Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Opracowaliśmy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). Te sieci NET odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej. Stało się jednak jasne, że akumulacja NET w tkankach przyczynia się do patofizjologii wielu chorób zapalnych i autoimmunologicznych.

Ze względu na patologiczne implikacje NET wzrosło zainteresowanie rozwojem antagonistów NETozy. Aby zbadać hamowanie NETozy, opracowaliśmy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego określania uwalniania ludzkiej siatki, co pozwoliło nam badać NETozę i jej hamowanie w sposób wysokoprzepustowy. Neutrofile są wrażliwymi komórkami i mogą zmieniać swoją reakcję na bodźce podczas procesu oczyszczania z powodu stresu mechanicznego, mikrobiologicznego i innych.

Dlatego ważne jest, aby zwalidować protokół izolacji neutrofili w celu zminimalizowania aktywacji neutrofili. Tak więc ta technika umożliwia badanie uwalniania NET zarówno od osób zdrowych, jak i chorych. Ponadto pozwala nam badać kinetykę powstawania NET indukowaną różnymi bodźcami fizjologicznymi.

Dzięki tej wysokoprzepustowej technice mikroskopii byliśmy w stanie wykazać, że antagonista NETozy CIT-013, przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko cytrulinowanym histonom 2A i 4, było w stanie skutecznie hamować uwalnianie NET za pomocą nanomola IC 50 lub 4,6. To pokazuje, że ten test jest odpowiedni do testowania antagonistów NETozy. Po pobraniu krwi obwodowej od zdrowego ochotnika w probówce z heparyną litową, przenieś krew do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Przepłucz probówkę z heparyną litową DPBS i przenieś ją do tej samej 50-mililitrowej probówki, upewniając się, że stosunek krwi do DPBS wynosi 1:1. Po wymieszaniu dodaj rozcieńczoną krew na wierzch roztworu gradientu gęstości. Odwirować krew o stężeniu 400 g przez 40 minut z minimalnym przyspieszeniem i przerwą.

Wyrzuć górną warstwę plazmy za pomocą 10-mililitrowej pipety. Następnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby wyrzucić komórki jednojądrzaste krwi obwodowej i roztwór gradientu gęstości. Delikatnie wstrząśnij warstwą zawierającą erytrocyty i neutrofile przed ponownym podwieszeniem jej w 15 mililitrach DPBS.

Dodaj 25 mililitrów 6% roztworu dekstranu i 0,9% roztworu chlorku sodu i wymieszaj, odwracając probówkę. Po 25 minutach inkubacji przenieść górną warstwę neutrofili do świeżej 50-mililitrowej probówki za pomocą 10-mililitrowej pipety i odwirować przy 500 G przez 10 minut. Zdekantować probówkę, aby odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu do lizy chlorku amonu potasu.

Dodaj 40 mililitrów tego samego buforu do lizy i inkubuj w temperaturze pokojowej, ciągle odwracając probówkę, aż roztwór stanie się przezroczysty. Odwirować probówkę o sile 350 g przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu, powoli i kroplami, dodać pięć mililitrów pożywki hodowlanej, 10% na wierzch osadu neutrofili, nie doprowadzając neutrofili do zawiesiny.

Delikatnie obracaj probówką, aż większość erytrocytów obecnych na wierzchu osadu neutrofili zostanie ponownie zawieszona w pożywce hodowlanej. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad neutrofili w 10 mililitrach pożywki hodowlanej, 10%Po całkowitym ponownym zawieszeniu dodać do 50 mililitrów pożywki hodowlanej 10% i odwirować mieszaninę przed ponownym zawiesieniem osadu w 10 mililitrach zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili lub buforu testowego NET. Na początek dodaj 0,001% roztwór poli-L-lizyny do każdego dołka 96-dołkowej płytki i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umyj studzienki trzykrotnie 200 mikrolitrami DPBS i wysusz studzienki na powietrzu. Następnie ponownie zawiesić wymaganą liczbę neutrofili w zewnątrzkomórkowej pułapce neutrofili lub buforze testowym NET. Przenieść czterokrotnie skoncentrowany barwnik DNA w buforze testowym NET do każdego dołka.

Dodać czterokrotnie skoncentrowane bodźce NETosis w buforze testowym NET do odpowiednich studzienek. Następnie dodaj czterokrotnie skoncentrowanych antagonistów NETozy w buforze testu NET i zawiesinie neutrofili do odpowiednich studzienek. Odwirować płytkę o stężeniu 100 G przez dwie minuty.

Następnie należy umieścić płytkę w systemie do analizy mikroskopii żywych komórek umieszczonym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po umieszczeniu 96-dołkowej płytki obrazowej zawierającej zawiesinę neutrofili w systemie analizy mikroskopowej żywych komórek, otwórz oprogramowanie systemu. Kliknij harmonogram, aby pobrać i kliknij przycisk plusa, aby uruchomić.

Następnie wybierz opcję skanuj zgodnie z terminarzem i kliknij przycisk Dalej. Aby utworzyć nowy statek od podstaw, wybierz nowy w sekcji tworzenia naczynia i kliknij Dalej. W sekcji Scan Type (Typ skanowania) wybierz opcję Standard (Standardowy) i kliknij przycisk Next (Dalej).

