Name: Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową mikroskopię do kwantyfikacji uwalniania NET przez ludzkie neutrofile w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia ocenę kinetyki NETosis i farmakologii antagonistów z IC50 4,6 nM dla CIT-013.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Paulowi Vinkowi za zarządzanie częścią projektu dotyczącą metody mikroskopii obrazowania na żywo.

Real-Time Microscopy for Studying NETosis Kinetics and Screening Inhibitors

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>De Bont, C., Pruijn, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrulline+is+not+a+major+determinant+of+autoantibody+reactivity+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Citrulline is not a major determinant of autoantibody reactivity to neutrophil extracellular traps.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 378 (1890), 20220249(2023).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Hoppenbrouwers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+NETosis%3A+Comprehensive+live+imaging+comparison+and+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review.</a> PLoS One. 12 (5), e0176472(2017).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> ELife. 6, e24437(2017).</li>
<li>Parker, H., Dragunow, M., Hampton, M. B., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+NADPH+oxidase+and+myeloperoxidase+in+neutrophil+extracellular+trap+formation+differ+depending+on+the+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus.</a> J Leukoc Biol. 92 (4), 841-849 (2012).</li>
<li>Neeli, I., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposition+between+PKC+isoforms+regulates+histone+deimination+and+neutrophil+extracellular+chromatin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release.</a> Front Immunol. 4, 38(2013).</li>
<li>Bosmann, M., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+therapies+for+acute+lung+injury%3A+targeting+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Protein-based therapies for acute lung injury: targeting neutrophil extracellular traps.</a> Expert Opin Ther Targets. 18 (6), 703-714 (2014).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Shiratori-Aso, S., Nakazawa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+NETs+in+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involvement of NETs in ANCA-associated vasculitis.</a> Front Immunol. 14, 1261151(2023).</li>
<li>Byrd, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+B+cells%2C+and+type+I+interferons+contribute+to+immune+dysregulation+in+hidradenitis+suppurativa%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, B cells, and type I interferons contribute to immune dysregulation in hidradenitis suppurativa.</a> Sci Transl Med. 11 (508), eaav5908(2019).</li>
<li>Kimball, A. S., Obi, A. T., Diaz, J. A., Henke, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+NETs+in+venous+thrombosis+and+immunothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of NETs in venous thrombosis and immunothrombosis.</a> Front Immunol. 7, 236(2016).</li>
<li>O'Neil, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+trap-associated+carbamylation+and+histones+trigger+osteoclast+formation+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular trap-associated carbamylation and histones trigger osteoclast formation in rheumatoid arthritis.</a> Ann Rheum Dis. 82 (5), 630-638 (2023).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptidylarginine+deiminase+4+%28PAD4%29+inhibitor+BMS-P5+blocks+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+and+delays+progression+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor BMS-P5 blocks formation of neutrophil extracellular traps and delays progression of multiple myeloma.</a> Mol Cancer Ther. 19 (7), 1530-1538 (2020).</li>
<li>Chirivi, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-citrullinated+protein+antibodies+as+novel+therapeutic+drugs+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-citrullinated protein antibodies as novel therapeutic drugs in rheumatoid arthritis.</a> J Clin Cell Immunol. S6, 006(2013).</li>
<li>Van der Linden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-citrullinated+histone+monoclonal+antibody+CIT-013%2C+a+dual+action+therapeutic+for+neutrophil+extracellular+trap-associated+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Anti-citrullinated histone monoclonal antibody CIT-013, a dual action therapeutic for neutrophil extracellular trap-associated autoimmune diseases.</a> MAbs. 15 (1), 2281763(2023).</li>
<li>Chirivi, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ACPA+inhibits+NET+formation%3A+a+potential+therapy+for+neutrophil-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ACPA inhibits NET formation: a potential therapy for neutrophil-mediated inflammatory diseases.</a> Cell Mol Immunol. 18 (6), 1528-1544 (2021).</li>
<li>Van der Linden, M., Westerlaken, G. H. A., Van Der Vlist, M., Van Montfrans, J., Meyaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signalling+and+kinetics+of+neutrophil+extracellular+trap+release+revealed+by+quantitative+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential signalling and kinetics of neutrophil extracellular trap release revealed by quantitative live imaging.</a> Sci Rep. 7 (1), 6529(2017).</li>
<li>Hoffmann, J. H. O., Schaekel, K., Gaiser, M. R., Enk, A. H., Hadaschik, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+of+NETosis+in+healthy+donors%3A+introduction+and+application+of+a+refined+method+for+extracellular+trap+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation of NETosis in healthy donors: introduction and application of a refined method for extracellular trap quantification.</a> Exp Dermatol. 25 (11), 895-900 (2016).</li>
<li>Silva, L. M., Moutsopoulos, N., Bugge, T. H., Doyle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantification of neutrophil extracellular trap formation.</a> Curr Protoc. 1 (7), e157(2021).</li>
<li>De Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-dependent+chromatin+dynamics%2C+citrullination%2C+calcium+signalling+and+ROS+production+during+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1865 (11 Pt A), 1621-1629 (2018).</li>
<li>Gajendran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alleviation+of+arthritis+through+prevention+of+neutrophil+extracellular+traps+by+an+orally+available+inhibitor+of+protein+arginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Alleviation of arthritis through prevention of neutrophil extracellular traps by an orally available inhibitor of protein arginine deiminase 4.</a> Sci Rep. 13 (1), 3189(2023).</li>
<li>Biron, B. M., Chung, C. -S., O'Brien, X. M., Chen, Y., Reichner, J. S., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cl-Amidine+prevents+histone+3+citrullination+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%2C+and+improves+survival+in+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Cl-Amidine prevents histone 3 citrullination and neutrophil extracellular trap formation, and improves survival in a murine sepsis model.</a> J Innate Immun. 9 (1), 22-32 (2017).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nat Commun. 10 (1), 1322(2019).</li>
<li>Lood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+enriched+in+oxidized+mitochondrial+DNA+are+interferogenic+and+contribute+to+lupus-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease.</a> Nat Med. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).</li>
<li>De Buhr, N., Von Köckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> J Immunol Res. 2016, 1-13 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+How+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), e1724(2010).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Gavillet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assay+for+direct+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps in blood samples.</a> Am J Hematol. 90 (12), 1155-1158 (2015).</li>
<li>Sil, P., Yoo, D., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> J Vis Exp. (112), e52779(2016).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>D'Cruz, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+activates+PAD4-dependent+NET+formation+in+necroptotic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL activates PAD4-dependent NET formation in necroptotic neutrophils.</a> Sci Signal. 11 (546), eaao1716(2018).</li>
<li>Nash, G., Abbitt, K., Tate, K., Jetha, K., Egginton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+mechanical+and+adhesive+behaviour+of+human+neutrophils+on+cooling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Changes in the mechanical and adhesive behaviour of human neutrophils on cooling in vitro.</a> Pflugers Arch. 442 (5), 762-770 (2001).</li>
<li>Hundhammer, T., Gruber, M., Wittmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+impact+of+centrifugation+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils.</a> Biomedicines. 10 (11), 2896(2022).</li>
<li>Krémer, V., Godon, O., Bruhns, P., Jönsson, F., De Chaisemartin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+methods+determine+human+neutrophil+responses+after+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation.</a> Front Immunol. 14, 1301183(2023).</li>
<li>Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L. F. C., Fernandes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+human+neutrophils+in+vitro.+The+importance+of+the+anticoagulant+used+during+blood+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of human neutrophils in vitro. The importance of the anticoagulant used during blood collection.</a> Clin Biochem. 41 (7-8), 570-575 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Citryll i mają interesy finansowe.

