Mikromacierze biocząstek do chemotaktycznej i molekularnej analizy roju ludzkich neutrofili in vitro

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na analizę in vitro roju neutrofili, co pozwala przezwyciężyć wiele ograniczeń wynikających z naszej obecnej niezdolności do eksperymentowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy dostęp do wydzielanych cytokin i mediatorów lipidowych, które neutrofile uwalniają podczas roju oraz pozwala na ilościową analizę obrazową. Chociaż zastosowaliśmy tę technikę do neutrofili, można ją rozszerzyć o analizę migracji innych białych krwinek, takich jak monocyty i limfocyty T.

Zacznij od przygotowania 1,6 miligrama na mililitr kationowego polielektrolitu lub roztworu CP, dodając odpowiednią ilość proszku CP do wody i mieszając go na płytce mieszającej przez noc lub do momentu, gdy wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. W razie potrzeby roztwór można uczynić fluorescencyjnym, dodając poli-L-lizynę znakowaną FITC. Wygeneruj główną płytkę krzemową przy użyciu standardowych procedur fotolitografii.

Zastosowana tutaj konstrukcja to prostokątny układ o wymiarach cztery na cztery mililitry z wypełnionymi okręgami o średnicy 30 mikrometrów, z odstępami 150 mikrometrów od środka do środka, ale można go modyfikować według potrzeb dla różnych zastosowań. Warstwa ujemnego fotorezystu o grubości 40 mikrometrów nałożona na płytkę krzemową. Następnie piecz wafelek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.

I 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wystaw wafel na działanie światła UV przez chromowaną fotomaskę o proporcji od 150 do 160 milidżuli na centymetr kwadratowy. Ponownie piecz wafelek w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie zanurz go w wywoływaczu fotorezystu na 10 minut. I spłucz go alkoholem izopropylowym. Wzór powinien być teraz widoczny na wafli.

Następnie dokładnie wymieszaj stosunek 10 do jednego prepolimeru polidimetylosiloksanu lub PDMS i jego utwardzacza. I wlej nieutwardzoną mieszaninę na płytkę mistrzowską na szalce Petriego. Nieutwardzoną mieszaninę PDMS należy traktować próżniowo, aż nie będzie żadnych pęcherzyków powietrza.

Następnie utwardzamy go przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą skalpela przeciąć zewnętrzną stronę wzorzystej części wafla. I powoli wyjmij utwardzoną płytę PDMS, umieszczając ją na czystej desce do krojenia wzorzystą stroną do góry.

Wybij poszczególne stemple z płyty PDMS za pomocą ośmiomilimetrowego stempla do biopsji i umieść każdy stempel zadrukowaną stroną do dołu na taśmie klejącej, aby usunąć zanieczyszczenia. Trzymając te stemple skierowane do góry, zagruntować każdy stempel 100 mikrolitrami wstępnie przygotowanego roztworu CP, upewniając się, że między roztworem a stemplem nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Następnie odwróć stemple na warstwę roztworu CP i usuń je po godzinie.

Przetrzyj każdą mokrą stempel stroną zadrukowaną w dół na czystym szkiełku podstawowym sześć do ośmiu razy, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie poddaj stemple obróbce próżniowej przez jedną do dwóch minut. Przyklej ośmiodołkową przekładkę obrazową o średnicy ośmiu milimetrów na czystym szkiełku podstawowym jako prowadnicę do umieszczania stempla.

Umieść stempel stroną zadrukowaną do dołu na szkiełku podstawowym pośrodku każdej studzienki przekładki obrazowania. Następnie umieść 5,6 grama zbalansowanego ciężarka na wierzchu każdego stempla i odczekaj 10 minut na stemplowanie. Usuń odważniki i stempele ze szkiełka i pozostaw warstwę CP do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed dodaniem bioczęści.

