Name: Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Odkryj algorytm testowania terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) dr Lin Yangowi i Faye R. Harris, MS, za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów. Praca ta została wsparta przez Prezent Pana i Pani Neil E. Eckles dla Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

Świeże tkanki od pacjentek z rakiem jajnika, które wyraziły na to zgodę, zostały pobrane podczas operacji zmniejszenia masy ciała zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Wszystkie procedury i zabiegi na zwierzętach stosowane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Sekwencjonowanie i analiza par wiązań
UWAGA: Do sekwencjonowania par mate (MPseq) musi być używana zarówno świeża, jak i błyskawicznie zamrożona tkanka. Materiał zatopiony w parafinie nie jest odpowiedni, ponieważ zawiera fragmentaryczne DNA.
<ol>
	<li>Wyizoluj DNA z zamrożonej tkanki nowotworowej. Użyj oryginalnej próbki ludzkiej uzyskanej z materiału chirurgicznego lub biopsji36.</li>
	<li>Użyj 1000 ng DNA do stworzenia bibliotek MPseq i sekwencjonuj jako 2 próbki na linię na sekwencerze następnej generacji (patrz Tabela materiałów)36.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą zestawu algorytmów do wykrywania dużych aberracji chromosomowych (delecje, insercje, amplifikacje, inwersje i translokacje), jak opisano wcześniej36,37.</li>
</ol>
2. Wybór celów terapeutycznych
<ol>
	<li>Użyj ogólnodostępnego narzędzia Panda (Pathway and Annotation) lub analogicznego narzędzia, aby zidentyfikować możliwe do ukierunkowania zmiany (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
	<ol>
		<li>Sporządź listę genów, które są identyfikowane przez MSeq jako zmienione, w postaci prostego pliku rozdzielanego tabulatorami, używając standardowych akceptowanych symboli genów. 
		UWAGA: Załączony przykład zawiera analizę wzmocnień i wzmocnień.</li>
		<li>Dodaj znak "#" do wiersza nagłówka listy, aby upewnić się, że nagłówek tabeli zostanie przeniesiony do widoku na poziomie ścieżki oprogramowania.</li>
		<li>Prześlij plik, klikając kartę nawigacyjną Prześlij zestaw adnotacji.</li>
		<li>Przypisz pojedynczą ikonę z menu, aby reprezentować dane bazowe, klikając wybraną ikonę, a następnie klikając kartę Finalizuj.</li>
		<li>Po przekazaniu plików adnotacji zidentyfikuj kolumnę, w której wyświetlana jest liczba genów z adnotacjami na ścieżkę. To jest ostatnia kolumna po prawej.</li>
		<li>Użyj filtru ścieżek w lewym górnym rogu okna głównego, aby wyświetlić ścieżki zawierające interesujące geny.</li>
		<li>Zidentyfikuj szlaki, które mają więcej opisanych genów, niż można by się spodziewać przypadkowo. Użyj funkcji znajdującej się na karcie Wzbogacanie.</li>
		<li>Wybierz bazę danych, aby wyświetlić potencjalnie uboczne geny z adnotacji ustawień wstępnych, zaznaczając odpowiednią ikonę po lewej stronie okna głównego (np. DGIdb, PharmGKB).</li>
		<li>Wybierz ścieżkę do wizualizacji, klikając jej nazwę wyświetlaną na stronie Pathway Viewer. 
		UWAGA: Ikony reprezentujące każdy zestaw adnotacji są wyświetlane obok powiązanego genu. Kliknij na interesujący Cię gen, aby otworzyć odpowiednią stronę internetową GeneCards.</li>
		<li>Wybierz szlaki, które wykazały oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania (tj. zmienione w danym guzie) i "trafienia" dla potencjalnych leków do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorzystaj z bazy danych zawierającej leki zatwierdzone do stosowania klinicznego (https://clinicaltrials.gov/), aby porównać zidentyfikowane cele.</li>
	<li>Nadaj priorytet docelowym zmianom do dalszych testów w modelach PDX, przeprowadzając przegląd literatury (np. PubMed) w celu potwierdzenia znaczenia dla biologii określonego typu nowotworu.</li>
</ol>
3. Walidacja rearanżacji genomu za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera
<ol>
	<li>Projektuj startery przy użyciu odczytów sekwencjonowania uzyskanych z danych MPseq.
