacute;</td><td>UV-KUB 2</td><td>Służy do sieciowania fotorezystu na płytce krzemowej przez chromowaną maskę ze światłem UV</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1287303</td><td>Wysokiej jakości woda do rozcieńczania biocząstek</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>Kationowy polielektrolit (CP), proszek, kopolimer akrylamidu i czwartorzędowego monomeru kationowego, po rozpuszczeniu w wodzie</td></tr> <tr><td>tworzy "roztwór farbowy" do mikrotłoczeniaZymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red sprzęgany</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Biocząstki w proszku, rozpuścić w wodzie przed dodaniem do matrycy Zetag</td></tr></tbody></table>

mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Rój neutrofili to proces współpracy, w którym neutrofile uszczelniają miejsce infekcji i wspomagają reorganizację tkanek. Rój był klasycznie badany in vivo na modelach zwierzęcych wykazujących charakterystyczne wzorce migracji komórek. Jednak modele in vivo mają kilka ograniczeń, w tym mediatory międzykomórkowe, które są trudno dostępne i analizowane, a także brak możliwości bezpośredniej analizy ludzkich neutrofili. Ze względu na te ograniczenia istnieje zapotrzebowanie na platformę in vitro, która bada rojenie się ludzkich neutrofili i zapewnia łatwy dostęp do sygnałów molekularnych generowanych podczas roju. W tym przypadku wieloetapowy proces mikrostemplowania jest wykorzystywany do wygenerowania mikromacierzy biocząstek, która stymuluje rój, naśladując infekcję in vivo. Mikromacierz biocząstek indukuje neutrofile do rojenia się w kontrolowany i stabilny sposób. W mikromacierzy neutrofile zwiększają swoją prędkość i tworzą stabilne roje wokół klastrów biocząstek. Dodatkowo przeanalizowano supernatant generowany przez neutrofile i odkryto, że 16 białek uległo zróżnicowanej ekspresji w trakcie roju. Ta platforma do badania in vitro ułatwia bezpośrednią analizę migracji neutrofili i uwalniania białek w powtarzalny, przestrzennie kontrolowany sposób.

Po dodaniu neutrofili do mikroarrayu biocząsteczek, neutrofile kontaktujące się z skupiskami biocząsteczek ulegają aktywacji i inicjują odpowiedź w postaci rojenia (swarming). Mikroarray biocząsteczek został zwalidowany przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej w celu śledzenia migracji neutrofili w stronę skupisk biocząsteczek (Video S1). Śledzono migrację poszczególnych jąder neutrofili podczas ich przemieszczania się w kierunku skupiska biocząsteczek. Gdy neutrofile docierają do skupiska bi...

Ten protokół generuje mikromatryce biocząstek, które zapewniają przestrzennie kontrolowane rojenie neutrofili. Zapewnia łatwy dostęp do mediatorów, które uwalniają neutrofile podczas migracji i pozwala na ilościową analizę obrazową.

Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na analizę in vitro roju neutrofili, co pozwala przezwyciężyć wiele ograniczeń wynikających z naszej obecnej niezdolności do eksperymentowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy dostęp do wydzielanych cytokin i mediatorów lipidowych, które neutrofile uwalniają podczas roju oraz pozwala na ilościową analizę obrazową. Chociaż zastosowaliśmy tę technikę do neutrofili, można ją rozszerzyć o analizę migracji innych białych krwinek, takich jak monocyty i limfocyty T.Zacznij od przygotowania 1,6 miligrama na mililitr kationowego polielektrolitu lub roztworu CP, dodając odpowiednią ilość proszku CP do wody i mieszając go na płytce mieszającej przez noc lub do momentu, gdy wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. W razie potrzeby roztwór można uczynić fluorescencyjnym, dodając poli-L-lizynę znakowaną FITC. Wygeneruj główną płytkę krzemową przy użyciu standardowych procedur fotolitografii.Zastosowana tutaj konstrukcja to prostokątny układ o wymiarach cztery na cztery mililitry z wypełnionymi okręgami o średnicy 30 mikrometrów, z odstępami 150 mikrometrów od środka do środka, ale można go modyfikować według potrzeb dla różnych zastosowań. Warstwa ujemnego fotorezystu o grubości 40 mikrometrów nałożona na płytkę krzemową. Następnie piecz wafelek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.I 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wystaw wafel na działanie światła UV przez chromowaną fotomaskę o proporcji od 150 do 160 milidżuli na centymetr kwadratowy. Ponownie piecz wafelek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie zanurz go w wywoływaczu fotorezystu na 10 minut. I spłucz go alkoholem izopropylowym. Wzór powinien być teraz widoczny na wafli.Następnie dokładnie wymieszaj stosunek 10 do jednego prepolimeru polidimetylosiloksanu lub PDMS i jego utwardzacza. I wlej nieutwardzoną mieszaninę na płytkę mistrzowską na szalce Petriego. Nieutwardzoną mieszaninę PDMS należy traktować próżniowo, aż nie będzie żadnych pęcherzyków powietrza.Następnie utwardzamy go przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą skalpela przeciąć zewnętrzną stronę wzorzystej części wafla. I powoli wyjmij utwardzoną płytę PDMS, umieszczając ją na czystej desce do krojenia wzorzystą stroną do góry.Wybij poszczególne stemple z płyty PDMS za pomocą ośmiomilimetrowego stempla do biopsji i umieść każdy stempel zadrukowaną stroną do dołu na taśmie klejącej, aby usunąć zanieczyszczenia. Trzymając te stemple skierowane do góry, zagruntować każdy stempel 100 mikrolitrami wstępnie przygotowanego roztworu CP, upewniając się, że między roztworem a stemplem nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Następnie odwróć stemple na warstwę roztworu CP i usuń je po godzinie.Przetrzyj każdą mokrą stempel stroną zadrukowaną w dół na czystym szkiełku podstawowym sześć do ośmiu razy, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie poddaj stemple obróbce próżniowej przez jedną do dwóch minut. Przyklej ośmiodołkową przekładkę obrazową o średnicy ośmiu milimetrów na czystym szkiełku podstawowym jako prowadnicę do umieszczania stempla.Umieść stempel stroną zadrukowaną do dołu na szkiełku podstawowym pośrodku każdej studzienki przekładki obrazowania. Następnie umieść 5,6 grama zbalansowanego ciężarka na wierzchu każdego stempla i odczekaj 10 minut na stemplowanie. Usuń odważniki i stempele ze szkiełka i pozostaw warstwę CP do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed dodaniem bioczęści.Jeśli CP jest oznaczony FITC, sprawdź skuteczność stemplowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wytnij pustą płytę PDMS do rozmiaru przekładki obrazowania i użyj ośmiomilimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć dołki w PDMS, które są wyrównane z dołkami przekładki. Następnie przyklej płytę PDMS do szkiełka podstawowego.Rozmrozić roztwór biocząstek i rozcieńczyć go do 500 mikrogramów na mililitr w wodzie do wstrzykiwań. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu biocząstek do każdej studzienki PDMS na szklanym szkiełku i kołysz szkiełkiem przez 30 minut. Dokładnie spłucz studzienki wodą i sprawdź wzór na szkiełku za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Mikromacierz biocząstek może być przechowywana w środowisku wolnym od kurzu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy. Przygotuj komórki, zawieszając je ponownie w ilości 7,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr w IMDM z 0,4% ludzkiego białka surowicy. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny do studzienki PDMS zawierającej mikromacierz biocząstek, upewniając się, że zawiesina komórek jest wypukła nad górną częścią studni PDMS i nie zawiera żadnych pęcherzyków.Uszczelnij studzienkę szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 milimetrów i delikatnie dociśnij pęsetą, aby nadmiar zawiesiny komórek uciekł na krawędź studzienki, a następnie użyj chusteczki do usunięcia nadmiaru. Aby zobrazować komórki, załaduj matrycę mikrocząstek z komórkami do stacji obrazowania żywych komórek mikroskopu wyposażonego w inkubator klatkowy ustawiony na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 90% wilgotności względnej. Użyj mikroskopii poklatkowej, fluorescencyjnej i jasnego pola, aby rejestrować obrazy w 10-krotnym powiększeniu co 10 sekund przy 405 nanometrach, 594 nanometrach i jasnym polu.Inkubuj neutrofile w studzienkach z biocząstkami o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny, pobierając próbki w pożądanych punktach czasowych. Użyj mikroskopu jasnego pola, aby sprawdzić, czy na mikromacierzy tworzą się roje. Zbierz całą objętość supernatantu z pojedynczej studzienki i załaduj ją do probówki filtracyjnej wirówki o średnicy 0,45 mikrometra, upewniając się, że analizujesz każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach.Odwirować probówki w temperaturze 190 razy G i 20 stopni Celsjusza przez pięć minut i zebrać przefiltrowaną objętość. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetwarzania. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pracować z fotorezysłem i wywoływaczem w dygestorium.Posiadaj protokół zatwierdzony przez IRB przed pobraniem krwi od dawców. Pamiętaj, że materiały pochodzące z ludzkiej krwi to BSL2. Kiedy neutrofile są dodawane do mikromacierzy biocząstek, neutrofile, które stykają się z klastrami biocząstek, aktywują się i inicjują odpowiedź roju.Mikromacierz biocząstek została zwalidowana za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia migracji neutrofili w kierunku klastrów biocząstek. Stabilne roje neutrofili tworzą się wokół każdej gromady po 30 do 60 minutach ekspozycji. Natomiast neutrofile nie wykazują migracji zbiorowej przy braku klastrów biocząstek.Intensywność fluorescencji barwionych jąder neutrofili wykorzystano do określenia, że średnia wielkość roju wokół klastrów biocząstek wynosiła około 1490 mikrometrów kwadratowych. W przypadku braku klastrów fluorescencja danego obszaru zainteresowania pozostawała stała w czasie. Ślady migracji neutrofili pokazują, że neutrofile zbiegały się w klastrze biocząstek, gdy był obecny, ale nie zaobserwowano żadnej konwergencji w systemie kontrolnym.Zmierzono prędkość roju i nieaktywowanych neutrofili i stwierdzono statystycznie istotną różnicę w rozkładach prędkości. Średnia prędkość roju neutrofili wynosiła 20,6 mikrometra na minutę, podczas gdy średnia prędkość neutrofili kontrolnych wynosiła 2 mikrometry na minutę. Stężenia 16 białek, które uwalniają neutrofile podczas roju, analizowano w czasie.10 białek zwiększyło swoje stężenie. Dwa zmniejszyły się. A pozostałe cztery zwiększyły się w ciągu pierwszej godziny roju, ale potem zmniejszyły się.Wykonując tę procedurę, upewnij się, że wszystko jest czyste, a stemple są odpowiednio wysuszone, ponieważ są one niezbędne do pomyślnego modelowania cząsteczek bakterii. Opracowanie tej techniki umożliwi naukowcom zbadanie nowych pytań w dziedzinie roju neutrofili, w tym tego, w jaki sposób wolne mediatory i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są zaangażowane w komunikację międzykomórkową neutrofili.

bioparticle-microarrays-for-chemotactic-molecular-analysis-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Poznaj metodę mikromacierzy biocząstek do analizy chemotaktycznej roju ludzkich neutrofili in vitro. Technika umożliwia ilościowe obrazowanie migracji komórek i dostęp do uwalnianych mediatorów zapalnych.

Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

Przeglądaj więcej filmów