Name: Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo w modelach mysich. Ta technika umożliwia badanie wpływu interwencji na funkcję monocytów i charakterystykę makrofagów pochodzących z monocytów we krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez granty dla R.A. z NIH (AT006885).

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Wake Forest School of Medicine.
1. Przygotowanie roztworu pochodzącego z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu MCP-1
UWAGA: To jest sterylna procedura.
<ol>
	<li>Oczyść kaptur do hodowli komórkowych środkiem dezynfekującym przed przygotowaniem roztworu pochodzącego z błony podstawnej (np. Matrigel).</li>
	<li>Przygotować pojedynczo zapakowaną sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml i przetrzeć górną część fiolki z roztworem pochodzącym z błony podstawnej wacikiem nasączonym alkoholem przed włożeniem jej do strzykawki.</li>
	<li>Całkowicie rozmrozić na lodzie roztwór pochodzący z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu. 
	ostrożność: Jeśli matryca błony podstawnej zostanie rozmrożona w temperaturze pokojowej (RT), upewnij się, że pozostała niewielka cząsteczka lodu, aby zapobiec żelowaniu roztworu.</li>
	<li>Po rozmrożeniu otworzyć fiolkę i wymieszać MCP-1 lub 1xPBS z 0,1% BSA w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przygotować 1 ml sterylnej strzykawki za pomocą igły 26 G i ostudzić na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy MCP-1, rozpuszczając MCP-1 do końcowego stężenia 50 μg/ml w 1x PBS z 0,1% BSA.</li>
	<li>Rozcieńczyć MCP-1 w 5 ml zimnego roztworu pochodzącego z błony podstawowej do końcowego stężenia 500 ng / ml. Przygotować równą ilość roztworu pochodzącego z błony podstawnej tylko z samym nośnikiem (1x PBS zawiera 0,1% BSA).</li>
	<li>Załadować 500 μl roztworu pochodzącego z błony podstawnej (z MCP-1 lub bez) do zimnej strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przed wykonaniem wstrzyknięcia należy usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki z roztworem zawierającym błonę podstawną, aby zapewnić równomierne uformowanie czopa.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie roztworu pochodzącego z błony podstawnej
<ol>
	<li>Rozpyl 70% etanolu wokół obszaru zabiegowego przed i w trakcie wstrzyknięć, aby zdezynfekować środowisko.</li>
	<li>Aby wywołać znieczulenie, umieść mysz w komorze anestezjologicznej i ustaw przepływomierzO2 na 1 litr/min, a następnie wyreguluj parownik na 2% izofluranu.</li>
	<li>Monitoruj głębokość znieczulenia, monitorując częstość oddechów (szybkość/min), odruch rogówkowy i ruch wąsów.</li>
	<li>Podczas całego zabiegu należy utrzymywać znieczulenie za pomocą stożka nosowego.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy monitorować częstość oddechów (szybkość/min), odruch rogówkowy i ruch wąsów, aby zweryfikować głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, powoli wstrzyknąć (około 100 μl/s) roztwór pochodzący z błony podstawnej podskórnie odpowiednio w prawy (bez MCP-1) i lewy (z MCP-1) bok myszy. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt powolne, czopki żelowe pochodzące z błony podstawnej mogą stać się nieregularnie ukształtowane, a nawet rozdrobnione i trudne do usunięcia.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę przez 20-30 s po wstrzyknięciu, aby zapobiec wyciekowi roztworu i umożliwić utworzenie pojedynczej, gładkiej zatyczki żelowej.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu umieszczenie myszy na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem do czasu wyzdrowienia.</li>
	<li>Przywróć mysz do oryginalnej klatki, gdy mysz zostanie w pełni odzyskana.</li>
</ol>
3. Zbierz zatyczki żelowe pochodzące z błony podstawnej
<ol>
	<li>Zważ dwie oddzielne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdej myszy i oznacz je.</li>
	<li>Trzy dni po wstrzyknięciu roztworu pochodzącego z błony podstawnej, należy poddać mysz eutanazji w komorze anestezjologicznej przy użyciu 3% izofluranu, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.</li>
	<li>Usuń sierść grzbietową myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów lub nałóż krem do depilacji patyczkami z bawełnianą końcówką na 5 minut, a następnie wytrzyj.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę myszy za pomocą kleszczy wokół dolnego kręgu piersiowego i górnego kręgu lędźwiowego i wykonaj nacięcie o długości 2 mm w skórze.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij linię środkową grzbietu myszy od nacięcia do kręgów szyjnych i do 1 cm powyżej połączenia kręgów ogonowych (połączenia ogonowego).</li>
	<li>Oddziel skórę od warstwy mięśniowej i przygwoźdź skórę do platformy z pianki polistyrenowej.</li>
	<li>Ostrożnie przytrzymaj włóknistą kapsułkę, która zawiera korek żelowy pochodzący z błony podstawnej, za pomocą cienkich kleszczyków i wyjmij włóknistą kapsułkę za pomocą cienkich nożyczek, aby wyczyścić zatyczkę.</li>
	<li>Usunąć oczyszczony korek żelowy pochodzący z błony podstawnej i przenieść do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (patrz 3.1).</li>
	<li>Zważyć probówkę do mikrowirówki z oczyszczonym korkiem żelowym pochodzącym z błony podstawnej i obliczyć masę korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej.</li>
</ol>
4. Trawienie zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej
<ol>
	<li>Rozmrozić dispazę (10 ml) na lodzie.</li>
	<li>Zmiel korek żelowy pochodzący z błony podstawnej w probówce mikrowirówki za pomocą czystych, drobnych nożyczek.</li>
	<li>Dodać 800 μl dypazy do każdej probówki mikrowirówki zawierającej korek żelowy pochodzący z błony podstawnej.</li>
	<li>Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 s, aby zakłócić działanie wtyczki.</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy 1 400 obr./min w termomikserze w celu całkowitego rozpuszczenia korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej.</li>
	<li>Po 2 godzinach odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS, odwracając lub stukając.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 300 μl PBS.</li>
	<li>Pobrać 50 μl zawiesiny komórkowej do oddzielnej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 0,5 μl kalceiny AM (1 M) do zawiesiny komórek. 