	<ol>
		<li>Wybierz łącznik zainteresowania do walidacji (tj. potencjalny cel terapeutyczny) na podstawie analiz MPseq.</li>
		<li>Zaprojektuj podkłady kierunkowo tak, aby amplikon zawierał złącze. Zaprojektuj 2 startery po każdej stronie skrzyżowania, w sumie 4, aby zwiększyć szanse na wzmocnienie skrzyżowania. 
		UWAGA: Nazwij startery zgodnie z przypadkiem i lokalizacją chromosomu.</li>
		<li>Użyj standardowych parametrów PCR do projektu startera i wybranego oprogramowania. Wybierz temperaturę topnienia (60-62 °C) i zawartość GC (40-60%). Upewnij się, że sekwencja startera nie tworzy dimerów startera, palindromów ani pętli spinek do włosów.</li>
		<li>Potwierdź, że sekwencja startera nie jest homologiczna z innymi obszarami ludzkiego genomu, sprawdzając ją za pomocą BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom PCR, aby wzmocnić interesujące połączenie.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć podkłady wodą do 10 mM i połączyć 10 ml każdego startera tak, aby każdy starter do przodu był sparowany z każdym starterem odwrotnym w mieszankę starterów. 
		UWAGA: Sekwencje starterów dla wybranego przykładu przedstawiono w Tabeli 1.</li>
		<li>Oznacz probówki paskowe o pojemności 0,2 ml jako: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 i T4, gdzie C = kontroluj ludzkie genomowe DNA (komercyjne), T = DNA nowotworu, wyizolowane z guza pacjenta lub PDX, a liczba wskazuje mieszankę starterów.</li>
		<li>Dodaj 1 ml każdej mieszanki starterów do oznaczonych tubek.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę główną Taq, łącząc odczynniki wymienione w tabeli 2, pozostawiając enzym w zamrażarce do czasu, aż będzie potrzebny, dodając go do mieszanki na samym końcu.</li>
		<li>Wykonaj 2 mieszanki główne, po jednej dla każdego matrycowego DNA, kontroluj ludzkie DNA i DNA guza. Dodaj 24 ml każdej głównej mieszanki Taq do odpowiedniej probówki paskowej. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 ml. Wiruj bardzo krótko, a następnie odkręć rurkę paskową w dół.</li>
		<li>Uruchom PCR w termocyklerze. Należy użyć parametrów przedstawionych w tabeli 3. Dostosować temperaturę wyżarzania tak, aby była o co najmniej 1 °C niższa niż temperatura topnienia podkładów.</li>
		<li>Gotowy produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C (długotrwale) lub w lodówce w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
		<li>Wykonaj elektroforezę przy 1-5 V/cm, aby uwidocznić produkt PCR przy użyciu 1,5% żelu agarozowego. Pozostawić 2 ml porcji produktu do użycia do sekwencjonowania Sangera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby potwierdzić skrzyżowanie i zidentyfikować dokładny punkt przerwania38.
	<ol>
		<li>Należy użyć produktu PCR, jeśli PCR wygenerował pojedynczy produkt (prążek). Alternatywnie, wytnij opaskę z żelu, oczyść i prześlij do sekwencjonowania Sangera wraz ze starterem używanym do amplifikacji. 
		UWAGA: Nowotwory, dla których przeprowadzono analizy genomowe, są wykorzystywane do implantacji u myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeszczepienie i utrzymanie guza
<ol>
	<li>Przygotuj preparaty do wszczepienia guzów do mysich modeli PDX. Wybrać do wszczepienia guzy, dla których zostaną lub zostały przeprowadzone analizy genomowe.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że w momencie rozpoczęcia opracowywania dowolnych modeli PDX istnieje infrastruktura pomocnicza, w tym dedykowane laboratoria i pomieszczenia dla zwierząt, wykwalifikowany personel techniczny i szczegółowe standardowe procedury operacyjne.</li>
		<li>Zapewnij szybki transport i przetwarzanie próbek, ponieważ szybkość ma kluczowe znaczenie dla żywotności komórek i pomyślnego wszczepienia.</li>
		<li>Używaj sterylnego środowiska, aby zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne i grzybicze podczas przetwarzania i wszczepiania próbek.</li>
		<li>Z próbkami ludzkimi należy obchodzić się ostrożnie, zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą materiałów potencjalnie niebezpiecznych biologicznie, ponieważ mogą one zawierać patogeny przenoszone przez krew.</li>
		<li>Przygotuj tkankę (o wielkości 0,5-0,7cm3) do wszczepienia, umieszczając próbkę chirurgiczną w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki do hodowli tkankowych. 