Od czasu odkrycia NET w 2004 r. opracowano wiele strategii eksperymentalnego badania uwalniania NET in vitro, przy czym mikrokopia immunofluorescencyjna jest najczęstszą techniką ilościowego oznaczania NETosis27,28. Chociaż mikroskopia jest przydatna do wizualizacji wydania NET, ma ograniczenia, ponieważ niezautomatyzowana mikroskopowa kwantyfikacja obrazów o stałych punktach czasowych jest raczej niedokładna i może cierpieć z powodu stronniczości obserwatora. Inną techniką stosowaną do badania uwalniania NET jest obrazowanie wielospektralne cytometria przepływowa29,30, która mierzy dużą liczbę neutrofili sieciowych i przyjmuje bezstronną analizę, ale koncentruje się na neutrofilach we wczesnych stadiach NETozy i nie określa ilościowo neutrofili, które uwolniły swoje NET. Wiele badań nad kinetyką NETozy wykorzystuje barwnik DNA do ilościowego określenia uwalniania NET w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych31. Technika ta nie jest w stanie odróżnić NET od aktywowanych lub umierających neutrofili z wewnątrzkomórkowym barwieniem DNA, a zatem nie nadaje się do ilościowego oznaczania uwalniania NET i badania antagonistów NETozy. Powyższe podkreśla, że podejścia stosowane obecnie do badania NETosis są cenne, ale mają swoje ograniczenia.
Opisana w tym badaniu metoda mikroskopii w czasie rzeczywistym rozwiązuje wiele problemów znalezionych we wcześniej opisywanych technikach. Oferuje bezstronną, półautomatyczną, wysokowydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET. Rzeczywiście, takie podejście minimalizuje artefakty pipetowania, takie jak rozciągnięta morfologia NET18, i jest w stanie odróżnić NETozę od nekrozy i apoptozy dzięki odrębnej morfologii i kinetyce uwalniania DNA18,32. Ponadto podejście to daje możliwość zbadania różnych szlaków biochemicznych regulujących śmierć komórki, takich jak tworzenie NET w neutrofilach nekroptotycznych, które generują struktury spełniające funkcjonalne i fenotypowe kryteria NET33.
W tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać, aby pomyślnie określić ilościowo NET. Po pierwsze, prawidłowa liczba komórek w studzience jest ważna dla dokładnej kwantyfikacji NET. Gdy gęstość neutrofili jest zbyt wysoka, komórki i NET będą nakładać się na sąsiednie komórki i NET, co utrudni ich rozróżnienie, w wyniku czego kwantyfikacja stanie się niedokładna. Po drugie, warunkiem wstępnym jest użycie niskiego stężenia nietoksycznego, nieprzepuszczalnego dla błony plazmatycznej barwnika wiążącego DNA do barwienia NET, gdy są wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego. Przepuszczalne dla błony plazmatycznej barwniki wiążące DNA mogą łatwo indukować aktywację neutrofili lub śmierć komórki. Po trzecie, należy zeskanować wiele obrazów na studzienkę, aby uzyskać reprezentatywny przegląd uwalniania NET w heterogenicznej populacji neutrofili. Po czwarte, obraz z kontrastem fazowym neutrofili przy t = 0 jest konieczny do skorygowania liczby neutrofili na obrazie i obliczenia procentu neutrofili netto.
