Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów
25 lipca 2020
Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.
Opisany tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie algorytmu badania skuteczności leczenia z wykorzystaniem modeli nowotworów in vivo. Protokół składa się z połączenia kilku technik. Biosekwencjonowanie całego genomu próbek ludzkich guzów służy do identyfikacji zmian genomowych.
Obejmują one zarówno rearanżacje genów, jak i zmiany liczby kopii genów. Przeprowadza się więc analizę zidentyfikowanych zmian w celu wybrania zmian potencjalnie ulegających uleczeniu. Leki wybrane na podstawie analizy genomowej są następnie stosowane w leczeniu in vivo odpowiednich nowotworów wyhodowanych u myszy z obniżoną odpornością.
Opracowany algorytm stanowi obiecujące podejście wspomagające podejmowanie decyzji dotyczących leczenia pacjentów z nowotworami. Użyj narzędzia Panda lub analogicznego oprogramowania, aby zidentyfikować zmiany, które można ukierunkować. Możemy wymienić geny, które zostały zidentyfikowane za pomocą mikrosekwencjonowania, w postaci prostego pliku z zakładkami przy użyciu standardowych akceptowanych symboli genów.
Dodaj znak krzyżyka do wiersza nagłówka listy, aby upewnić się, że nagłówek tabeli zostanie przeniesiony na poziom ścieżki U oprogramowania. Prześlij plik, klikając odpowiednią zakładkę nawigacyjną. Przypisz pojedynczą ikonę reprezentującą dane bazowe, klikając wybraną ikonę, a następnie klikając kartę Finalizuj.
Po przesłaniu plików pacjenta wyświetl podgląd strony, aby zidentyfikować kolumnę, która wyświetla liczbę opisanych genów na ścieżkę. To jest ostatnia kolumna po prawej. Użyj filtru ścieżek w lewym górnym rogu okna głównego, aby ograniczyć liczbę wyświetlanych ścieżek do tych, które zawierają interesujące geny.
Aby zidentyfikować szlaki, które mają więcej genów z adnotacjami, niż można by się spodziewać przypadkowo, użyj funkcji znajdującej się pod zakładką wzbogacania. Następnie do głównej tabeli dodawana jest kolumna, która pokazuje odpowiednią wartość p z dokładnego testu Fishera. Wybierz bazę danych, aby wyświetlić potencjalne geny podatne na działanie narkotyków z predefiniowanej adnotacji, zaznaczając odpowiednią ikonę po lewej stronie okna głównego.
Aby wybrać ścieżkę do wizualizacji, kliknij na jej nazwę wyświetlaną na stronie przeglądarki ścieżek. Ikony reprezentujące każdy zestaw adnotacji są wyświetlane obok powiązanego genu. Kliknięcie dowolnego genu w ścieżce otworzy odpowiednią stronę z kartami genów.
Wybierz ścieżki, które wykazały adnotowane geny będące przedmiotem zainteresowania i trafienia dla potencjalnych leków do dalszej analizy. Wykonaj pracę tkankową w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Umieść tkankę nowotworową w naczyniu zawierającym zimny PBS lub pożywkę do hodowli tkankowych, taką jak RPMI, DMEM, zawierającą antybiotyki.
Zidentyfikuj i wyizoluj żywy materiał nowotworowy z sąsiedniej normalnej i martwiczej tkanki z pomocą patologa. Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć materiał martwiczy wskazany przez patologa. Aby wykonać wszczepienie podskórne, przeciąć tkankę nowotworową sterylnymi kleszczami, skalpelem lub nożyczkami chirurgicznymi na małe fragmenty o wymiarach około 2 x 2 x 2 milimetry.
Przenieś rozdrobnioną tkankę na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego na lodzie. Wpuścić zimny matrigel do naczynia z rozdrobnioną tkanką, około 200 mikrolitrów na 10 kawałków tkanki. Dobrze wymieszaj i pozwól fragmentom tkanek zanurzyć się w matriżelu przez 10 minut.
Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie skóry o długości 5-10 milimetrów na obu bokach myszy. Delikatnie włóż proste kleszcze w przestrzeń podskórną, aby stworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby fragment guza mógł zostać umieszczony pod poduszką tłuszczową. Za pomocą sterylnych prostych kleszczy wprowadź fragmenty guza do wcześniej przygotowanej kieszonki u każdej z pięciu myszy.