	nuta: Calceina AM jest zielonym fluorescencyjnym barwnikiem żywotności komórek, który gromadzi się tylko w żywych komórkach.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Policz zielone fluorescencyjne (żywe) i niefluorescencyjne (martwe) komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
</ol>
5. Określanie składu komórek w zawiesinie komórek za pomocą analizy jednokomórkowego Western Blot (scWB)
<ol>
	<li>Przed użyciem należy ponownie nawodnić chip scWB w 15 ml 1x buforu zawiesiny na szalce Petriego przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml rozcieńczonej zawiesiny jednokomórkowej (10 000-100 000 komórek/ml) do uwodnionego chipa. Ułóż powierzchnię na dnie szalki Petriego o średnicy 10 cm. Upewnij się, że powierzchnia jest płaska.</li>
	<li>Przykryj szalkę Petriego pokrywką, aby zapobiec wysuszeniu i pozwól komórkom osiąść przez 5-15 minut według gradientu.</li>
	<li>Umieść chip pod mikroskopem jasnego pola i sprawdź studzienki w 10-krotnym powiększeniu. 
	nuta: Około 15-20% mikrostudzienek powinno być zajętych przez pojedynczą komórkę, mniej niż 2% studzienek powinno zawierać 2 lub więcej komórek</li>
	<li>Przechylić 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą wiór o 45 stopni.</li>
	<li>Umyj chip za pomocą bufora zawiesinowego 1x, aby usunąć nieprzechwycone komórki z powierzchni chipa poprzez delikatne pipetowanie od góry do dołu chipa. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Przygotuj jednokomórkowy instrument zachodni.</li>
	<li>Ustaw czas lizy, czas elektroforezy i czas przechwytywania UV. Aby przeanalizować rekrutowane makrofagi odzyskane z czopa żelowego pochodzącego z błony podstawnej, użyj następujących ustawień: czas lizy: 0 s; czas elektroforezy: 160 s; Czas przechwytywania UV 240 s.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj chip do ogniwa elektroforetycznego jednoogniwowego zachodniego instrumentu, skierowanego w stronę żelu. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić żelowej strony chipa.</li>
	<li>Wlej bufor do lizy/pracy do komory i całkowicie przykryj cały jednokomórkowy chip zachodni. Rozpocznij lizę komórek.</li>
	<li>Uruchom instrument scWB przy użyciu ustawienia wymienionego w 5.8.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu przenieś wiór na 10-centymetrową szalkę Petriego i umyj wiór dwukrotnie za pomocą 1x bufora myjącego przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego (anty-winkulina: 1:10; anty-CD45: 1:15, anty-CD11b: 1:20, anty-F4/80: 1:10) w całkowitej objętości 80 μl rozcieńczalnika przeciwciała (zmieszać 8 μl przeciwciała 1 plus 8 μl przeciwciała 2 plus 64 μl rozcieńczalnika).</li>
	<li>Dodać 80 μl roztworu przeciwciała pierwotnego do komory sondowania przeciwciał i opuścić chip żelową stroną do dołu, tak aby roztwór przeciwciała przeniknął przez chip.</li>
	<li>Inkubować z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj frytki trzy razy przez 10 minut w 1x buforze myjącym na shakerze.</li>
	<li>Umyj frytki raz przez 10 minut w wodzie na shakerze, aby odsolić żel.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:20 przeciwciała drugorzędowego o całkowitej objętości 80 μl (zmieszać 2 μl przeciwciała drugorzędowego plus 78 μl rozcieńczalnika).</li>
	<li>Inkubować chip z przeciwciałem wtórnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.</li>
	<li>Umyj frytki trzy razy przez 10 minut z 1x buforem myjącym na shakerze.</li>
	<li>Zakręć wiórem za pomocą suwaka, aby usunąć pozostały bufor myjący.</li>
	<li>Zeskanuj chip na dwulaserowym skanerze mikromatrycowym z rozdzielczością 5 μm w kanale widmowym fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla scWB.</li>
</ol>
6. Zdejmowanie chipa scWB
<ol>
	<li>Przechowuj zeskanowany chip w buforze do mycia, aż będzie gotowy do rozebrania.</li>
	<li>Umieść łaźnię wodną w dygestorium.</li>
	<li>Umieść stojak na probówki o pojemności 50 ml w łaźni wodnej z wodą znajdującą się zaledwie 1 cm nad stojakiem i ustaw temperaturę wody na 60 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do usuwania odpędów. Na 1 l roztworu buforowego do oddzielania rozpuścić 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) i 20 g SDS w 900 ml wody destylowanej i dostosować pH. Następnie napełnij wodą destylowaną do 1L. Dodaj 0,8% (v/v) β-merkaptoetanolu (β-ME; 14,3 M) bezpośrednio przed każdym użyciem.</li>
	<li>Po wstępnym skanowaniu umieść chip na 10-centymetrowej szalce Petriego przed usunięciem izolacji.</li>
	<li>Na każdy chip weź 40 ml buforu do oddzielania i dodaj 320 μl β-ME. 
