Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Metodologia ta pozwala nam określić ilościowo aktywność chemotaktyczną monocytów krwi u żywych zwierząt oraz zbadać wpływ złej diety na funkcję monocytów i mechanizmy leżące u ich podstaw. Makrofagi pochodzące z monocytów można izolować i analizować przy użyciu różnych podejść, w tym technik jednokomórkowych i omicznych, które zapewniają obraz stanu zdrowia miejsca monocytów krwi w modelach mysich. Dzisiejsza procedura zostanie przeprowadzona przez dr Young Joo Ahn, adiunkta w moim laboratorium, oraz dr Luxi Wang, doktora habilitowanego w moim laboratorium.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy oczyścić kaptur do hodowli komórkowych środkiem dezynfekującym i całkowicie rozmrozić roztwór pochodzący z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu na lodzie. Wyposaż pojedyncze sterylne strzykawki o pojemności jednego mililitra w igły o rozmiarze 26 i umieść igły na lodzie. Po rozmrożeniu roztworu przetrzyj górną część fiolki z roztworem pochodzącym z błony podstawnej wacikiem nasączonym alkoholem przed załadowaniem 500 mikrolitrów roztworu uzupełnionego lub bez atraktantu chemioterapii do każdej mililitrowej strzykawki.

Następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki zawierającej roztwór z membraną podstawną, aby zapewnić równomierne tworzenie się czopów. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, powoli wstrzyknij całą objętość roztworu pochodzącego z błony podstawnej bez dodawania MCP-1 w ilości około 100 mikrolitrów na sekundę podskórnie w prawą stronę znieczulonej myszy. I całe 500 mikrolitrów roztworu pochodzącego z błony podstawnej uzupełnionego MCP-1 do lewej flanki zwierzęcia.

Trzymać strzykawkę na miejscu przez 20 do 30 sekund po wstrzyknięciu, aby zapobiec wyciekaniu roztworu i umożliwić utworzenie się pojedynczej, gładkiej zatyczki żelowej przed umieszczeniem myszy na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Trzy dni po wstrzyknięciu należy usunąć włosy na grzbiecie zwierzęcia, któremu wstrzyknięto czop i za pomocą kleszczy chwycić skórę wokół dolnego kręgu piersiowego i górnego kręgu lędźwiowego. Wykonaj nacięcie w skórze o długości dwóch milimetrów i przetnij wzdłuż linii środkowej grzbietu myszy od kręgów szyjnych do jednego centymetra powyżej połączenia kręgowego rozpieszczonego.

Oddziel skórę od warstwy mięśniowej i przypnij skórę do platformy z pianki polistyrenowej. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, ostrożnie chwyć włóknistą kapsułkę, która zawiera korek żelowy pochodzący z błony podstawnej i użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć włóknistą kapsułkę. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wyczyścić wtyczkę.

Następnie przenieś oczyszczony korek żelowy pochodzący z błony podstawnej do odpowiednio oznakowanej i zważonej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Ponownie zważyć rurkę, aby obliczyć wagę korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej. Do trawienia czopa żelowego pochodzącego z błony podstawnej, użyj czystych, drobnych nożyczek, aby zmielić korek żelowy pochodzący z błony podstawnej w każdej probówce mikrowirówki i dodaj 800 mikrolitrów wyparcia do zatyczek.

Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby rozerwać korki i umieść probówki mikrowirówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny w termomikserze z prędkością 1400 obrotów na minutę, aby całkowicie rozpuścić korki żelowe pochodzące z błony podstawnej. Pod koniec inkubacji należy rozsiać fragmenty czopa przez dwukrotne odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach PBS. Przenieś 50 mikrolitrów każdej zawiesiny komórek do nowych mikroprobówek wirówkowych i oznacz komórki w nowych probówkach 0,5 mikrolitra kalcyny.

Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla policz liczbę żywych zielonych fluorescencyjnych dodatnich i martwych komórek niefluorescencyjnych na automatycznym liczniku komórek. W przypadku jednokomórkowej analizy Western blot dodaj jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny jednokomórkowej do uwodnionego jednokomórkowego chipa Western blot na dnie 10-centymetrowej szalki Petriego. Po pięciu do 15 minutach zbadaj chip pod mikroskopią w jasnym polu.