Zamknij nacięcie skóry za pomocą kleju tkankowego. Po implantacji, aby zahamować proliferację limfocytów, wstrzyknąć każdej myszy 100 mikrolitrów rytuksymabu. Przygotuj mysz do gajnika ustnego, ściskając skórę grzbietu i zginając ją do tyłu, tak aby głowa i usta myszy były unieruchomione.
Włóż sondę zgłębnika do tylnej części gardła myszy, aż sonda dotrze do przełyku. Upewnij się, że sonda nie jest włożona zbyt głęboko, ponieważ płuca myszy mogą ulec perforacji, powodując śmierć. Reprezentatywny obraz genomu ilustruje krajobraz zmian genomowych w jednym guzie.
Typowe dla nowotworów seropodtypu o wysokim stopniu złośliwości, zidentyfikowano wiele niebieskich linii zysków i strat czerwonych linii, co wskazuje na wysoki poziom niestabilności genomu. Główną zmianą trendu interwencji terapeutycznej w guzie OC101 była amplifikacja na chromosomie 17, obejmująca ERBB2, gen kodujący receptor HER2. Aby zweryfikować wyniki na poziomie DNA, zaprojektowano kilka zestawów specyficznych starterów dla krawędzi amplifikowanego regionu.
I przeprowadzono PCR. Żaden produkt amplifikacji nie został wchłonięty, gdy użyto kontrolnego ludzkiego DNA. Zidentyfikowano specyficzne prążki dla DNA guza OC101.
W innym wariancie nowotworu, T14, zaobserwowano liczne przyrosty DNA. Obejmowały one AKT2 w genach RICTOR. Walidacja przeprowadzona na poziomie białka przy użyciu immunoblottingu wykazała wysokie poziomy AKT w RICTOR.
Znaczne zmniejszenie masy guza zaobserwowano w grupie leczonej chemioterapią pod koniec szóstego tygodnia. Stwierdzono dodatkowe korzyści w porównaniu z samą chemioterapią w grupach, które otrzymywały leczenie skojarzone. Tkankę nowotworową pobrano do analizy molekularnej odpowiedzi na leczenie pod koniec badania klinicznego.
Całkowite i ufosforylowane poziomy S6, AKT i mTOR oznaczono za pomocą immunoblottingu. Porównanie poziomów tych białek u osób nieleczonych, leczonych chemioterapią i leczonych inhibitorem AKT lub mTOR wykazało wyraźny spadek w przypadku dwóch ostatnich. Przedstawione podejście jest bardzo przydatne do przeprowadzenia badania klinicznego w modelach PDX.
Wykorzystuje charakterystykę molekularną guza uzyskaną za pomocą profilowania genomowego w celu określenia najlepszego wyboru leków do testów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia algorytm badania skuteczności terapii celowanych w oparciu o skład genomiczny nowotworów. Obejmuje on identyfikację strukturalnych rearanżacji DNA oraz przeszczepianie guzów pacjentów do myszy w celu przetestowania odpowiedzi na leki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Genomika
- Farmakologia
Wstęp
- Terapie celowane są dobierane na podstawie zmian genomicznych.
- Zrozumienie reorganizacji DNA może pomóc w wyborze opcji leczenia.
- Modele in vivo są niezbędne do testowania skuteczności leków.
- Myszy z niedoborem odporności są wykorzystywane do przeszczepiania guzów.
Cel badania
- Aby zweryfikować skuteczność leków wybranych na podstawie analizy genomicznej.
- Aby opracować protokół testowania terapii celowanych in vivo.
- Aby pogłębić zrozumienie odpowiedzi nowotworu na konkretne metody leczenia.
Zastosowane metody
- Sekwencjonowanie całego genomu próbek guzów ludzkich.
- Identyfikacja zmian genomicznych, w tym rearanżacji genów.
- Wybór potencjalnie możliwych do leczenia zmian na podstawie analizy.
- Leczenie guzów in vivo u myszy z niedoborem odporności.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja strukturalnych reorganizacji DNA.
- Walidacja wybranych leków w modelach mysich.
- Wykazanie skuteczności leczenia na podstawie analizy genomowej.
- Wnioski dotyczące zachowania guza w odpowiedzi na terapie celowane.
Wnioski
- Protokół ten stanowi podstawę do testowania terapii celowanych.
- Analiza genomiczna jest kluczowa dla wyboru skutecznych metod leczenia.