Jeśli CP jest oznaczony FITC, sprawdź skuteczność stemplowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wytnij pustą płytę PDMS do rozmiaru przekładki obrazowania i użyj ośmiomilimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć dołki w PDMS, które są wyrównane z dołkami przekładki. Następnie przyklej płytę PDMS do szkiełka

Rozmrozić roztwór biocząstek i rozcieńczyć go do 500 mikrogramów na mililitr w wodzie do wstrzykiwań. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu biocząstek do każdej studzienki PDMS na szklanym szkiełku i kołysz szkiełkiem przez 30 minut. Dokładnie spłucz studzienki wodą i sprawdź wzór na szkiełku za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Mikromacierz biocząstek może być przechowywana w środowisku wolnym od kurzu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy. Przygotuj komórki, zawieszając je ponownie w ilości 7,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr w IMDM z 0,4% ludzkiego białka surowicy. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny do studzienki PDMS zawierającej mikromacierz biocząstek, upewniając się, że zawiesina komórek jest wypukła nad górną częścią studni PDMS i nie zawiera żadnych pęcherzyków.

Uszczelnij studzienkę szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 milimetrów i delikatnie dociśnij pęsetą, aby nadmiar zawiesiny komórek uciekł na krawędź studzienki, a następnie użyj chusteczki do usunięcia nadmiaru. Aby zobrazować komórki, załaduj matrycę mikrocząstek z komórkami do stacji obrazowania żywych komórek mikroskopu wyposażonego w inkubator klatkowy ustawiony na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 90% wilgotności względnej. Użyj mikroskopii poklatkowej, fluorescencyjnej i jasnego pola, aby rejestrować obrazy w 10-krotnym powiększeniu co 10 sekund przy 405 nanometrach, 594 nanometrach i jasnym polu.

Inkubuj neutrofile w studzienkach z biocząstkami o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny, pobierając próbki w pożądanych punktach czasowych. Użyj mikroskopu jasnego pola, aby sprawdzić, czy na mikromacierzy tworzą się roje. Zbierz całą objętość supernatantu z pojedynczej studzienki i załaduj ją do probówki filtracyjnej wirówki o średnicy 0,45 mikrometra, upewniając się, że analizujesz każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach.

Odwirować probówki w temperaturze 190 razy G i 20 stopni Celsjusza przez pięć minut i zebrać przefiltrowaną objętość. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przetwarzania. Próbując skorzystać z tego protokołu, należy pracować z fotorezysłem i wywoływaczem w dygestorium.

Posiadaj protokół zatwierdzony przez IRB przed pobraniem krwi od dawców. Pamiętaj, że materiały pochodzące z ludzkiej krwi to BSL2. Kiedy neutrofile są dodawane do mikromacierzy biocząstek, neutrofile, które stykają się z klastrami biocząstek, aktywują się i inicjują odpowiedź roju.

Mikromacierz biocząstek została zwalidowana za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia migracji neutrofili w kierunku klastrów biocząstek. Stabilne roje neutrofili tworzą się wokół każdej gromady po 30 do 60 minutach ekspozycji. Natomiast neutrofile nie wykazują migracji zbiorowej przy braku klastrów biocząstek.

Intensywność fluorescencji barwionych jąder neutrofili wykorzystano do określenia, że średnia wielkość roju wokół klastrów biocząstek wynosiła około 1490 mikrometrów kwadratowych. W przypadku braku klastrów fluorescencja danego obszaru zainteresowania pozostawała stała w czasie. Ślady migracji neutrofili pokazują, że neutrofile zbiegały się w klastrze biocząstek, gdy był obecny, ale nie zaobserwowano żadnej konwergencji w systemie kontrolnym.

Zmierzono prędkość roju i nieaktywowanych neutrofili i stwierdzono statystycznie istotną różnicę w rozkładach prędkości. Średnia prędkość roju neutrofili wynosiła 20,6 mikrometra na minutę, podczas gdy średnia prędkość neutrofili kontrolnych wynosiła 2 mikrometry na minutę. Stężenia 16 białek, które uwalniają neutrofile podczas roju, analizowano w czasie.

10 białek zwiększyło swoje stężenie. Dwa zmniejszyły się. A pozostałe cztery zwiększyły się w ciągu pierwszej godziny roju, ale potem zmniejszyły się.

Wykonując tę procedurę, upewnij się, że wszystko jest czyste, a stemple są odpowiednio wysuszone, ponieważ są one niezbędne do pomyślnego modelowania cząsteczek bakterii. Opracowanie tej techniki umożliwi naukowcom zbadanie nowych pytań w dziedzinie roju neutrofili, w tym tego, w jaki sposób wolne mediatory i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są zaangażowane w komunikację międzykomórkową neutrofili.