Chociaż to wysokoprzepustowe podejście do mikroskopii w czasie rzeczywistym ma wiele zalet w porównaniu z innymi testami wykrywania NET, istnieją ograniczenia tej metody, ponieważ, o ile nam wiadomo, nie ma dostępnych barwników fluorescencyjnych do wykrywania dodatkowych składników NET w celu potwierdzenia uwolnienia NET. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie do wykrywania dodatkowych składników NET mogą być stosowane, ale mogą mieć niepożądane skutki, ponieważ kompleksy przeciwciało-układ odpornościowy wpływają na aktywację neutrofili i prawdopodobnie NETozę. Dlatego wolimy nie używać dodatkowych przeciwciał w tej konfiguracji testu i zamiast tego zalecamy stosowanie dobrze znanych bodźców indukujących NETozę. W przypadku gdy stosowane są jeszcze nieustalone bodźce NETozy, zalecamy użycie testu ELISA do wykrywania DNA skompleksowanego z białkami specyficznymi dla NET, takimi jak cytrulinowane histony, przed testem obrazowania na żywo. Po drugie, zmienność wewnątrz- i międzytestowa może wynikać ze zmienności między dawcami, przy czym neutrofile od zdrowych dawców reagują inaczej na różne bodźce NETozy ze względu na heterogeniczność w zdrowej populacji. Aby zminimalizować zmienność testu, neutrofile muszą zostać wyizolowane w ciągu 1 godziny ze świeżo pobranej krwi i natychmiast wykorzystane w doświadczeniu, ponieważ neutrofile są krótkotrwałe i nie można ich kriokonserwować. Ponadto ważne jest, aby protokół izolacji neutrofili został zatwierdzony i przyjęty w celu zminimalizowania aktywacji neutrofili. Neutrofile są wrażliwymi komórkami i mogą zmieniać swoją reakcję na bodźce podczas procesu oczyszczania z powodu stresu mechanicznego i innych rodzajów stresu. Na stan aktywacji neutrofili i uwalnianie NET może mieć wpływ rodzaj igły, użyte probówki do pobierania krwi, temperatura inkubacji, szybkość wirowania i czas od pobrania krwi do izolacji neutrofili 34,35,36,37. Dodatkowa metoda izolacji neutrofili, którą można rozważyć, została opisana przez Krémera i wsp.36 przy użyciu metody negatywnej selekcji immunomagnetycznej bez lizy czerwonych krwinek. Metoda ta przypomina nietknięte neutrofile we krwi pełnej i może być odpowiednia do zapobiegania aktywacji neutrofili podczas procesu oczyszczania. Wszystko to powinno służyć jako ostrzeżenie dla tej dziedziny, że dane z różnych grup badawczych muszą być porównywane z dużą ostrożnością.
Ogólnie rzecz biorąc, opisana metoda wysokoprzepustowej mikroskopii w czasie rzeczywistym umożliwia dokładne określenie ilościowe NET w powtarzalny i wydajny sposób oraz może być wykorzystana do badania charakterystyki, wielkości i kinetyki uwalniania NET oraz umożliwia badanie aktywności antagonistów NETozy. Jako przykład tego ostatniego zastosowaliśmy humanizowane przeciwciało monoklonalne antycytrulinowane histonem H2A i H4 CIT-013, które jest obecnie w fazie rozwoju klinicznego.

Neutrofile są obficie obecne we krwi i migrują do tkanek po infekcji lub zapaleniu. Odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej, wykorzystując rozległą broń do ochrony gospodarza przed drobnoustrojami. Neutrofile zabijają patogeny poprzez fagocytozę, degranulację, wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i uwalnianie zdekondensowanej chromatyny zwanej zewnątrzkomórkowymi pułapkami neutrofili (NET) w procesie zwanym NETosis1. NET to zewnątrzkomórkowe struktury chromatyny ozdobione m.in. ziarnistymi białkami i kalprotektyną2,3, i są uwalniane po stymulacji szerokim spektrum cząsteczek4. NETozę można ogólnie podzielić na dwie główne ścieżki: Oksydaza NADPH zależna lub niezależna5,6,7. Ponadto cytrulinacja argininy N-końcowych ogonów histonowych przez deiminazę peptydyloargininy 4 (PAD4) jest ściśle związana z NETozą i sprzyja dekondensacji chromatyny, co ostatecznie prowadzi do wydalenia zdekondensowanej chromatyny do środowiska zewnątrzkomórkowego.
Chociaż uwalnianie NET jest zaangażowane w eliminację patogenów, liczne badania wykazały, że nieprawidłowe i przedłużone uwalnianie NET jest związane z rozwojem różnych zaburzeń zapalnych, w tym ostrego uszkodzenia płuc8, reumatoidalne zapalenie stawów (RA)9, vasculitis10, oraz ropne zapalenie gruczołów potowych suppurativa11. Szkodliwa rola NET w chorobie jest wieloaspektowa, ponieważ NET są prozapalne, są źródłem autoantygenów, są cytotoksyczne dla otaczających tkanek, wywołują immunozakrzepicę i sprzyjają różnicowaniu osteoklastów i erozji kości9,12,13. Farmakologiczne hamowanie szlaku NETosis przez małocząsteczkowe inhibitory PAD4 pokazuje, że terapie ukierunkowane na NETosis mają potencjał w leczeniu chorób, w których akumulacja NET jest ważnym czynnikiem patogenezy14. Zamiast celować w enzym PAD4, użyliśmy pierwszego w swojej klasie przeciwciała monoklonalnego NETosis hamującego humanizowane przeciwciało monoklonalne antycytrulinowane histonami, CIT-013, które specyficznie wiąże się z cytrulinowanymi histonami H2A i H415. CIT-013 ma unikalny podwójny mechanizm działania poprzez hamowanie uwalniania NET i wzmacnianie fagocytozy NET za pośrednictwem makrofagów16. CIT-013 i cząsteczki prekursorowe wykazały skuteczność terapeutyczną w wielu mysich modelach zapalenia związanego z NET17.
Aby badać wydanie NET, na przestrzeni lat opracowano różne metody, takie jak między innymi 1) Wykrywanie DNA za pomocą nieprzepuszczalnego dla błony plazmatycznej znacznika DNA w połączeniu z czytnikiem płytek immunofluorescencyjnych, 2) wykrywanie DNA i DNA skompleksowanego z białkami specyficznymi dla NET w supernatantach za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) w supernatantach, 3) kolokalizacja cząsteczek związanych z NET z zewnątrzkomórkowym DNA za pomocą immunohistochemii oraz 4) metody cytometrii przepływowej w celu wykrycia neutrofili netto. Wszystkie te metody mają swoje zalety i ograniczenia. Opracowaliśmy wysokoprzepustowe podejście w czasie rzeczywistym do mikroskopowej kwantyfikacji uwalniania ludzkiej siatki, które wykorzystuje nieprzepuszczalny dla błony plazmatycznej barwnik DNA16,18. Opisana metoda pozwala w łatwy, wiarygodny i powtarzalny sposób badać kinetykę i charakterystykę NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy, takich jak CIT-013.