		UWAGA: Tkanka nowotworowa może być świeża lub odzyskana z wcześniej kriokonserwowanego materiału5.</li>
		<li>Potwierdź zawartość guza w próbce, konsultując się z patologiem.</li>
		<li>Umieść tkankę nowotworową w naczyniu zawierającym 10-15 ml zimnego PBS lub pożywki do hodowli tkankowej, takiej jak RPMI 1640 lub DMEM zawierające antybiotyki (1% penicyliny i streptomycyny).</li>
		<li>Zidentyfikuj i wyizoluj żywy materiał nowotworowy z sąsiedniej normalnej i martwiczej tkanki z pomocą patologa. Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć materiał martwiczy wskazany przez patologa. 
		UWAGA: Guz może być wszczepiony dootrzewnowo lub podskórnie myszom. Wykonaj krok 4.2, aby wykonać implantację dootrzewnową lub przejdź do kroku 4.3, aby wykonać przeszczep podskórny. W tym badaniu terapie celowane wybrane na podstawie analiz genomowych przetestowano w serii modeli PDX dla surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości z implantacją dootrzewnową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj tkankę do implantacji dootrzewnowej (IP), mieląc tkankę sterylnymi kleszczami i skalpelem na lodzie, aby uzyskać kawałki o wielkości około 1-1,5mm3 i mieszając z zimną pożywką hodowlaną. Wstrzyknąć 0,3–0,5 ml zawiesiny nowotworowej za pomocą igły o rozmiarze 16-17. 
	UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonywane są przy użyciu technik aseptycznych. Sterylne rękawiczki, sterylne narzędzia, materiały eksploatacyjne i wszczepione materiały zostały użyte w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa infekcji.
	<ol>
		<li>Wymieszaj kawałki 1:1 z lodowatą pożywką hodowlaną i wstrzyknij 100 ml dootrzewnowo co najmniej trzem samicom myszy SCID.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciąć tkankę nowotworową do podskórnego wszczepienia za pomocą sterylnych kleszczy, skalpela lub nożyczek chirurgicznych na małe fragmenty o wymiarach około 2 x 2 x 2 mm i przenieść rozdrobnione tkanki na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego na lodzie.
	<ol>
		<li>Dodaj zimną matrycę błony podstawnej do naczynia z rozdrobnioną tkanką (około 200 ml na 10 kawałków tkanki), dobrze wymieszaj i pozwól fragmentom tkanki zanurzyć się w zimnej matrycy błony podstawnej przez 10 minut.</li>
		<li>Znieczulij 5 samic myszy NOD/SCID, aby przygotować je do wszczepienia.</li>
		<li>Każdej myszy wstrzyknąć dootrzewnowo kombinację ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).</li>
		<li>Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając końcówkę ogona atraumatycznymi kleszczami.</li>
		<li>Wyjmij delikatną, w pełni znieczuloną mysz z komory i umieść na myszy stożek nosowy, który ma wejście z waporyzatora i wyjście z systemu oczyszczania gazów odlotowych.</li>
		<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przygotuj obszar, w którym zostanie wykonany zabieg. Do wykonania zabiegu należy zastosować technikę aseptyczną.</li>
		<li>Upewnij się, że powierzchnia, na której ma się odbyć operacja, jest nieporowata, uszczelniona i zdezynfekowana przed zabiegiem.</li>
		<li>Rozpocznij operację od sterylnych (sterylizacją w autoklawie, gazie lub chemii) narzędzi.</li>
		<li>Używaj rękawiczek do obsługi narzędzi i utrzymuj sterylność końcówek narzędzi przez cały czas trwania zabiegu, zanurzając je w etanolu między etapami operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizuj miejsce operowane, stosując 3 naprzemienne peelingi z jodu i alkoholu. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie skóry o średnicy 5-10 mm na obu bokach myszy.
	<ol>
		<li>Delikatnie włóż proste kleszcze w przestrzeń podskórną, aby stworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby fragment guza mógł zostać umieszczony pod poduszką tłuszczową.</li>
		<li>Użyj sterylnych prostych kleszczy, aby wprowadzić fragmenty guza do wcześniej przygotowanej kieszonki u każdej z 5 myszy. 
		UWAGA: Umieść 3-4 kawałki tkanki nowotworowej w jednej kieszeni</li>.