Około 15 do 20% mikrostudzienek powinno być zajętych przez pojedynczą komórkę, a mniej niż dwa procent studzienek powinno zawierać dwie lub więcej komórek. Jeśli chip został prawidłowo załadowany, przechyl naczynie o 45 stopni i umyj frytek trzykrotnie buforem zawieszenia, aby usunąć wszelkie nieprzechwycone komórki. Po ostatnim umyciu ostrożnie i załaduj chip do ogniwa elektroforetycznego jednokomórkowego zachodniego instrumentu, żelową stroną do góry i przykryj cały jednokomórkowy chip Western blot buforem do lizy.

Zainicjuj lizę komórek i uruchom instrument zgodnie z odpowiednimi parametrami eksperymentu. Pod koniec cyklu spłucz wióry dwoma 10-minutowymi myciami ze świeżym buforem do prania na pranie w temperaturze pokojowej. Po drugim przemyciu dodaj 80 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do komory sondowania przeciwciał i opuść chip żelową stroną do dołu, tak aby roztwór przeciwciała przesączył się przez chip.

Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej umyj frytki trzy razy w buforze myjącym i raz w wodzie na shakerze. Inkubować chip z odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj chip trzykrotnie buforem do przemywania i zakręć wiórem na szkiełku, aby usunąć pozostały bufor do mycia.

Aby usunąć jednokomórkowy chip Western blot, umieść 15-mililitrowy stojak na probówki w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza, tak aby woda znajdowała się zaledwie jeden centymetr nad stojakiem. W dygestorium dodaj 40 mililitrów buforu odpędowego i 320 mikrolitrów etanolu beta morcepta do kanistra. Umieść chip na 10-centymetrowej szalce Petriego wewnątrz kanistra i zamknij kanister Parafilmem.

Następnie umieść kanister w stojaku na rurki w łaźni wodnej. Po 90 minutach ostrożnie przenieś wiór na nową szalkę Petriego i krótko umyj wiór raz buforem do mycia, a następnie dodaj 15 mililitrów świeżego buforu myjącego do szalki Petriego na 15-minutowe mycie na shakerze. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki zrekrutowane do każdej czopki policzono po jednym, trzech i pięciu dniach po wstrzyknięciu.

Odejmując liczbę komórek w zatyczkach załadowanych nośnikiem od liczby komórek w zatyczkach załadowanych MCP-1, obliczono następnie liczbę komórek specjalnie zrekrutowanych w odpowiedzi na atraktant chemioterapii. W ciągu pięciu dni zaobserwowano przyspieszoną rekrutację i akumulację komórek specyficznych dla MCP-1, przy czym tempo wzrostu z 31 000 komórek dziennie po jednym dniu wstrzyknięcia do 136 000 komórek dziennie pięć dni po wstrzyknięciu. Następnie wykorzystano jednokomórkową analizę Western blot w celu zidentyfikowania różnych typów komórek rekrutowanych do czopów pochodzących z błony podstawnej, zgodnie z ich ekspresją specyficznych markerów komórek odpornościowych.

Na przykład odsetek monocytów w zatyczkach żelowych pochodzących z błony podstawnej obciążonych MCP-1 był niski w pierwszym dniu i osiągnął szczyt w trzecim dniu, po czym ponownie spadł w piątym dniu, podczas gdy liczba makrofagów stale rosła przez cały okres badania. W przypadku czopów załadowanych MCP-1 odsetek monocytów i makrofagów w izolowanej populacji komórek był najwyższy w trzecim dniu, co wskazuje, że po trzech dniach zdecydowana większość komórek rekrutowanych przez chemotaksję zależną od MCP-1 stanowiły monocyty i makrofagi. Mimo że całkowita liczba monocytów i makrofagów jest zwykle wyższa w piątym dniu w porównaniu z trzecim dniem, liczba komórek w trzecim dniu dokładniej odzwierciedla chemotaksję i rekrutację monocytów we krwi obwodowej, a zatem trzeci dzień jest zalecany do bezpośrednich analiz czopów błony podstawnej.

Pomyślne pozyskanie pojedynczych komórek do dalszej analizy zależy od dokładności wtrysku i całkowitego usunięcia zatyczek. Cytometria przepływowa, jednokomórkowy Western blot, sekwencjonowanie masowe lub jednokomórkowe RNA oraz inne procedury omiczne mogą być stosowane do oceny charakterystyki i fenotypów rekrutowanych monocytów i makrofagów pochodzących z monocytów.