<table><tbody><tr><td>A-23187 Wolny kwas (kalcymycyna)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym jaj przeciw jajom kurzym (przeciwciało kontrolne; cIgG)</td><td>CrownBio</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-sprzężone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD45 (klon 2D1)</td><td>Biolegend</td><td>368515</td><td>Stosować w 1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>stężenie końcowe System BD FACSCantoTM II + oprogramowanie FACSDiva (wersja 8.0.1)&nbsp;</td><td>BD</td><td>n/a</td><td>System cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja V</td><td>Roche</td><td>10735108001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (1 M)</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>Kryształy choroby dyspozycyjności pirofosforanu wapnia (CPPD)</td><td>Celometr InvivoGen</td><td>lrl-cppd</td><td></td></tr><tr><td>Auto T4 Licznik komórek Bright Field + oprogramowanie analityczne (wersja 3.3.9.5)</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>n/a</td><td>Licznik komórek jasnego pola</td></tr><tr><td>CIT-013</td><td>Citryll B.V.</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-dołkowa płytka, przezroczyste dno&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>96-dołkowa płytka #1</td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos</td><td>551005009006</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Serena</td><td>S-FBS-SA-015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Roztwór gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Sprzężone z FITC mysie przeciwciało anty-ludzkie CD66b (klon G10F5)</td> <td>eBioscience</td><td>17-0666-42</td><td>Stosować przy 1,5 i mikro; g / ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>FLowJo</td><td>Wersja 10.8.0</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47729-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>VWR</td><td>31020</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek TruStain FcX&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Blok receptora Fc</td></tr><tr><td>IBIDI 96-dołkowa płytka, przezroczyste dno&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>89626</td><td>96-dołkowa płytka #2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne IncuCyte SX3 + (wersja 2022B Rev1)&nbsp;</td><td>Satorius</td><td>n/a</td><td>System analizy mikroskopowej żywych komórek</td></tr><tr><td>Kryształy moczanu sodu</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-msu</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało antyhistonowe H3 (cytrulina R2 + R8 + R17)&nbsp;</td><td>Kajman</td><td>17939</td><td>Klon 11D3; określany jako #1</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało antyhistonowe H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) (Klon KM-2)</td><td>Przeciwciała bezwzględne</td><td>Ab01681-2.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>B. Braun</td><td>25900</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (5000 U/mL) - Streptomycyna (5000 &mikro; g / mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-sprzężone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD16 (klon 3G8)</td><td>Biolegend</td><td>302027</td><td>Stosować w 0,33 &mikro; g / ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne królicze przeciwciało anty-HSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0433-2ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (0,01%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3)</td><td>Przeciwciało antyhistonowe Sigma Aldrich</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit H3 (cytrulina R2 + R8 + R17)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab281584</td><td>Multiklonalny; określany jako #2</td></tr><tr><td>RPMI 1640 z suplementem GlutaMAXTM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>Pożywka hodowlana zawierająca L-glutaminę</td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>Pożywka hodowlana bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne H2O</td><td>Gibco</td><td>15230204</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Zielony barwnik kwasem nukleidowym&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7020</td><td>Barwnik DNA</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do krwi Vacutainer Li-Heparyna (17 IU / ml)</td><td>BD</td><td>367526</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Real-Time, High-Throughput Microscopic Quantification of Human Neutrophil Extracellular Trap Release and Assessing the Pharmacology of Antagonists

Neutrofile odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej, stosując kilka strategii, w tym uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w procesie zwanym NETosis. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad stało się jasne, że akumulacja NET w tkankach przyczynia się do patofizjologii wielu chorób zapalnych i autoimmunologicznych. W związku z tym wzrosło zainteresowanie rozwojem antagonistów NETozy. Równolegle opracowywano zmienne i niestandardowe metody wykrywania i analizy NETozy, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. W tym miejscu opisujemy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego określania uwalniania NET przez człowieka, co pozwala na badanie NETozy, a także inhibicji NET w sposób wysokoprzepustowy. Półautomatyczna analiza oparta na powierzchni rozpoznaje NET i odróżnia je od neutrofili aktywowanych bez siatki. Wykazaliśmy, że niefizjologiczne induktory NETozy, jonofor wapnia i octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA), wyzwalają uwalnianie NET o różnych właściwościach i kinetyce. Ponadto pokazujemy, że takie podejście pozwala na badanie uwalniania NET w odpowiedzi na bodźce istotne dla choroby, w tym kompleksy immunologiczne, N-formylometioninę-leucylo-fenyloalaninę (fMLF), kryształy moczanu monosodu i kryształy pirofosforanu wapnia. Aby zilustrować przydatność tej metody do badania antagonistów NETozy, użyliśmy CIT-013, pierwszego w swojej klasie inhibitora przeciwciał monoklonalnych o uwalnianiu NET. CIT-013 celuje w cytrulinowany histon H2A i H4 i skutecznie hamuje uwalnianie NET dzięki IC50 4,6 nM. Inne testowane przeciwciała antyhisttonowe nie miały tej zdolności hamowania NETozy. Podsumowując, wykazaliśmy, że protokół ten umożliwia specyficzną, wiarygodną i powtarzalną wysokoprzepustową kwantyfikację NET, usprawniając badanie charakterystyki uwalniania NET, kinetyki i farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa mikroskopia w czasie rzeczywistym, w połączeniu z nieprzenikalnym barwnikiem DNA, pozwala na badanie kinetyki, charakterystyki i podstawowych szlaków NETozy oraz umożliwia ocenę potencjalnych inhibitorów uwalniania NET. Przy zastosowaniu tego podejścia, NET zdefiniowano jako struktury wykazujące pozytywny sygnał dla barwnika DNA o znacznie większej powierzchni w porównaniu do powierzchni zdrowych neutrofili (Rysunek 1A), co wskazuje na to, że chromatyna została wydalona do środowiska pozakomórkowego18. Analiza oparta na powierzchni pozwoliła nam odróżnić NET od aktywowanych neutrofili z naruszoną integralnością błony plazmatycznej, wykazujących silne wewnątrzkomórkowe barwienie DNA (Rysunek 1A).