		<li>Zamknij nacięcia skóry za pomocą kleju tkankowego.</li>
		<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 100 ml rytuksymabu po implantacji w celu zahamowania proliferacji limfocytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz w klatce pod lampą grzewczą na około 20 minut, aż do znieczulenia. Monitoruj parametry życiowe myszy i zapewnij jej wystarczające nawodnienie.</li>
	<li>Przywróć mysz do towarzystwa innych myszy po tym, jak wyzdrowiała ze znieczulenia i zaczęła jeść i pić. Zapewnienie opieki pooperacyjnej i monitorowania zgodnie z wytycznymi instytucji. Sprawdzaj, czy nie ma oznak bólu i niepokoju codziennie przez 3 kolejne dni po zabiegu. 
	UWAGA: Kryteria bólu lub niepokoju obejmują martwicę lub owrzodzenie, utratę wagi/ocenę kondycji ciała, objawy behawioralne, takie jak poziom aktywności, funkcje motoryczne i postawa.</li>
	<li>Rutynowo sprawdzaj myszy pod kątem powstawania guza co dwa tygodnie, aż guzy osiągną rozmiar 0,5 cm średnicy, mierzony suwmiarką.</li>
	<li>Oceń wynik zdrowia każdej myszy na podstawie wyglądu, zachowania i kondycji ciała39. Użyj wyników ≤6 jako kryteriów dla konających myszy, które mają zostać uśmiercone przez wdychanie dwutlenku węgla.</li>
</ol>
5. Testowanie odpowiedzi na genomicznie zidentyfikowane cele w modelach PDX
<ol>
	<li>Rozpocznij wybrane leczenie celowane, gdy guzy są wyczuwalne palpacyjnie i osiągną 0,5cm3, mierzone za pomocą badania ultrasonograficznego.
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem badania ultrasonograficznego jamy brzusznej należy usunąć sierść z brzucha myszy i nałożyć sterylny smar w postaci galaretki.</li>
		<li>Użyj aparatu ultrasonograficznego z głowicą, aby uzyskać obrazy z guzem umieszczonym w przekroju poprzecznym. Wykonaj 3 pomiary na sesję dla każdego zwierzęcia i uśrednij wartość, aby uzyskać dokładniejszą ocenę wielkości guza.</li>
		<li>Przeanalizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania40.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemioterapię składającą się z mieszaniny karboplatyny w dawce 51 mg/kg mc. i paklitakselu w dawce 15 mg/kg mc. podawanie dootrzewnowe (IP) raz w tygodniu przez łączny czas leczenia wynoszący 4-6 tygodni. Upewnij się, że całkowita objętość do wstrzyknięcia nie przekracza 0,2 ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór podstawowy MK-220641 w 30% cyklodekstrynie (np. Captisol) i dostarczaj przez zgłębnik doustny w dawce 120 mg/kg dziennie przez 4 kolejne tygodnie.</li>
	<li>Przygotuj mysz do gajnika ustnego, przytrzymując ją, ściskając skórę grzbietu i przypinając ją z powrotem, tak aby głowa i kończyny myszy były unieruchomione.
	<ol>
		<li>Włóż sondę zgłębnika do tylnej części gardła myszy, aż sonda dotrze do przełyku. Upewnij się, że sonda nie jest włożona zbyt głęboko, ponieważ płuca myszy mogą się przebić, powodując śmierć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór podstawowy MK-866942 w etanolu w dawce 25 mg/ml. Rozcieńczyć go w podłożu zawierającym 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 w sterylnej wodzie do wstrzykiwań IP w dawce 10 mg/kg mc. przez 5 dni co drugi tydzień, przy łącznym czasie trwania leczenia wynoszącym 4 tygodnie. 
	UWAGA: Objętość wstrzyknięta myszom powinna wynosić 50-120 ml, w zależności od masy ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Użyj 7-8 myszy na grupę badaną, aby mieć wystarczającą moc statystyczną do wykrycia różnic43,44.</li>
	<li>Codziennie oceniaj masę ciała i ogólny stan myszy w terapii. Wstrzymaj się z przyjmowaniem leków, jeśli waga zwierzęcia spadnie o 20% lub więcej w stosunku do jego początkowej wagi.</li>
	<li>Oceniaj wielkość guza co tydzień za pomocą skanowania ultrasonograficznego. Upewnij się, że osoba monitorująca wzrost guza jest ślepa na leczenie, aby zapewnić bezstronną ocenę odpowiedzi. 
