Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Opisany tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie algorytmu badania skuteczności leczenia z wykorzystaniem modeli nowotworów in vivo. Protokół składa się z połączenia kilku technik. Biosekwencjonowanie całego genomu próbek ludzkich guzów służy do identyfikacji zmian genomowych.

Obejmują one zarówno rearanżacje genów, jak i zmiany liczby kopii genów. Przeprowadza się więc analizę zidentyfikowanych zmian w celu wybrania zmian potencjalnie ulegających uleczeniu. Leki wybrane na podstawie analizy genomowej są następnie stosowane w leczeniu in vivo odpowiednich nowotworów wyhodowanych u myszy z obniżoną odpornością.

Opracowany algorytm stanowi obiecujące podejście wspomagające podejmowanie decyzji dotyczących leczenia pacjentów z nowotworami. Użyj narzędzia Panda lub analogicznego oprogramowania, aby zidentyfikować zmiany, które można ukierunkować. Możemy wymienić geny, które zostały zidentyfikowane za pomocą mikrosekwencjonowania, w postaci prostego pliku z zakładkami przy użyciu standardowych akceptowanych symboli genów.

Dodaj znak krzyżyka do wiersza nagłówka listy, aby upewnić się, że nagłówek tabeli zostanie przeniesiony na poziom ścieżki U oprogramowania. Prześlij plik, klikając odpowiednią zakładkę nawigacyjną. Przypisz pojedynczą ikonę reprezentującą dane bazowe, klikając wybraną ikonę, a następnie klikając kartę Finalizuj.

Po przesłaniu plików pacjenta wyświetl podgląd strony, aby zidentyfikować kolumnę, która wyświetla liczbę opisanych genów na ścieżkę. To jest ostatnia kolumna po prawej. Użyj filtru ścieżek w lewym górnym rogu okna głównego, aby ograniczyć liczbę wyświetlanych ścieżek do tych, które zawierają interesujące geny.

Aby zidentyfikować szlaki, które mają więcej genów z adnotacjami, niż można by się spodziewać przypadkowo, użyj funkcji znajdującej się pod zakładką wzbogacania. Następnie do głównej tabeli dodawana jest kolumna, która pokazuje odpowiednią wartość p z dokładnego testu Fishera. Wybierz bazę danych, aby wyświetlić potencjalne geny podatne na działanie narkotyków z predefiniowanej adnotacji, zaznaczając odpowiednią ikonę po lewej stronie okna głównego.

Aby wybrać ścieżkę do wizualizacji, kliknij na jej nazwę wyświetlaną na stronie przeglądarki ścieżek. Ikony reprezentujące każdy zestaw adnotacji są wyświetlane obok powiązanego genu. Kliknięcie dowolnego genu w ścieżce otworzy odpowiednią stronę z kartami genów.

Wybierz ścieżki, które wykazały adnotowane geny będące przedmiotem zainteresowania i trafienia dla potencjalnych leków do dalszej analizy. Wykonaj pracę tkankową w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Umieść tkankę nowotworową w naczyniu zawierającym zimny PBS lub pożywkę do hodowli tkankowych, taką jak RPMI, DMEM, zawierającą antybiotyki.

Zidentyfikuj i wyizoluj żywy materiał nowotworowy z sąsiedniej normalnej i martwiczej tkanki z pomocą patologa. Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć materiał martwiczy wskazany przez patologa. Aby wykonać wszczepienie podskórne, przeciąć tkankę nowotworową sterylnymi kleszczami, skalpelem lub nożyczkami chirurgicznymi na małe fragmenty o wymiarach około 2 x 2 x 2 milimetry.

Przenieś rozdrobnioną tkankę na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego na lodzie. Wpuścić zimny matrigel do naczynia z rozdrobnioną tkanką, około 200 mikrolitrów na 10 kawałków tkanki. Dobrze wymieszaj i pozwól fragmentom tkanek zanurzyć się w matriżelu przez 10 minut.

Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie skóry o długości 5-10 milimetrów na obu bokach myszy. Delikatnie włóż proste kleszcze w przestrzeń podskórną, aby stworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby fragment guza mógł zostać umieszczony pod poduszką tłuszczową. Za pomocą sterylnych prostych kleszczy wprowadź fragmenty guza do wcześniej przygotowanej kieszonki u każdej z pięciu myszy.

Zamknij nacięcie skóry za pomocą kleju tkankowego. Po implantacji, aby zahamować proliferację limfocytów, wstrzyknąć każdej myszy 100 mikrolitrów rytuksymabu. Przygotuj mysz do gajnika ustnego, ściskając skórę grzbietu i zginając ją do tyłu, tak aby głowa i usta myszy były unieruchomione.

Włóż sondę zgłębnika do tylnej części gardła myszy, aż sonda dotrze do przełyku. Upewnij się, że sonda nie jest włożona zbyt głęboko, ponieważ płuca myszy mogą ulec perforacji, powodując śmierć. Reprezentatywny obraz genomu ilustruje krajobraz zmian genomowych w jednym guzie.

Typowe dla nowotworów seropodtypu o wysokim stopniu złośliwości, zidentyfikowano wiele niebieskich linii zysków i strat czerwonych linii, co wskazuje na wysoki poziom niestabilności genomu. Główną zmianą trendu interwencji terapeutycznej w guzie OC101 była amplifikacja na chromosomie 17, obejmująca ERBB2, gen kodujący receptor HER2. Aby zweryfikować wyniki na poziomie DNA, zaprojektowano kilka zestawów specyficznych starterów dla krawędzi amplifikowanego regionu.

I przeprowadzono PCR. Żaden produkt amplifikacji nie został wchłonięty, gdy użyto kontrolnego ludzkiego DNA. Zidentyfikowano specyficzne prążki dla DNA guza OC101.

W innym wariancie nowotworu, T14, zaobserwowano liczne przyrosty DNA. Obejmowały one AKT2 w genach RICTOR. Walidacja przeprowadzona na poziomie białka przy użyciu immunoblottingu wykazała wysokie poziomy AKT w RICTOR.

Znaczne zmniejszenie masy guza zaobserwowano w grupie leczonej chemioterapią pod koniec szóstego tygodnia. Stwierdzono dodatkowe korzyści w porównaniu z samą chemioterapią w grupach, które otrzymywały leczenie skojarzone. Tkankę nowotworową pobrano do analizy molekularnej odpowiedzi na leczenie pod koniec badania klinicznego.

Całkowite i ufosforylowane poziomy S6, AKT i mTOR oznaczono za pomocą immunoblottingu. Porównanie poziomów tych białek u osób nieleczonych, leczonych chemioterapią i leczonych inhibitorem AKT lub mTOR wykazało wyraźny spadek w przypadku dwóch ostatnich. Przedstawione podejście jest bardzo przydatne do przeprowadzenia badania klinicznego w modelach PDX.

Wykorzystuje charakterystykę molekularną guza uzyskaną za pomocą profilowania genomowego w celu określenia najlepszego wyboru leków do testów.