Jonofor wapniowy (A23187) oraz PMA są powszechnie stosowane do indukowania NETozy in vitro. Mimo że są to bodźce niefizjologiczne, są one wartościowe, ponieważ aktywują odmienne szlaki NETozy i zapewniają spójną indukcję NETozy przy niskiej zmienności między dawcami. A23187 wywołuje napływ wapnia, co prowadzi do aktywacji PAD4 i uwalniania NETs bogatych w cytrulinylowane histony, podczas gdy PMA aktywuje kompleks NADPH oksydazy, co skutkuje produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) i późniejszym uwalnianiem NETs o niskim poziomie cytrulinylowanych histonów5,16,21. Szybkość i skala odpowiedzi NETozy zależą od stężenia każdego bodźca (Rycina 1B,C), przy czym A23187 indukuje szybszą NETozę, a PMA skutkuje wyższym odsetkiem neutrofili uwalniających NETs (Rycina 1D-F). NETs powstałe w wyniku stymulacji A23187 (Rycina 1D; czerwona strzałka) różniły się od NETs indukowanych przez PMA (Rycina 1D; żółta strzałka) tym, że były bardziej rozproszone poza błoną plazmatyczną neutrofili, podczas gdy NETs indukowane przez PMA pozostawały bliżej błony plazmatycznej neutrofili. Ponadto stymulacja A23187 prowadziła do powstania przepuszczalnych, nietworzących sieci neutrofili wybarwiających się barwnikiem DNA (Rycina 1D; niebieska strzałka), które nie wydalały swojego DNA do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Wykrywanie przepuszczalnych, nietworzących sieci neutrofili wybarwiających się barwnikiem DNA było zależne od stężenia A23187 (Rycina 1G) i niemal całkowicie nieobecne niezależnie od stężenia PMA użytego do stymulacji NETozy (Rycina 1D,H). Oprócz stosowania niefizjologicznych bodźców NETozy, takich jak A23187 i PMA, test ten nadaje się również do badania czynników wyzwalających NETozę istotnych w przebiegu chorób. Na przykład neutrofile aktywowane rozpuszczalnymi kompleksami immunologicznymi (sIC) lub kryształami występującymi w chondrokalcynozie (CPPD) wykazały znacznie zwiększone uwalnianie NET w porównaniu do grupy bez stymulacji. Tendencję do podwyższonego poziomu NET zaobserwowano, gdy neutrofile były aktywowane kompleksami immunologicznymi związanymi z powierzchnią (cIC), fMLP oraz kryształami moczanu sodu (MSU) (Rycina 1I); jednak w przypadku tych bodźców odnotowano znaczną zmienność między poszczególnymi dawcami.
Farmakologiczne hamowanie szlaku NETozy oraz enzymów związanych z NETozą wykazało, że terapeutyki ukierunkowane na NETozę mogą stanowić skuteczne metody leczenia chorób, w których akumulacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilnych (NET) w znacznym stopniu napędza patologię.14,17,22,23,24Ten test NET w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem mikroskopii jest łatwym, niezawodnym i powtarzalnym podejściem do badania antagonistów NETozy w sposób wysokoprzepustowy. Aby to zilustrować, wykorzystaliśmy CIT-013 – pierwsze w swojej klasie zhumanizowane przeciwciało monoklonalne, które z wysokim powinowactwem wiąże się z cytrulinowanymi histonami H2A i H4.15,16A23187 aktywuje ścieżkę NETozy, prowadząc do powstania NET-ów zawierających cytrulinowane histony, które następnie są celem CIT-013 w celu wykonania przez ten związek funkcji hamowania NETozy.16Rzeczywiście, uwalnianie NET w odpowiedzi na A23187 zostało całkowicie zahamowane przez CIT-013 (Rysunek 2A i Film uzupełniający 1), z IC50 wynoszącego 4,6 nM (Rysunek 2B). Zdolność CIT-013 do hamowania NETozy jest unikalna, ponieważ inne dostępne komercyjnie przeciwciała skierowane przeciwko różnym (nie-)cytrulinowanym histonom nie były w stanie zahamować uwalniania NET (Rysunek 2C).
Wcześniej wykazaliśmy, że wysoce podobna cząsteczka prekursorowa CIT-013 (różniąca się dwoma aminokwasami, lecz wiążąca podobne epitopy z taką samą powinowactwem) blokuje NETozę w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne, takie jak aktywowane płytki krwi, płyn stawowy w dnie moczanowej, jak również płyn stawowy w RZS17. Tutaj wykazujemy, że uwalnianie NET indukowane przez sIC może być hamowane przez CIT-013 (Rycina 2D). Terapeutyczne znaczenie hamowania NETozy indukowanej tym bodźcem podkreślają SLE, RZS i inne choroby autoimmunologiczne, w których autoprzeciwciała w surowicy lub płynie stawowym wspomagają tworzenie IC, co wyzwala NETozę25,26.
Wspólnie dane te wykazują, że ta metoda wysokoprzepustowej mikroskopii w czasie rzeczywistym nadaje się do badania kinetyki i charakterystyki uwalniania NET oraz pozwala na badanie inhibitorów NETozy. Chociaż metoda ta została zoptymalizowana do stosowania w przypadku ludzkich neutrofili, po wprowadzeniu modyfikacji może być ona również odpowiednia do badania neutrofili innych gatunków. Dane uzyskane za pomocą tego testu stanowią podstawę uzasadnienia dla zastosowania CIT-013 jako skutecznej i wydajnej terapii chorób indukowanych przez NET.