	UWAGA: Mniejsze laboratoria mogą zatrudniać 2 różne osoby do prowadzenia leczenia i monitorowania ultrasonograficznego.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Opisujemy podejście i protokoły, które zastosowaliśmy do przeprowadzenia "badania klinicznego" w modelach PDX, które wykorzystuje charakterystykę molekularną guza uzyskaną przez profilowanie genomowe w celu określenia najlepszego wyboru leków do testów. Wiele platform sekwencjonowania jest obecnie wykorzystywanych do charakterystyki genomowej nowotworów pierwotnych, w tym sekwencjonowania całego genomu, RNAseq i niestandardowych paneli genowych. W przypadku surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości, MPseq do...

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), które są generowane z implantacji fragmentów guza pacjenta myszom z niedoborem odporności, stały się potężnym modelem przedklinicznym, który pomaga w spersonalizowanej opiece przeciwnowotworowej. Modele PDX zostały z powodzeniem opracowane dla różnych nowotworów złośliwych u ludzi. Należą do nich rak piersi i jajnika, czerniak złośliwy, rak jelita grubego, gruczolakorak trzustki i niedrobnokomórkowy rak płuc1,2,3,4,5. Tkanka nowotworowa może być wszczepiana ortotopowo lub heterotopowo. Pierwsza, uważana za dokładniejszą, ale trudną technicznie, polega na przeszczepieniu bezpośrednio do narządu pochodzenia nowotworowego. Uważa się, że tego typu modele dokładnie naśladują histologię pierwotnego guza ze względu na "naturalne" mikrośrodowisko dla guza6,7. Na przykład przeszczep ortotopowy do kaletki jajnika myszy spowodował rozsiew guza do jamy otrzewnej i wytworzenie wodobrzusza, typowe dla raka jajnika8. Podobnie, wstrzyknięcie guzów piersi do klatki piersiowej zamiast do gruczołu sutkowego w jamie brzusznej wpłynęło na wskaźnik sukcesu PDX i zachowanie9. Jednak modele ortotopowe wymagają zaawansowanych systemów obrazowania do monitorowania wzrostu guza. Heterotopowa implantacja guza litego jest zazwyczaj wykonywana poprzez wszczepienie tkanki do podskórnego boku myszy, co pozwala na łatwiejsze monitorowanie wzrostu guza i jest tańsze i mniej czasochłonne7. Jednak guzy rozrosłe podskórnie rzadko dają przerzuty, w przeciwieństwie do obserwowanych w przypadku implantacji ortotopowej10.
Wykazano, że wskaźnik powodzenia przeszczepu jest różny i w dużym stopniu zależy od typu nowotworu. Stwierdzono, że bardziej agresywne nowotwory i próbki tkanek zawierające większy procent komórek nowotworowych mają lepsze wskaźniki sukcesu12,13. W związku z tym wykazano, że guzy pochodzące z miejsc przerzutów wszczepiają się z częstotliwością 50-80%, podczas gdy te z miejsc pierwotnych wszczepiają się z częstotliwością tak niską jak 14%12. W przeciwieństwie do tego, tkanka zawierająca komórki martwicze i mniej żywotnych komórek nowotworowych słabo się wszczepia. Wzrost guza może być również wspomagany przez dodanie białek macierzy błony podstawnej do mieszanki tkankowej w momencie wstrzyknięcia myszom14 bez uszczerbku dla właściwości oryginalnego guza. Stwierdzono również, że wielkość i liczba fragmentów tkanki przeznaczonych do implantacji wpływają na wskaźnik powodzenia wszczepienia. Odnotowano większe wskaźniki wchłaniania guza w przypadku implantacji w torebce podnerkowej w porównaniu z implantacją podskórną ze względu na zdolność torebki podnerkowej do utrzymania pierwotnego zrębu guza i dostarczania komórek zrębu gospodarza15.
Większość badań wykorzystuje myszy z niedoborem odporności NOD/SCID, które nie mają komórek NK"16 i wykazano, że zwiększają one wszczepienie, wzrost i przerzuty guza w porównaniu z innymi szczepami14. Wymagane jest jednak dodatkowe monitorowanie, ponieważ chłoniaki grasicy mogą rozwinąć się już w wieku 3-4 miesięcy13. W przeszczepach guzów jajników hodowanych u myszy SCID, wzrost komórek B został skutecznie zahamowany przez rytuksymab, zapobiegając rozwojowi chłoniaków, ale bez wpływu na wszczepienie guzów jajnika17.