	UWAGA: β-ME jest toksyczny i niebezpieczny dla ludzi i środowiska. Poniższą procedurę należy wykonać w dygestorium.</li>
	<li>Umieść chip w kanistrze i uszczelnij kanister parafilmem, aby zapobiec przedostawaniu się wody do kanistra.</li>
	<li>Umieść kanister w stojaku na probówki we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej.</li>
	<li>Inkubować przez 90 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wiór z kanistra i umieść go na świeżej szalce Petriego.</li>
	<li>Krótko umyj frytki raz za pomocą 1x bufora do mycia. Następnie dodaj 15 ml 1x buforu myjącego do szalki Petriego.</li>
	<li>Myj frytki przez 15 minut na shakerze. Powtórz krok prania cztery razy. 
	nuta: Chip jest gotowy do podania kolejnego przeciwciała pierwszorzędowego (patrz kroki 5.12 - 5.21).</li>
</ol>

<ol><li>Moore, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Cell. 145 (3), 341-355 (2011).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+immunity%2C+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li>
<li>Akiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein%2C+a+specific+inhibitor+of+tyrosine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).</li>
<li>Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes%3A+protagonists+of+infarct+inflammation+and+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction.</a> Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).</li>
<li>Gosling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+deficiency+reduces+susceptibility+to+atherosclerosis+in+mice+that+overexpress+human+apolipoprotein+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).</li>
<li>Fantuzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CCR2+expression+and+functional+response+to+monocyte+chemotactic+protein+%28MCP-1%29+during+the+differentiation+of+human+monocytes%3A+role+of+secreted+MCP-1+in+the+regulation+of+the+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response.</a> Blood. 94 (3), 875-883 (1999).</li>
<li>Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lesion+formation+in+CCR2-%2F-+mice+reveals+a+role+for+chemokines+in+the+initiation+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis.</a> Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).</li>
<li>Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR2+expression+and+monocyte+chemoattractant+protein-1-mediated+chemotaxis+in+human+monocytes.+A+regulatory+role+for+plasma+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Davies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+the+adhesion+molecules+ICAM-1%2C+VCAM-1%2C+PECAM%2C+and+E-selectin+in+human+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis.</a> Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).</li>
<li>Anderson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesterol-lowering+and+antioxidant+therapy+on+endothelium-dependent+coronary+vasomotion+%28see+comments%29%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments).</a> New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).</li>
<li>Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+how+macrophages+orchestrate+resolution+of+inflammation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair.</a> Frontiers in Immunology. 2, (2011).</li>
<li>Qiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+Oxidative+Stress+Induced+by+Metabolic+Disorders+Amplifies+Macrophage+Chemotactic+Responses+and+Accelerates+Atherogenesis+and+Kidney+Injury+in+LDL+Receptor-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).</li>
<li>Ullevig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+Oxidase+4+Mediates+Monocyte+Priming+and+Accelerated+Chemotaxis+Induced+by+Metabolic+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress.</a> Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).</li>
<li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+MAPK+phosphatase+1+controls+monocyte+migration+and+macrophage+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).</li>
<li>Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+MKP-1+is+a+Sensor+of+the+Metabolic+Environment+and+Regulates+Function+and+Phenotypic+Fate+of+Monocyte-Derived+Macrophages+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 34223(2016).</li>
<li>Ponce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+formation%3A+an+in+vitro+matrigel+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).</li>
<li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+assays%3A+a+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).</li>
<li>Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+14-3-3zeta+controls+monocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).</li>
<li>Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Thiol+Redox+Signaling+in+Monocytes+and+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).</li>
<li>Tavakoli, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+thiol+redox+signaling+in+the+macrophage+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).</li>
<li>Ullevig, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-Glutathionylation+Mediates+Macrophage+Responses+to+Metabolic+Cues+from+the+Extracellular+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).</li>
</ol>

Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez ProteinSimple, markę Bio-Techne.

Opracowaliśmy test chemotaksji in vivo, wykorzystując unikalne właściwości fizyczne matrycy pochodzącej z błony podstawnej oraz możliwość załadowania tej unikalnej matrycy chemokinami i wstrzyknięcia jej myszom. Test pozwala nam ocenić u żywych myszy reakcję monocytów (i makrofagów) na chemokiny, jak pokazano tutaj dla MCP-1, oraz wpływ manipulacji genetycznej lub ekspozycji farmakologicznej, dietetycznej i innych środowiskowych na chemotaksję monocytów. Ponieważ gradient chemokin, który tworzymy u tych myszy, jest zasadniczo niezależny od ekspozycji genetycznej, farmakologicznej, dietetycznej lub środowiskowej, zmiany w aktywności chemotaktycznej monocytów faktycznie odzwierciedlają zmiany funkcjonalne w tych monocytach i, jak wykazaliśmy wcześniej, również przeprogramowanie zarówno na poziomie białka, jak i transkrypcji17,20. Stwierdziliśmy, że stres metaboliczny u myszy zwiększa odpowiedź monocytów na chemoatraktant i że ta aktywność hiperchemotaktyczna koreluje ze zwiększoną S-glutationylacją białka, odwracalną, zależną od redoks potranslacyjną modyfikacją białka, która w większości przypadków prowadzi do utraty funkcji enzymatycznej i białkowej21,22, a w niektórych przypadkach nawet sprzyja degradacji białek16,23.