<img alt="Aktywacja neutrofili; wykresy tworzenia NET, obrazy mikroskopowe; odpowiedź neutrofili indukowana przez A23187/PMA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67258/67258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Mikroskopia wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do badania uwalniania NET. Neutrofile wyizolowane z krwi zdrowych ochotników stymulowano A23187 lub PMA w celu uruchomienia ścieżki NETozy. Uwalnianie NET wizualizowano za pomocą wysokoprzepustowej mikroskopii w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem barwnika DNA nieprzenikającego przez błonę plazmatyczną, a następnie ilościowo określono na podstawie powierzchni przy użyciu oprogramowania systemu analizy mikroskopowej żywych komórek. (A) Analiza powierzchni niestymulowanych zdrowych neutrofili (szary), zewnątrzkomórkowych NET oraz przepuszczalnych neutrofili nietworzących sieci z wewnątrzkomórkowym barwieniem DNA (zielony). (B,C) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET w czasie w neutrofilach stymulowanych wskazanymi stężeniami A23187 lub PMA (n = 2). (D) Reprezentatywne obrazy uwalniania NET w odpowiedzi na A23187 (czerwone strzałki) i PMA (żółte strzałki) w różnych punktach czasowych. Przykłady przepuszczalnych neutrofili nietworzących sieci wskazano niebieskimi strzałkami. (E) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET w czasie przedstawione jako procent konfluencji NET (n = 5). Statystykę przeprowadzono dla t = 240 min. (F) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET w czasie przedstawione jako procent neutrofili tworzących sieci (n = 2). (G, H) Ilościowe oznaczenie przepuszczalnych neutrofili nietworzących sieci w czasie w neutrofilach stymulowanych wskazanymi stężeniami A23187 lub PMA (n = 2). (I) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET w t = 240 min indukowanego przez rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (sIC), kompleksy IC powlekane (cIC), fMLP, kryształy mocznika sodowego (MSU) oraz kryształy występujące w chorobie odkładania pirofosforanu wapnia (CPPD) (n = 8-28). Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. ﻿**P &lt; 0,01 oraz ****P &lt; 0,0001, jednoczynnikowa ANOVA z pomiarami powtórzonymi i testem porównań wielokrotnych Dunnetta (B), test Kruskala-Wallisa z testem porównań wielokrotnych Dunna (I). Panele A-F zostały zmodyfikowane za zgodą van der Linden i wsp.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/67258fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza uwalniania NET; wykresy A-D; badanie inhibicji zależnej od stężenia i skuteczności; wykresy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67258/67258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: CIT-013 hamuje uwalnianie NET. (A) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET indukowanego przez A23187 w czasie t = 240 min w obecności (No Ab) lub nieobecności CIT-013 lub przeciwciała kontrolnego izotypowego (cIgG). (B) Zależne od dawki hamowanie uwalniania NET indukowanego przez A23187 przy użyciu CIT-013 w czasie t = 240 min (n = 3). Dane zostały znormalizowane do cIgG (przyjęto jako 100% uwalniania NET). (C) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET indukowanego przez A23187 w czasie t = 240 min w obecności wskazanych stężeń CIT-013, przeciwciała anty-histon H4, przeciwciała anty-cytrulinowana histona H3 nr 1 lub przeciwciała anty-cytrulinowana histona H3 nr 2 (n = 6). (D) Ilościowe oznaczenie uwalniania NET w czasie t = 240 min indukowanego przez rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (ICs) w obecności CIT-013 lub cIgG. Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. ****P &lt; 0.0001, jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami z testem wielokrotnych porównań Tukeya (A) lub obustronny test znaków rang dla par dopasowanych Wilcoxona (D). Panele A, B oraz D zostały zmodyfikowane za zgodą van der Linden i wsp.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/67258fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Płyta 96-dołkowa nr 1</td>
			<td>Płyta 96-dołkowa nr 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość 0,001% roztworu poli-L-lizyny na dołek</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość zawiesiny neutrofili na dołek</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>87,5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba neutrofili na dołek</td>
			<td>2 x 104 komórek</td>
			<td>3,5 x 104 komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość 4x stężonego (= 80 nM) barwnika DNA w buforze do analizy NET na dołek</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>87,5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość 4x stężonych stymulatorów NETozy w buforze do analizy NET na dołek</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>87,5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość 4x stężonych antagonistów NETozy w buforze do analizy NET na dołek</td>
			<td>50 µL</td>
			<td>87,5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętości i liczby komórek zoptymalizowane dla różnych płytek obrazujących z 96 dołkami.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stężenie roztworu roboczego (4-krotnie skoncentrowany)</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jonofor wapnia (A23187)</td>
			<td>50 µM</td>
			<td>12.5 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>16 nM</td>
			<td>4 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>4 µM</td>
			<td>1 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kryształy monosodowego mocznika (MSU)</td>
			<td>400 µg/mL</td>
			<td>100 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kryształy w chorobie depozycji pirofosforanu wapnia (CPPD)</td>
			<td>400 µg/mL</td>
			<td>100 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (sIC)</td>
			<td colspan="2">1. Dodać 5 µg/mL albumina surowicy ludzkiej (HSA) w DPBS do 282.5 µg/mL poliklonalne przeciwciało królicze anty-HSA w DPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2. Inkubować przez co najmniej 90 min w temperaturze 37 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3. Homogenizować za pomocą wstrząsania w vortexie i dodać 50 µL roztwór sIC do odpowiednich studzienek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Powlekłe kompleksy immunologiczne (cIC)</td>
			<td colspan="2">1. Dodać 10 µg/mL HSA w DPBS w odpowiednich dołkach płytki 96-dołkowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3. Przemyć dołki 3 razy za pomocą 200 µL 0,05% Tween-20 w DPBS (zwany dalej PBS/0,05% Tween).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">4. Zablokuj dołki za pomocą 200 µL 1% (m/v) albuminy surowicy bydlęcej w PBS/0,05% Tween (dalej określany jako bufor blokujący).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5. Inkubować przez 120 min w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu (400 obr./min).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6. Przemyj dołki 3 razy za pomocą 200 µL PBS/0,05% Tween.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">7. Dodać 50 µL poliklonalne przeciwciało królicze przeciwko HSA w buforze blokującym do odpowiednich dołków.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">8. Inkubować przez 60 min w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu (400 obr./min).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">9. Przemyć dołki 3 razy za pomocą 200 µL PBS/0,05% Tween.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">10. Na koniec trzy razy przemyj studzienki za pomocą 200 µL DPBS. Dołki są teraz przygotowane do etapu 4.7 protokołu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Zalecane stężenia stymulantów NETozy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stężenie roztworu roboczego (stężenie 4x)</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało przeciwko lizozymowi jaja kurzego (przeciwciało kontrolne; cIgG)</td>
			<td>80 nM</td>
			<td>20 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIT-013</td>
			<td>80 nM</td>
			<td>20 nM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Zalecane stężenia antagonisty NETozy
Wideo uzupełniające 1. Neutrofile stymulowano A23187 w obecności cIgG (lewa strona) lub CIT-013 (prawa strona), a uwalnianie NET wizualizowano w czasie przy użyciu barwnika DNA nieprzenikającego przez błonę plazmatyczną. Uwalnianie NET jest hamowane w obecności CIT-013. Film stanowi nałożenie obrazu z barwnikiem DNA (zielony) i kontrastu fazowego. Niniejsze wideo zostało udostępnione za zgodą van der Linden i wsp.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/20240726_Supplemental%20video%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Neutrophils play an important role in innate immune defense by using several strategies, including the release of neutrophil extracellular traps (NETs) in ...