Ostatnio myszy NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), posiadające mutację zerową w genie kodującym łańcuch gamma receptora interleukiny 218, stały się często używanym szczepem do generowania modeli PDX. Stwierdzono, że nowotwory z uznanych modeli PDX pasażowanych do przyszłych pokoleń myszy zachowują właściwości histologiczne i molekularne przez 3 do 6 pokoleń19,20. Liczne badania wykazały, że wyniki leczenia w modelach PDX naśladują wyniki leczenia odpowiadających im pacjentów2,3,4,21,22,23. Wskaźnik odpowiedzi na chemioterapię w modelach PDX dla raka płuca i raka jelita grubego był podobny do tego w badaniach klinicznych dla tych samych leków24,25. Badania przeprowadzone na modelach PDX, opracowanych dla pacjentów włączonych do badań klinicznych, wykazały reakcje na testowane leki podobne do tych obserwowanych klinicznie u odpowiednich pacjentów2,3,4.
Wysokoprzepustowe analizy genomiczne guza pacjenta w połączeniu z modelami PDX dostarczają potężnego narzędzia do badania korelacji między specyficznymi zmianami genomowymi a odpowiedzią terapeutyczną. Zostały one opisane w kilku publikacjach26,27. Na przykład, odpowiedzi terapeutyczne na inhibitor EGFR cetuksymab w zestawie modeli PDX jelita grubego z amplifikacją EGFR były równoległe z odpowiedziami klinicznymi na cetuksymab u pacjentów28.
Istnieje kilka wyzwań związanych z rozwojem i zastosowaniem modeli PDX. Wśród nich jest heterogeniczność guza29,30, co może zagrozić dokładności interpretacji odpowiedzi na leczenie, ponieważ klon pojedynczej komórki o wyższej zdolności proliferacyjnej w PDX może wyrosnąć z innych31, co skutkuje utratą heterogeniczności. Dodatkowo, gdy do rozwoju PDX stosuje się biopsje pojedynczego guza, niektóre populacje komórek mogą zostać pominięte i nie będą reprezentowane w końcowym przeszczepie. Do implantacji zaleca się wielokrotne pobieranie próbek z tego samego guza, aby rozwiązać ten problem. Chociaż nowotwory PDX mają tendencję do zawierania wszystkich typów komórek pierwotnego guza dawcy, komórki te są stopniowo zastępowane przez komórki pochodzenia mysiego3. Wzajemne oddziaływanie między mysim zrębem a ludzkimi komórkami nowotworowymi w modelach PDX nie jest dobrze poznane. Niemniej jednak wykazano, że komórki zrębu rekapitulują mikrośrodowisko guza33.
Pomimo tych ograniczeń, modele PDX pozostają jednymi z najcenniejszych narzędzi do badań translacyjnych, jak również medycyny spersonalizowanej do wyboru terapii dla pacjentów. Główne zastosowania PDX obejmują odkrywanie biomarkerów i testowanie leków. Modele PDX są również z powodzeniem wykorzystywane do badania mechanizmów oporności na leki i identyfikowania strategii przezwyciężania oporności na leki34,35. Podejście opisane w niniejszym manuskrypcie pozwala badaczowi zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne w ludzkich nowotworach i ocenić skuteczność odpowiednich leków in vivo, u myszy z wszczepionymi guzami, które początkowo zostały scharakteryzowane genomicznie. Protokół wykorzystuje guzy jajnika wszczepiane dootrzewnowo, ale ma zastosowanie do każdego rodzaju nowotworu wystarczająco agresywnego, aby rosnąć u myszy2,3,12.