- Modele in vivo są cenne dla zrozumienia odpowiedzi na leki.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w branży biofarmaceutycznej ocenę terapii celowanych z wykorzystaniem modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) w oparciu o profilowanie genomowe, co wspiera wybór leków oparty na hipotezach oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w rozwoju przedklinicznym. Poprzez powiązanie strukturalnych zmian w DNA z funkcjonalną odpowiedzią na lek, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) w przypadku terapii skojarzonych. Podejście to jest szczególnie istotne w przypadku guzów o wysokiej niestabilności genomowej, w których standardowe terapie zawodzą i rozważa się zastosowanie leków poza oficjalnymi wskazaniami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie strukturalnych zmian w DNA, takich jak amplifikacje i rearanżacje genów, z celami terapeutycznymi, takimi jak ERBB2/HER2 i AKT2.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu in vivo z wykorzystaniem modeli PDX, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną przed optymalizacją związku wiodącego.
- Wartość prognostyczna: Wykazuje korelację między przewidywaniami genomowymi a obserwowanymi odpowiedziami nowotworu, pomagając w selekcji projektów w portfolio na podstawie pewności co do celu terapeutycznego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie walidowanych systemów biologicznych (modele PDX) o scharakteryzowanych profilach genomowych w celu wiarygodnej oceny związków w dalszych badaniach przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja protokołów wszczepiania guzów i leczenia, co zwiększa powtarzalność badań i umożliwia skalowalne testy przedkliniczne.
- Gotowość do analizy: Generowanie ilościowych wyników molekularnych (np. ufosforylowane S6, AKT, mTOR) za pomocą immunoblottingu w celu oceny inhibicji szlaków sygnałowych i odpowiedzi na leczenie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystuje guzy pochodzące od pacjentów w celu zachowania istotności choroby, łącząc odkrycia genomiczne z próbek ludzkich z modelami in vivo.
- Walidacja przedkliniczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, wykazując redukcję masy guza oraz specyficzne dla danej ścieżki efekty leków in vivo.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia, czy obserwowana skuteczność wynika z monoterapii czy z leczenia skojarzonego, co pozwala na optymalizację projektu badań klinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje analizę genomiczną z badaniem skuteczności in vivo, sytuując ją pomiędzy identyfikacją celu a optymalizacją wiodących związków w procesie odkrywania leków, co umożliwia progresję do rozwoju przedklinicznego w oparciu o dane.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez walidację, czy geny poddane modyfikacjom strukturalnym są funkcjonalnie podatne na działanie leków in vivo.
- Przesiewanie: Umożliwia tworzenie gotowych do analizy modeli PDX o znanych sterownikach genomicznych, co pozwala na wiarygodne przesiewanie związków i ocenę terapii skojarzonych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (obciążenie nowotworowe, fosforylacja białek), które pozwalają zespołom porównywać efekty działania leków i oceniać stopień zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od guza pacjenta do modelu przedklinicznego, wspierając dopasowanie biomarkerów i modelowanie predykcyjne odpowiedzi klinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat pracy do testowania terapii celowanych w różnych typach nowotworów, redukując redundancję w opracowywaniu modeli.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez potwierdzenie, że zmiany na poziomie DNA przekładają się na funkcjonalną wrażliwość na lek in vivo.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom przetwarzania tkanek, przeszczepiania oraz podawania leków.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez priorytetyzację celów o wykazanej skuteczności in vivo, co redukuje ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zgodność między prognozą genomiczną a odpowiedzią w modelach PDX.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie genomiki nowotworów, patologii i modelowania in vivo w celu dokładnej izolacji żywej tkanki nowotworowej oraz interpretacji zmian genomicznych.
- Zależność od infrastruktury sekwencjonowania nowej generacji oraz narzędzi bioinformatycznych (np. narzędzia Panda) do analizy zmian strukturalnych i wzbogacania szlaków.
- Konieczność stosowania ustandaryzowanych procedur sterylnej fragmentacji guza, mieszania z Matrigel oraz przeszczepiania podskórnego w celu zapewnienia sukcesu engraftmentu.
- Wymagana możliwość przeprowadzania analizy immunoblotting w celu oceny modulacji szlaków sygnałowych (np. AKT/mTOR/S6) jako odczytów farmakodynamicznych.
- Ograniczenie ze względu na czasochłonność i zasobożerność generowania modeli PDX, co może ograniczać przepustowość w przypadku kampanii przesiewowych na dużą skalę.