Aby pomyślnie przeprowadzić tę procedurę i uzyskać optymalne wyniki za pomocą tego testu, bardzo ważne jest, aby dokładne objętości roztworu pochodzącego z błony podstawnej były wstrzykiwane powoli, aby utworzyć pojedynczy, dobrze uformowany czop, a włókniste kapsułki należy całkowicie usunąć, aby uzyskać czyste czopy, gdy zbiera się korki żelowe pochodzące z błony podstawnej, ułatwiają rozpuszczenie całej czopki w roztworze dypazy. Nasze dane pokazują, że pozostawienie czopa u zwierząt na trzy dni optymalizuje 1) intensywność sygnału, tj. liczbę monocytów i makrofagów rekrutowanych do każdej czopki, 2) selektywność sygnału, tj. zawartość monocytów i makrofagów w całkowitych populacjach komórek oraz 3) specyficzność sygnału, tj. wzrost monocytów i makrofagów w odpowiedzi na MCP-1 w porównaniu z nośnikiem. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób najnowocześniejsze podejścia oparte na pojedynczych komórkach w połączeniu z testem czopów żelowych pochodzących z błony podstawnej można wykorzystać do scharakteryzowania monocytów rekrutowanych do zatyczek, a tym samym uzyskania migawki potencjalnego fenotypu makrofagów pochodzących z monocytów, które są rekrutowane do miejsc uszkodzenia w dowolnym modelu myszy w odpowiedzi na określone dane genetyczne, interwencje farmakologiczne, dietetyczne lub środowiskowe.
Istnieje szereg ograniczeń testu, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, obsługa myszy, w tym znieczulenie, wstrzyknięcie roztworu pochodzącego z błony podstawnej i chirurgiczne rozwarstwienie, wymaga praktyki w generowaniu pojedynczych zatyczek i powtarzalnych danych. Po drugie, podczas gdy większość komórek rekrutowanych do zatyczek załadowanych MCP-1 to monocyty i makrofagi, znaczna liczba nie jest. Może to mieć wpływ na interpretację innych, nieopartych na pojedynczych komórkach testów analitycznych przeprowadzonych na tej populacji komórek. Wreszcie, ponieważ warunki lizy komórek dla scWB są łagodne, odległości migracji białek mogą różnić się od standardowego WB i mogą nie korelować z wielkością białka. W związku z tym zarówno czas lizy komórek, jak i ich trwania musi zostać zweryfikowany dla każdego nowego białka, które ma być badane, i dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego.

Rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów jest niezbędna do rozwoju przewlekłych chorób zapalnych związanych z zaburzeniami metabolicznymi, w tym miażdżycą i otyłością1,2,3,4. Liczba makrofagów pochodzących z monocytów w miejscach uszkodzenia tkanek, a także ich plastyczność mają kluczowe znaczenie dla homeostazy i naprawy tkanek. Zarówno niedostateczna, jak i nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów może upośledzać gojenie się ran5. Wywołanie miejscowego zapalenia tkanek, na przykład poprzez akumulację i utlenianie lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w ścianie aorty lub zapalną aktywację adipocytów przez kwasy tłuszczowe lub lipopolisacharyd bakteryjny przeciekający przez barierę jelitową, prowadzi do uwolnienia mediatorów stanu zapalnego, w tym chemokin, takich jak białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 należy do rodziny chemokinów C-C i jest kluczowym chemoatraktantem odpowiedzialnym za rekrutację makrofagów pochodzących z monocytów do miejsc zapalenia i uszkodzenia tkanek6,7,8,9,10. Zapalna aktywacja śródbłonka naczyń krwionośnych powoduje ekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych 1 (VCAM-1)11,12, umożliwiając krążącym monocytom aktywowanym przez MCP-1 toczenie się, mocne przyleganie, a następnie transmigrację do przestrzeni podśródbłonkowej12. Naciekające monocyty różnicują się w makrofagi, które mogą być aktywowane do fenotypu prozapalnego, napędzając ostry proces zapalny. Napędzane przez mikrośrodowisko, prozapalne makrofagi mogą przekształcać się w makrofagi rozwiązujące stan zapalny, które odgrywają kluczową rolę w oczyszczaniu komórek zapalnych, usuwaniu sygnałów prozapalnych i zakończeniu naprawy tkanek i gojenia się ran12,13.
Przewlekły stres metaboliczny pobudza monocyty do radykalnego zwiększenia reakcji na chemo-atraktanty i zwiększenia rekrutacji monocytów, a my wykazaliśmy, że zaszczepione monocyty powodują powstawanie makrofagów z rozregulowanymi programami aktywacji i stanami polaryzacji14,15,16. Gruntowanie monocytów sprzyja miażdżycy, otyłości i prawdopodobnie innym przewlekłym chorobom zapalnym związanym z zaburzeniami metabolicznymi, takimi jak stłuszczeniowe zapalenie wątroby, choroby nerek i prawdopodobnie rak. Aby ocenić i określić ilościowo torowanie monocytów w mysich modelach chorób ludzkich, opracowaliśmy nową technikę oceny stanu primingu monocytów krwi poprzez pomiar aktywności chemotaktycznej in vivo14,15,16,17. Nasze podejście polega na wstrzyknięciu żelu pochodzącego z błony podstawnej załadowanego chemoatraktantem - zwykle używamy MCP-1 - lub nośnika odpowiednio w lewą i prawą flankę myszy. Po ostrożnym wstrzyknięciu podskórnym, żel pochodzący z błony podstawnej utworzy pojedynczą czop, z której chemokiny mogą dyfundować i tworzyć określony gradient chemotaktowy, na który nie ma wpływu stan metaboliczny lub zapalny otaczającej tkanki lub myszy biorcy.