<table><tbody><tr><td>3M Vetbond</td><td>3M, Spółka</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-AKT</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH (G-9)</td> <td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td> <td>przeciwciała anty-MAPK</td>, Inc.<td>9926</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-AKT</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mTOR</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-mTOR</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Phospho-S6</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rictor</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-S6</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>Captisol</td><td>ChemScene, Inc.</td><td>cs-0731</td><td></td></tr><tr><td>Karboplatyna</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Enzym klonujący Hi-Fi PCR</td><td>Agilent, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>Smar</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>McCoy's media</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>ApexBio, Inc.</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>ARIAD Pharmaceuticals, Inc.</td><td></td><td></td>AP23573</tr><tr><td>Nair Kościół Skóry Wrażliwej</td><td>& Dwight Co.</td><td>Nair Depilator Shower Power Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>myszy NOD / SCID</td><td>Charles River, Inc.</td><td>skinienie. CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Perjeta</td><td>Genetech, Co.</td><td>Pertuzumab</td><td></td></tr><tr><td>Rituximab</td><td>Genetech, Co.</td><td>Rituxan</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Myszy SCID</td><td>Harlan Laboratories, Inc.</td><td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik liniowy SLAx 13-6MHz</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>SonoSite Ultrasonograf serii S</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>SonoSite SII</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>Zobacz materiał P4780-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych dna i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Prezentujemy tutaj zintegrowane podejście do testowania skuteczności terapii celowanych, które łączy technologie sekwencjonowania nowej generacji, analizy celów terapeutycznych i monitorowanie odpowiedzi na leki za pomocą ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Strategia ta została zweryfikowana na przykładzie guzów jajnika. Protokół sekwencjonowania nowej generacji (MPseq) wykorzystano do identyfikacji zmian strukturalnych, a następnie przeprowadzono analizę potencjalnie możliwych do ukierunkowania zmian. Ludzkie nowotwory wyhodowane u myszy z obniżoną odpornością leczono lekami dobranymi na podstawie analiz genomicznych. Wyniki wykazały dobrą korelację między przewidywanymi i obserwowanymi odpowiedziami w modelu PDX. Przedstawione podejście może być wykorzystane do przetestowania skuteczności leczenia skojarzonego i wspomóc spersonalizowane leczenie pacjentów z nawrotami raka, szczególnie w przypadkach, gdy standardowa terapia zawodzi i istnieje potrzeba stosowania leków poza wskazaniami rejestracyjnymi.

Tkanki z wyciętych guzów jajnika pobrano podczas operacji redukcyjnych zgodnie z wytycznymi IRB i wykorzystano do 1) charakterystyki genomicznej oraz 2) przeszczepienia myszom z niedoborem odporności (Rysunek 1). Protokół sekwencjonowania mate-pair36,37 został zastosowany w celu zidentyfikowania zmian strukturalnych w DNA, w tym utrat, przyrostów i amplifikacji. Reprezentatywny wykres genomu ilustrujący krajobraz zmian genomicznych w...

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Opisany tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie algorytmu badania skuteczności leczenia z wykorzystaniem modeli nowotworów in vivo. Protokół składa się z połączenia kilku technik. Biosekwencjonowanie całego genomu próbek ludzkich guzów służy do identyfikacji zmian genomowych.Obejmują one zarówno rearanżacje genów, jak i zmiany liczby kopii genów. Przeprowadza się więc analizę zidentyfikowanych zmian w celu wybrania zmian potencjalnie ulegających uleczeniu. Leki wybrane na podstawie analizy genomowej są następnie stosowane w leczeniu in vivo odpowiednich nowotworów wyhodowanych u myszy z obniżoną odpornością.Opracowany algorytm stanowi obiecujące podejście wspomagające podejmowanie decyzji dotyczących leczenia pacjentów z nowotworami. Użyj narzędzia Panda lub analogicznego oprogramowania, aby zidentyfikować zmiany, które można ukierunkować. Możemy wymienić geny, które zostały zidentyfikowane za pomocą mikrosekwencjonowania, w postaci prostego pliku z zakładkami przy użyciu standardowych akceptowanych symboli genów.Dodaj znak krzyżyka do wiersza nagłówka listy, aby upewnić się, że nagłówek tabeli zostanie przeniesiony na poziom ścieżki U oprogramowania. Prześlij plik, klikając odpowiednią zakładkę nawigacyjną. Przypisz pojedynczą ikonę reprezentującą dane bazowe, klikając wybraną ikonę, a