Wybierz ustawienia skanowania jako komórka po komórce, brak. Kanały obrazu, kontrast fazowy w kolorze zielonym. Czas akwizycji, 100 milisekund i cel 20x.

Następnie kliknij przycisk Dalej. W sekcji Vessel Selection (Wybór statku) wybierz odpowiedni typ statku do skanowania i kliknij przycisk Next (Dalej). Określ położenie naczynia w szufladzie i kliknij przycisk Dalej.

W sekcji Scan Pattern (Wzorzec skanowania) wybierz studzienki, które mają zostać zeskanowane, oraz liczbę obrazów na studzienkę. Kliknij Dalej. W sekcji Notatnik statku podaj informacje o statku.

Wprowadź nazwę tabliczki i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Ustawienia analizy wybierz opcję odłóż analizę na później i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Harmonogram skanowania wybierz opcję utwórz nowy harmonogram ze skanowaniem w odstępach czasu, a następnie wybierz jedną godzinę w sekcji Dodaj skanowania do harmonogramu.

Wybierz opcję Zatrzymaj skanowanie po pięciu godzinach od pierwszego skanowania. Kliknij przycisk Dalej i kliknij przycisk Dodaj, aby zaplanować, gdy informacje o skanowaniu są poprawne. Po uzyskaniu obrazów kontrastu fazowego i immunofluorescencji neutrofili uruchom oprogramowanie do analizy mikroskopii żywych komórek.

Z widoku wybierz eksperyment z mikroskopią żywych komórek, który chcesz przeanalizować. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy i kliknij przycisk Dalej. Następnie wybierz podstawowy analizator z sekcji Typ analizy i kliknij przycisk Dalej.

W sekcji Image Channel (Kanał obrazu) wybierz kolor zielony, usuń zaznaczenie opcji phase (Faza) i kliknij przycisk Next (Dalej). Otwórz okno warstw obrazu, wybierz kolor zielony i odznacz fazę. Wyłącz automatyczne skalowanie w zielonej sekcji i ręcznie ustaw min i max.

Następnie otwórz okno czasów skanowania statku i wybierz obrazy przedstawiające odwierty kontroli dodatniej z NET. Otwórz okno ustawień definicji analizy i wpisz NET dla nazwy obiektu. W przypadku segmentacji wybierz opcję Adaptacyjne.

Dla progu GCU wybierz od trzech do pięciu i ustaw podział krawędzi w zakresie od minus 10 do zera. Następnie, aby oczyścić, wybierz Wypełnienie otworu do 100 mikrometrów kwadratowych i dostosuj rozmiar do minus jeden piksel. Z pola Filtry wybierz obszar większy niż 200 mikrometrów kwadratowych, Średnia intensywność mniejsza niż 24,6 i Zintegrowana intensywność większa niż 7 000.

Następnie kliknij podgląd bieżący lub podgląd wszystkiego, aby zastosować ustawienia. Umieść kursor na różnych strukturach NET i dostosuj ustawienia analizy, aby dostosować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne sieci NET. Jeśli ustawienia analizy NET są poprawne, kliknij przycisk Dalej.

Wybierz punkty czasowe i studzienki do analizy w sekcji czasy skanowania i odwierty, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wstaw nazwę definicji w sekcji Zapisz i zastosuj definicję analizy i kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Zakończ, gdy informacje analizy zostaną zweryfikowane i poprawne.

Otwórz analizę eksperymentu, klikając analizę w interesującym Cię naczyniu. Następnie otwórz okno metryk wykresu. Następnie kliknij przycisk plusa, aby utworzyć metrykę.

Podczas prezentowania danych jako procentowej konfluencji NET wybierz opcję Obszar w sekcji Metryka i wybierz pozycję Konfluencja w sekcji Wartość. Prezentując dane jako procent neutrofili NETting, wybierz opcję Liczba obiektów w sekcji Metryka i wybierz opcję Na obraz w sekcji Wartość. Po skonfigurowaniu ustawień metryki w sekcji Metryki zdefiniowane przez użytkownika wybierz pozycję Zbieganie obszaru sieci NET lub Liczba obiektów sieci NET na obraz.

Wybierz wszystkie wymagane punkty czasowe i studzienki do analizy odpowiednio z sekcji Wybierz skany i Wybierz studnię. Na koniec kliknij Eksportuj dane. Stymulacja jonoforem wapnia indukowała szybszą NETozę w porównaniu z PMA, co skutkowało wyższym odsetkiem neutrofili uwalniających NET.

NET indukowane przez jonofory wapnia były bardziej rozproszone poza błoną plazmatyczną neutrofili, podczas gdy NET indukowane PMA pozostawały bliżej błony plazmatycznej neutrofili. Tendencję do podwyższonych poziomów NET zaobserwowano, gdy neutrofile były aktywowane powlekanymi kompleksami immunologicznymi, FMLP i kryształami moczanu monosodowego. Uwalnianie NET w odpowiedzi na 23187 zostało całkowicie zahamowane przez CIT-013 przy połowie maksymalnego stężenia hamującego wynoszącym 4,6 nanomola.