Opracowaliśmy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). Te sieci NET odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej. Stało się jednak jasne, że akumulacja NET w tkankach przyczynia się do patofizjologii wielu chorób zapalnych i autoimmunologicznych.Ze względu na patologiczne implikacje NET wzrosło zainteresowanie rozwojem antagonistów NETozy. Aby zbadać hamowanie NETozy, opracowaliśmy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego określania uwalniania ludzkiej siatki, co pozwoliło nam badać NETozę i jej hamowanie w sposób wysokoprzepustowy. Neutrofile są wrażliwymi komórkami i mogą zmieniać swoją reakcję na bodźce podczas procesu oczyszczania z powodu stresu mechanicznego, mikrobiologicznego i innych.Dlatego ważne jest, aby zwalidować protokół izolacji neutrofili w celu zminimalizowania aktywacji neutrofili. Tak więc ta technika umożliwia badanie uwalniania NET zarówno od osób zdrowych, jak i chorych. Ponadto pozwala nam badać kinetykę powstawania NET indukowaną różnymi bodźcami fizjologicznymi.Dzięki tej wysokoprzepustowej technice mikroskopii byliśmy w stanie wykazać, że antagonista NETozy CIT-013, przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko cytrulinowanym histonom 2A i 4, było w stanie skutecznie hamować uwalnianie NET za pomocą nanomola IC 50 lub 4,6. To pokazuje, że ten test jest odpowiedni do testowania antagonistów NETozy. Po pobraniu krwi obwodowej od zdrowego ochotnika w probówce z heparyną litową, przenieś krew do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów.Przepłucz probówkę z heparyną litową DPBS i przenieś ją do tej samej 50-mililitrowej probówki, upewniając się, że stosunek krwi do DPBS wynosi 1:1. Po wymieszaniu dodaj rozcieńczoną krew na wierzch roztworu gradientu gęstości. Odwirować krew o stężeniu 400 g przez 40 minut z minimalnym przyspieszeniem i przerwą.Wyrzuć górną warstwę plazmy za pomocą 10-mililitrowej pipety. Następnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby wyrzucić komórki jednojądrzaste krwi obwodowej i roztwór gradientu gęstości. Delikatnie wstrząśnij warstwą zawierającą erytrocyty i neutrofile przed ponownym podwieszeniem jej w 15 mililitrach DPBS.Dodaj 25 mililitrów 6% roztworu dekstranu i 0,9% roztworu chlorku sodu i wymieszaj, odwracając probówkę. Po 25 minutach inkubacji przenieść górną warstwę neutrofili do świeżej 50-mililitrowej probówki za pomocą 10-mililitrowej pipety i odwirować przy 500 G przez 10 minut. Zdekantować probówkę, aby odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu do lizy chlorku amonu potasu.Dodaj 40 mililitrów tego samego buforu do lizy i inkubuj w temperaturze pokojowej, ciągle odwracając probówkę, aż roztwór stanie się przezroczysty. Odwirować probówkę o sile 350 g przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu, powoli i kroplami, dodać pięć mililitrów pożywki hodowlanej, 10% na wierzch osadu neutrofili, nie doprowadzając neutrofili do zawiesiny.Delikatnie obracaj probówką, aż większość erytrocytów obecnych na wierzchu osadu neutrofili zostanie ponownie zawieszona w pożywce hodowlanej. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad neutrofili w 10 mililitrach pożywki hodowlanej, 10%Po całkowitym ponownym zawieszeniu dodać do 50 mililitrów pożywki hodowlanej 10% i odwirować mieszaninę przed ponownym zawiesieniem osadu w 10 mililitrach zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili lub buforu testowego NET. Na początek dodaj 0,001% roztwór poli-L-lizyny do każdego dołka 96-dołkowej płytki i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Umyj studzienki trzykrotnie 200 mikrolitrami DPBS i wysusz studzienki na powietrzu. Następnie ponownie zawiesić wymaganą liczbę neutrofili w zewnątrzkomórkowej pułapce neutrofili lub buforze testowym NET. Przenieść czterokrotnie skoncentrowany barwnik DNA w buforze testowym NET do każdego dołka.Dodać czterokrotnie skoncentrowane bodźce NETosis w buforze testowym NET do odpowiednich studzienek. Następnie dodaj czterokrotnie skoncentrowanych antagonistów NETozy w buforze testu NET i zawiesinie neutrofili do odpowiednich studzienek. Odwirować płytkę o stężeniu 100 G przez dwie minuty.Następnie należy umieścić płytkę w systemie do analizy mikroskopii żywych komórek umieszczonym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po umieszczeniu 96-dołkowej płytki obrazowej zawierającej zawiesinę neutrofili w systemie analizy mikroskopowej żywych komórek, otwórz oprogramowanie systemu. Kliknij harmonogram, aby pobrać i kliknij przycisk plusa, aby uruchomić.Następnie wybierz opcję skanuj zgodnie z terminarzem i kliknij przycisk Dalej. Aby utworzyć nowy statek od podstaw, wybierz nowy w sekcji tworzenia naczynia i kliknij Dalej. W sekcji Scan Type (Typ skanowania) wybierz opcję Standard (Standardowy) i kliknij przycisk Next (Dalej).Wybierz