następnie klikając kartę Finalizuj.Po przesłaniu plików pacjenta wyświetl podgląd strony, aby zidentyfikować kolumnę, która wyświetla liczbę opisanych genów na ścieżkę. To jest ostatnia kolumna po prawej. Użyj filtru ścieżek w lewym górnym rogu okna głównego, aby ograniczyć liczbę wyświetlanych ścieżek do tych, które zawierają interesujące geny.Aby zidentyfikować szlaki, które mają więcej genów z adnotacjami, niż można by się spodziewać przypadkowo, użyj funkcji znajdującej się pod zakładką wzbogacania. Następnie do głównej tabeli dodawana jest kolumna, która pokazuje odpowiednią wartość p z dokładnego testu Fishera. Wybierz bazę danych, aby wyświetlić potencjalne geny podatne na działanie narkotyków z predefiniowanej adnotacji, zaznaczając odpowiednią ikonę po lewej stronie okna głównego.Aby wybrać ścieżkę do wizualizacji, kliknij na jej nazwę wyświetlaną na stronie przeglądarki ścieżek. Ikony reprezentujące każdy zestaw adnotacji są wyświetlane obok powiązanego genu. Kliknięcie dowolnego genu w ścieżce otworzy odpowiednią stronę z kartami genów.Wybierz ścieżki, które wykazały adnotowane geny będące przedmiotem zainteresowania i trafienia dla potencjalnych leków do dalszej analizy. Wykonaj pracę tkankową w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Umieść tkankę nowotworową w naczyniu zawierającym zimny PBS lub pożywkę do hodowli tkankowych, taką jak RPMI, DMEM, zawierającą antybiotyki.Zidentyfikuj i wyizoluj żywy materiał nowotworowy z sąsiedniej normalnej i martwiczej tkanki z pomocą patologa. Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć materiał martwiczy wskazany przez patologa. Aby wykonać wszczepienie podskórne, przeciąć tkankę nowotworową sterylnymi kleszczami, skalpelem lub nożyczkami chirurgicznymi na małe fragmenty o wymiarach około 2 x 2 x 2 milimetry.Przenieś rozdrobnioną tkankę na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego na lodzie. Wpuścić zimny matrigel do naczynia z rozdrobnioną tkanką, około 200 mikrolitrów na 10 kawałków tkanki. Dobrze wymieszaj i pozwól fragmentom tkanek zanurzyć się w matriżelu przez 10 minut.Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie skóry o długości 5-10 milimetrów na obu bokach myszy. Delikatnie włóż proste kleszcze w przestrzeń podskórną, aby stworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby fragment guza mógł zostać umieszczony pod poduszką tłuszczową. Za pomocą sterylnych prostych kleszczy wprowadź fragmenty guza do wcześniej przygotowanej kieszonki u każdej z pięciu myszy.Zamknij nacięcie skóry za pomocą kleju tkankowego. Po implantacji, aby zahamować proliferację limfocytów, wstrzyknąć każdej myszy 100 mikrolitrów rytuksymabu. Przygotuj mysz do gajnika ustnego, ściskając skórę grzbietu i zginając ją do tyłu, tak aby głowa i usta myszy były unieruchomione.Włóż sondę zgłębnika do tylnej części gardła myszy, aż sonda dotrze do przełyku. Upewnij się, że sonda nie jest włożona zbyt głęboko, ponieważ płuca myszy mogą ulec perforacji, powodując śmierć. Reprezentatywny obraz genomu ilustruje krajobraz zmian genomowych w jednym guzie.Typowe dla nowotworów seropodtypu o wysokim stopniu złośliwości, zidentyfikowano wiele niebieskich linii zysków i strat czerwonych linii, co wskazuje na wysoki poziom niestabilności genomu. Główną zmianą trendu interwencji terapeutycznej w guzie OC101 była amplifikacja na chromosomie 17, obejmująca ERBB2, gen kodujący receptor HER2. Aby zweryfikować wyniki na poziomie DNA, zaprojektowano kilka zestawów specyficznych starterów dla krawędzi amplifikowanego regionu.I przeprowadzono PCR. Żaden produkt amplifikacji nie został wchłonięty, gdy użyto kontrolnego ludzkiego DNA. Zidentyfikowano specyficzne prążki dla DNA guza OC101.W innym wariancie nowotworu, T14, zaobserwowano liczne przyrosty DNA. Obejmowały one AKT2 w genach RICTOR. Walidacja przeprowadzona na poziomie białka przy użyciu immunoblottingu wykazała wysokie poziomy AKT w RICTOR.Znaczne zmniejszenie masy guza zaobserwowano w grupie leczonej chemioterapią pod koniec szóstego tygodnia. Stwierdzono dodatkowe korzyści w porównaniu z samą chemioterapią w grupach, które otrzymywały leczenie skojarzone. Tkankę nowotworową pobrano do analizy molekularnej odpowiedzi na leczenie pod koniec badania klinicznego.Całkowite i ufosforylowane poziomy S6, AKT i mTOR oznaczono za pomocą immunoblottingu. Porównanie poziomów tych białek u osób nieleczonych, leczonych chemioterapią i leczonych inhibitorem AKT lub mTOR wykazało wyraźny spadek w przypadku dwóch ostatnich. Przedstawione podejście jest bardzo przydatne do przeprowadzenia badania klinicznego w modelach PDX.Wykorzystuje charakterystykę molekularną guza uzyskaną za pomocą profilowania genomowego w celu określenia najlepszego wyboru leków do testów.

testing-targeted-therapies-cancer-using-structural-dna-alteration

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Odkryj algorytm testowania terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Przeglądaj więcej filmów