Żel pochodzący z błony podstawnej, którego używamy do naszego testu, to rozpuszczony preparat błony podstawnej, wyekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), guza bogatego w takie białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ta złożona mieszanina białkowa zawiera lamininę (60%), kolagen IV (30%), cząsteczkę pomostową entaktynę (8%) i szereg czynników wzrostu. Test zatyczki macierzy błony podstawnej został pierwotnie opracowany w celu zbadania angiogenezy w odpowiedzi na różne czynniki wzrostu18,19. Jednak w celu zbadania chemotaksji monocytów ważne jest użycie żelu pochodzącego z błony podstawnej zubożonej w czynnik wzrostu, aby zminimalizować rekrutację komórek śródbłonka i angiogenezę. To, co sprawia, że Matrigel (zwany dalej żelem pochodzącym z błony podstawnej) jest wyjątkowy i szczególnie użyteczny, to fakt, że w temperaturach poniżej 10 °C upłynnia się, co pozwala na rozpuszczenie chemokin. W temperaturach powyżej 22 °C roztwór pochodzący z błony podstawnej szybko ulega przemianie fazowej i szybko tworzy hydrożel. Zatyczki mogą być chirurgicznie wycinane, czyszczone i rozpuszczane za pomocą neutralnej metaloproteazy pochodzącej z Bacillus w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które można analizować na sortowniku komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), za pomocą RNAseq, RNA pojedynczej komórki i wielu innych technik omicznych. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizy Western blot pojedynczej komórki do scharakteryzowania populacji komórek rekrutowanych do zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej jeden, trzy lub pięć dni po wstrzyknięciu.

<table><tbody><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Griner Bio-ONE</td><td>664 160</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor zawiesinowy</td><td>białkoPROSTY</td><td>R101</td><td></td></tr><tr><td>15 cm szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>2194705</td><td></td></tr><tr><td>5% bufor myjący</td><td>białko</td><td>R252</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik</td><td>przeciwciała Prosty</td><td>042-203</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Microfuge 22R Wirówka</td></tr><tr><td>Serim bydlęcy Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-89474</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (D4H7K) królik mAb</td><td>Technologie sygnału komórkowego</td><td>727987S</td><td></td></tr><tr><td>CD68/SR-D1 (FA-11)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33337SS</td><td></td></tr><tr><td>Celometr Vision</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Sypsor</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjny</tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG [NL557]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NL004</td><td>NL 557 koniugat</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe przeciw szczurom IgG (H+L) [DyLight 650]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-75655</td><td>Koniugat DyLight 650</td></tr><tr><td>F4/80 (CI-A3-1)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-404SS</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>effendorf</td><td>22331</td><td>Thermomixer</td></tr><tr><td>Liza/Running buffer</td><td>białko proste</td><td>R200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix (zredukowany czynnik Grwoth)</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Skaner</td></tr><tr><td>mikromatrycowy</td><td>10 ml PerkinElmer</td><td>ScanArray Gx</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>ThermoFisher</td><td>Evos fl</td><td></td></tr><tr><td>Milo</td><td>proteinsimple</td><td></td><td>Jednokomórkowa zachodnia</td></tr><tr><td>igła</td><td>BD</td><td>305111</td><td>26 G</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora pomiarowa</td><td>proteinsimple</td><td>035-020</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko myszy CCL2/JE/MCP-1</td><td>R& D</td><td>479-JE-050</td><td></td></tr><tr><td>scWEST chip</td><td>proteinsimple</td><td>C300</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Bioexpress</td><td></td><td>Gene mate wytrząsarka orbitalna</td></tr><tr><td>Jednokomórkowy zachodni pojemnik na chipy</td><td>proteinsimple</td><td>035-118</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td> ślizgowe <td>Labnet</td><td>C1303-T</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 166-500</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309602</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Tris-Chlorowodorek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 153-500</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>proteinsimple</td><td>035-020</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Homeostaza i naprawa tkanek są krytycznie zależne od rekrutacji makrofagów pochodzących z monocytów. Zarówno niedostateczna, jak i nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów może upośledzać gojenie się ran. Wykazaliśmy, że diety wysokotłuszczowe i wysokocukrowe sprzyjają pobudzaniu i dysfunkcji monocytów, przekształcając zdrowe monocyty krwi w fenotyp hiperchemotaktyczny gotowy do różnicowania się w makrofagi o rozregulowanych profilach aktywacji i upośledzonej plastyczności fenotypowej. Uważa się, że nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów i rekrutacja makrofagów o rozregulowanych profilach aktywacji jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju przewlekłych chorób zapalnych związanych z zaburzeniami metabolicznymi, w tym miażdżycą i otyłością. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie aktywności chemotaktycznej monocytów krwi jako biomarkera pobudzania i dysfunkcji monocytów oraz scharakteryzowanie fenotypu makrofagów, w który monocyty krwi są gotowe do różnicowania się w tych modelach mysich. Korzystając z analizy Western blot pojedynczych komórek, pokazujemy, że po 24 godzinach 33% komórek zrekrutowanych do wypełnionych MCP-1 żelowych czopów pochodzących z błony podstawnej wstrzykniętych myszom to monocyty i makrofagi; 58% po 3 dniu. Jednak w 5 dniu liczba monocytów i makrofagów znacznie się zmniejszyła. Wreszcie pokazujemy, że testy te pozwalają również na izolację żywych makrofagów z chirurgicznie pobranych zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej, które można następnie poddać późniejszej charakterystyce za pomocą analizy Western blot pojedynczej komórki.

Aby ocenić odpowiedź monocytów krwi na chemoatraktanty, wstrzyknęliśmy roztwór pochodny z błony podstawnej z nośnikiem oraz roztwór z MCP-1 w lewy i prawy bok każdej myszy. Zrąbki żelu pochodnego z błony podstawnej usunięto 1, 3 i 5 dni po wstrzyknięciach, rozpuszczono, a następnie policzono komórki zrekrutowane do każdej zrąbki (Rysunek 1A). Odejmując liczbę komórek w zrąbce z nośnikiem (słupki puste) od liczby komórek w zrąbce z MCP-1 (słupki pełne), otrzymaliśmy liczbę komórek zrekrutowanych specyficznie w odpowiedzi na MCP-1 (Δ Liczba Komórek, Rysunek 1B). Zaobserwowaliśmy przyspieszoną, specyficzną dla MCP-1 rekrutację i akumulację komórek w okresie 5 dni, przy czym tempo wzrosło z 31,000 cells/day (Dzień 1) do 78,000 cells/day (Dzień 3) i 136,000 cells/day w dniu 5 (Rysunek 1B).
Aby zidentyfikować typy komórek, które wniknęły do żelowych czopów pochodzących z błony podstawnej, poddano komórki wyizolowane z każdego czopa analizie Western blot pojedynczych komórek (scWB), badając ekspresję CD45, CD11b i F4/80 w celu zidentyfikowania monocytów (CD11b+F4/80-), makrofagów (CD11b+F4/80+ oraz CD11b-F4/80+) i pozostałych leukocytów niebędących monocytami (CD45+CD11b-F4/80-) (Rysunek 2). Następnie na chipach scWB badano obecność winkuliny, aby określić całkowitą liczbę komórek na każdym żelu i potwierdzić zajęcie mikrowycieków na chipie scWB przez pojedyncze komórki. Procent monocytów w żelowych czopach pochodzących z błony podstawnej z dodatkiem MCP-1 był niski w 1. dniu (20%), osiągnął szczyt w 3. dniu (47%), a następnie spadł do 14% w 5. dniu (Rysunek 2D). Liczba makrofagów w żelowych czopach pochodzących z błony podstawnej z dodatkiem MCP-1 rosła stale od 13% w 1. dniu, do 22% w 3. dniu i 23% w 5. dniu. W przypadku czopów z MCP-1 odsetek monocytów i makrofagów w wyizolowanej populacji komórek był najwyższy w 3. dniu: 31% w czopach z nośnikiem (Rysunek 3A) i 58% w czopach z MCP-1 (Rysunek 3B), co wskazuje, że po 3 dniach zdecydowana większość komórek zwerbowanych przez chemotaksję zależną od MCP-1 to monocyty i makrofagi. Mimo że całkowita liczba monocytów i makrofagów była wyższa w 5. dniu w porównaniu z 3. dniem (Rysunek 3C i D), ze względu na znacznie wyższą proporcję monocytów i makrofagów w całkowitej populacji komórek (Rysunek 3A i B), liczba komórek w 3. dniu dokładniej odzwierciedla chemotaksję i rekrutację monocytów z krwi. Dlatego rutynowo wstrzykujemy roztwór pochodzący z błony podstawnej na trzy dni przed uśpieniem zwierząt. Nie określono, czy wszystkie makrofagi zwerbowane przez MCP-1 pochodzą z monocytów, czy też przyczyniły się do tego makrofagi rezydentne zwerbowane z sąsiednich tkanek.
Analiza statystyczna przedstawionych tutaj danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania analitycznego (np. SigmaPlot 14). Do porównania wartości średnich między grupami eksperymentalnymi zastosowano analizę ANOVA, a następnie test LSD Fischera. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± SD z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. Wyniki uznano za istotne statystycznie przy poziomie P &lt; 0.05.
<img alt="Wykres proliferacji komórek, MCP-1 vs. Vehicle, wykres słupkowy z istotnością statystyczną, zaznaczone wartości P." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilościowe oznaczenie komórek zrekrutowanych do podskórnych wtyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej. (A) Bezwzględna liczba komórek dla wtyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej obciążonych vehicle (słupki puste) oraz MCP-1 (słupki wypełnione). (B) Liczba komórek zrekrutowanych do wtyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej przez MCP-1, obliczona jako różnica w liczbie komórek między wtyczkami obciążonymi MCP-1 a wtyczkami obciążonymi vehicle. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD (n=4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy ekspresji białek i składu komórkowego; porównanie dni, kontrola vs MCP-1; analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza populacji komórek zrekrutowanych do wtyków żelowych pochodzących z błony podstawnej za pomocą analizy single cell western blot. (A+B) Przedstawiono reprezentatywne przykłady analizy scWB wtyku obciążonego nośnikiem (Kontrola) oraz wtyku z MCP-1 (MCP-1), wyizolowanych od myszy trzy dni po wstrzyknięciu. Chipy znakowano przeciwciałami przeciwko CD45, CD11b i F4/80, a następnie fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi zgodnie z opisem w Protokole. Intensywność fluorescencji znakowanego prążka dla każdej pojedynczej komórki przedstawiono jako pole powierzchni piku. (C+D) Populacje komórek zidentyfikowano jako monocyty (CD11b+F4/80-, <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, diagram; wektory sił w równowadze; fizyczne studium edukacyjne, układ dźwigni." src="/files/ftp_upload/59706/59706img01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Obraz 1">), makrofagi (CD11b+F4/80+ oraz CD11b-F4/80+, <img alt="Czerwone koło na białym tle, kształt, podstawowe pojęcie geometrii, symbol graficzny." src="/files/ftp_upload/59706/59706img02.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Obraz 2">) lub nie-monocytarne leukocyty (CD45+, <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, diagram ilustrujący zasady równowagi sił i stabilności." src="/files/ftp_upload/59706/59706img03.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Obraz 3">). Pozostałe komórki oznaczono jako „inne” (<img alt="Równowaga statyczna ΣFx=0 diagram mechaniki z wektorami sił, studium fizyczne." src="/files/ftp_upload/59706/59706img04.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Obraz 4">). Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza zawartości monocytów i makrofagów, wykresy słupkowe i liniowe; porównanie liczby komórek w zależności od dnia, efekt MCP-1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59706/59706fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zawartość monocytów i makrofagów w żelowych zatyczkach pochodnych błony podstawnej. Analiza ilościowa zawartości zrekrutowanych monocytów i makrofagów w zatyczkach z nośnikiem oraz zatyczkach z MCP-1, usuniętych w 1., 3. i 5. dniu po iniekcji. Wartości przedstawiono jako procent całkowitej populacji komórek (A + B) oraz jako bezwzględną liczbę komórek na zatyczkę (C + D). Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59706/59706fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Metodologia ta pozwala nam określić ilościowo aktywność chemotaktyczną monocytów krwi u żywych zwierząt oraz zbadać wpływ złej diety na funkcję monocytów i mechanizmy leżące u ich podstaw. Makrofagi pochodzące z monocytów można izolować i analizować przy użyciu różnych podejść, w tym technik jednokomórkowych i omicznych, które zapewniają obraz stanu zdrowia miejsca monocytów krwi w modelach mysich. Dzisiejsza procedura zostanie przeprowadzona przez dr Young Joo Ahn, adiunkta w moim laboratorium, oraz dr Luxi Wang, doktora habilitowanego w moim laboratorium.Przed rozpoczęciem zabiegu należy oczyścić kaptur do hodowli komórkowych środkiem dezynfekującym i całkowicie rozmrozić roztwór pochodzący z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu na lodzie. Wyposaż pojedyncze sterylne strzykawki o pojemności jednego mililitra w igły o rozmiarze 26 i umieść igły na lodzie. Po rozmrożeniu roztworu przetrzyj górną część fiolki z roztworem pochodzącym z błony podstawnej wacikiem nasączonym alkoholem przed załadowaniem 500 mikrolitrów roztworu uzupełnionego lub bez atraktantu chemioterapii do każdej mililitrowej strzykawki.Następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki zawierającej roztwór z membraną podstawną, aby zapewnić równomierne tworzenie się czopów. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, powoli wstrzyknij całą objętość roztworu pochodzącego z błony podstawnej bez dodawania MCP-1 w ilości około 100 mikrolitrów na sekundę podskórnie w prawą stronę znieczulonej myszy. I całe 500 mikrolitrów roztworu pochodzącego z błony podstawnej uzupełnionego MCP-1 do lewej flanki zwierzęcia.Trzymać strzykawkę na miejscu przez 20 do 30 sekund po wstrzyknięciu, aby zapobiec wyciekaniu roztworu i umożliwić utworzenie się pojedynczej, gładkiej zatyczki żelowej przed umieszczeniem myszy na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Trzy dni po wstrzyknięciu należy usunąć włosy na grzbiecie zwierzęcia, któremu wstrzyknięto czop i za pomocą kleszczy chwycić skórę wokół dolnego kręgu piersiowego i górnego kręgu lędźwiowego. Wykonaj nacięcie w skórze o długości dwóch milimetrów i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietu myszy od kręgów szyjnych do jednego centymetra powyżej połączenia kręgowego rozpieszczonego.Oddziel skórę od warstwy mięśniowej i przypnij skórę do platformy z pianki polistyrenowej. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, ostrożnie chwyć włóknistą kapsułkę, która zawiera korek żelowy pochodzący z błony podstawnej i użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć włóknistą kapsułkę. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wyczyścić wtyczkę.Następnie przenieś oczyszczony korek żelowy pochodzący z błony podstawnej do odpowiednio oznakowanej i zważonej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Ponownie zważyć rurkę, aby obliczyć wagę korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej. Do trawienia czopa żelowego pochodzącego z błony podstawnej, użyj czystych, drobnych nożyczek, aby zmielić korek żelowy pochodzący z błony podstawnej w każdej probówce mikrowirówki i dodaj 800 mikrolitrów wyparcia do zatyczek.Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby rozerwać korki i umieść probówki mikrowirówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny w termomikserze z prędkością 1400 obrotów na minutę, aby całkowicie rozpuścić korki żelowe pochodzące z błony podstawnej. Pod koniec inkubacji należy rozsiać fragmenty czopa przez dwukrotne odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach PBS. Przenieś 50 mikrolitrów każdej zawiesiny komórek do nowych mikroprobówek wirówkowych i oznacz komórki w nowych probówkach 0,5 mikrolitra kalcyny.Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla policz liczbę żywych zielonych fluorescencyjnych dodatnich i martwych komórek niefluorescencyjnych na automatycznym liczniku komórek. W przypadku jednokomórkowej analizy Western blot dodaj jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny jednokomórkowej do uwodnionego jednokomórkowego chipa Western blot na dnie 10-centymetrowej szalki Petriego. Po pięciu do 15 minutach zbadaj chip pod mikroskopią w jasnym polu.Około 15 do 20% mikrostudzienek powinno być zajętych przez pojedynczą komórkę, a mniej niż dwa procent studzienek powinno zawierać dwie lub więcej komórek. Jeśli chip został prawidłowo załadowany, przechyl naczynie o 45 stopni i umyj frytek trzykrotnie buforem zawieszenia, aby usunąć wszelkie nieprzechwycone komórki. Po ostatnim umyciu ostrożnie i załaduj chip do ogniwa elektroforetycznego jednokomórkowego zachodniego instrumentu, żelową stroną do góry i przykryj cały jednokomórkowy chip Western blot buforem do lizy.Zainicjuj lizę komórek i uruchom instrument zgodnie z odpowiednimi parametrami eksperymentu. Pod koniec cyklu spłucz wióry dwoma 10-minutowymi myciami ze świeżym buforem do prania na pranie w temperaturze pokojowej. Po drugim przemyciu dodaj 80 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do komory sondowania przeciwciał i opuść chip żelową stroną do dołu, tak aby roztwór przeciwciała przesączył się przez chip.Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej umyj frytki trzy razy w buforze myjącym i raz w wodzie na shakerze. Inkubować chip z odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj chip trzykrotnie buforem do przemywania i zakręć wiórem na szkiełku, aby usunąć pozostały bufor do mycia.Aby usunąć jednokomórkowy chip Western blot, umieść 15-mililitrowy stojak na probówki w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza, tak aby woda znajdowała się zaledwie jeden centymetr nad stojakiem. W dygestorium dodaj 40 mililitrów buforu odpędowego i 320 mikrolitrów etanolu beta morcepta do kanistra. Umieść chip na 10-centymetrowej szalce Petriego wewnątrz kanistra i zamknij kanister Parafilmem.Następnie umieść kanister w stojaku na rurki w łaźni wodnej. Po 90 minutach ostrożnie przenieś wiór na nową szalkę Petriego i krótko umyj wiór raz buforem do mycia, a następnie dodaj 15 mililitrów świeżego buforu myjącego do szalki Petriego na 15-minutowe mycie na shakerze. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki zrekrutowane do każdej czopki policzono po jednym, trzech i pięciu dniach po wstrzyknięciu.Odejmując liczbę komórek w zatyczkach załadowanych nośnikiem od liczby komórek w zatyczkach załadowanych MCP-1, obliczono następnie liczbę komórek specjalnie zrekrutowanych w odpowiedzi na atraktant chemioterapii. W ciągu pięciu dni zaobserwowano przyspieszoną rekrutację i akumulację komórek specyficznych dla MCP-1, przy czym tempo wzrostu z 31 000 komórek dziennie po jednym dniu wstrzyknięcia do 136 000 komórek dziennie pięć dni po wstrzyknięciu. Następnie wykorzystano jednokomórkową analizę Western blot w celu zidentyfikowania różnych typów komórek rekrutowanych do czopów pochodzących z błony podstawnej, zgodnie z ich ekspresją specyficznych markerów komórek odpornościowych.Na przykład odsetek monocytów w zatyczkach żelowych pochodzących z błony podstawnej obciążonych MCP-1 był niski w pierwszym dniu i osiągnął szczyt w trzecim dniu, po czym ponownie spadł w piątym dniu, podczas gdy liczba makrofagów stale rosła przez cały okres badania. W przypadku czopów załadowanych MCP-1 odsetek monocytów i makrofagów w izolowanej populacji komórek był najwyższy w trzecim dniu, co wskazuje, że po trzech dniach zdecydowana większość komórek rekrutowanych przez chemotaksję zależną od MCP-1 stanowiły monocyty i makrofagi. Mimo że całkowita liczba monocytów i makrofagów jest zwykle wyższa w piątym dniu w porównaniu z trzecim dniem, liczba komórek w trzecim dniu dokładniej odzwierciedla chemotaksję i rekrutację monocytów we krwi obwodowej, a zatem trzeci dzień jest zalecany do bezpośrednich analiz czopów błony podstawnej.Pomyślne pozyskanie pojedynczych komórek do dalszej analizy zależy od dokładności wtrysku i całkowitego usunięcia zatyczek. Cytometria przepływowa, jednokomórkowy Western blot, sekwencjonowanie masowe lub jednokomórkowe RNA oraz inne procedury omiczne mogą być stosowane do oceny charakterystyki i fenotypów rekrutowanych monocytów i makrofagów pochodzących z monocytów.

quantification-monocyte-chemotactic-activity-vivo-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo w modelach mysich. Ta technika umożliwia badanie wpływu interwencji na funkcję monocytów i charakterystykę makrofagów pochodzących z monocytów we krwi.

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Przeglądaj więcej filmów