ustawienia skanowania jako komórka po komórce, brak. Kanały obrazu, kontrast fazowy w kolorze zielonym. Czas akwizycji, 100 milisekund i cel 20x.Następnie kliknij przycisk Dalej. W sekcji Vessel Selection (Wybór statku) wybierz odpowiedni typ statku do skanowania i kliknij przycisk Next (Dalej). Określ położenie naczynia w szufladzie i kliknij przycisk Dalej.W sekcji Scan Pattern (Wzorzec skanowania) wybierz studzienki, które mają zostać zeskanowane, oraz liczbę obrazów na studzienkę. Kliknij Dalej. W sekcji Notatnik statku podaj informacje o statku.Wprowadź nazwę tabliczki i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Ustawienia analizy wybierz opcję odłóż analizę na później i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Harmonogram skanowania wybierz opcję utwórz nowy harmonogram ze skanowaniem w odstępach czasu, a następnie wybierz jedną godzinę w sekcji Dodaj skanowania do harmonogramu.Wybierz opcję Zatrzymaj skanowanie po pięciu godzinach od pierwszego skanowania. Kliknij przycisk Dalej i kliknij przycisk Dodaj, aby zaplanować, gdy informacje o skanowaniu są poprawne. Po uzyskaniu obrazów kontrastu fazowego i immunofluorescencji neutrofili uruchom oprogramowanie do analizy mikroskopii żywych komórek.Z widoku wybierz eksperyment z mikroskopią żywych komórek, który chcesz przeanalizować. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy i kliknij przycisk Dalej. Następnie wybierz podstawowy analizator z sekcji Typ analizy i kliknij przycisk Dalej.W sekcji Image Channel (Kanał obrazu) wybierz kolor zielony, usuń zaznaczenie opcji phase (Faza) i kliknij przycisk Next (Dalej). Otwórz okno warstw obrazu, wybierz kolor zielony i odznacz fazę. Wyłącz automatyczne skalowanie w zielonej sekcji i ręcznie ustaw min i max.Następnie otwórz okno czasów skanowania statku i wybierz obrazy przedstawiające odwierty kontroli dodatniej z NET. Otwórz okno ustawień definicji analizy i wpisz NET dla nazwy obiektu. W przypadku segmentacji wybierz opcję Adaptacyjne.Dla progu GCU wybierz od trzech do pięciu i ustaw podział krawędzi w zakresie od minus 10 do zera. Następnie, aby oczyścić, wybierz Wypełnienie otworu do 100 mikrometrów kwadratowych i dostosuj rozmiar do minus jeden piksel. Z pola Filtry wybierz obszar większy niż 200 mikrometrów kwadratowych, Średnia intensywność mniejsza niż 24,6 i Zintegrowana intensywność większa niż 7 000.Następnie kliknij podgląd bieżący lub podgląd wszystkiego, aby zastosować ustawienia. Umieść kursor na różnych strukturach NET i dostosuj ustawienia analizy, aby dostosować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne sieci NET. Jeśli ustawienia analizy NET są poprawne, kliknij przycisk Dalej.Wybierz punkty czasowe i studzienki do analizy w sekcji czasy skanowania i odwierty, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wstaw nazwę definicji w sekcji Zapisz i zastosuj definicję analizy i kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Zakończ, gdy informacje analizy zostaną zweryfikowane i poprawne.Otwórz analizę eksperymentu, klikając analizę w interesującym Cię naczyniu. Następnie otwórz okno metryk wykresu. Następnie kliknij przycisk plusa, aby utworzyć metrykę.Podczas prezentowania danych jako procentowej konfluencji NET wybierz opcję Obszar w sekcji Metryka i wybierz pozycję Konfluencja w sekcji Wartość. Prezentując dane jako procent neutrofili NETting, wybierz opcję Liczba obiektów w sekcji Metryka i wybierz opcję Na obraz w sekcji Wartość. Po skonfigurowaniu ustawień metryki w sekcji Metryki zdefiniowane przez użytkownika wybierz pozycję Zbieganie obszaru sieci NET lub Liczba obiektów sieci NET na obraz.Wybierz wszystkie wymagane punkty czasowe i studzienki do analizy odpowiednio z sekcji Wybierz skany i Wybierz studnię. Na koniec kliknij Eksportuj dane. Stymulacja jonoforem wapnia indukowała szybszą NETozę w porównaniu z PMA, co skutkowało wyższym odsetkiem neutrofili uwalniających NET.NET indukowane przez jonofory wapnia były bardziej rozproszone poza błoną plazmatyczną neutrofili, podczas gdy NET indukowane PMA pozostawały bliżej błony plazmatycznej neutrofili. Tendencję do podwyższonych poziomów NET zaobserwowano, gdy neutrofile były aktywowane powlekanymi kompleksami immunologicznymi, FMLP i kryształami moczanu monosodowego. Uwalnianie NET w odpowiedzi na 23187 zostało całkowicie zahamowane przez CIT-013 przy połowie maksymalnego stężenia hamującego wynoszącym 4,6 nanomola.

real-time-high-throughput-microscopic-quantification-human-neutrophil

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Poznaj wysokoprzepustową mikroskopię do kwantyfikacji uwalniania NET przez ludzkie neutrofile w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia ocenę kinetyki NETosis i farmakologii antagonistów z IC50 4,6 nM dla CIT-013.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów