Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji
10 października 2025
Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).
Moje badania odkrywają mutacje genetyczne w nowotworach, aby poprawić diagnozę i leczenie. Aby zapocząć, zarejestruj informacje o próbce w Laboratory Information Management System i wypełnij formularz świadomej zgody na testy mutacji genów. Używając jednorazowych ostrzy mikrotomowych, wycięto fragmenty z niedrobnokomórkowego raka płuc, formalną i utrwaloną próbkę z parafiną.
Następnie wykonuj rutynowe barwienia hematoksylyną i eozyną, aby ocenić zawartość komórek nowotworowych. Do ekstrakcji kwasów nukleinowych, używając mikrotomu, przeciąń formalny i stały blok osadzony w parafinie, aby uzyskać wstęgę, i umieść wstęgę w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Przenieś probówkę do wyznaczonego miejsca wejścia próbki na automatycznym przyrządzie ekstrakcyjnym.
Następnie użyj automatycznego narzędzia ekstrakcyjnego z automatycznym zestawem do ekstrakcji. Zamień ręczne kroki pipetowania na automatyczny system ekstrakcji nukleinowych z magnetycznymi kulkami. Następnie wybierz program C1102 na instrumencie.
Wybierz czas inkubacji próbki po dewoskowaniu na 16 godzin i ustaw objętość elucian na 100 mikrolitrów. Użyj spektrofotometrii, aby zweryfikować czystość DNA. Następnie użyj zestawu wykrywającego z fluorescencyjnymi barwnikami specyficznymi dla sekwencji, aby wykonać test fluorometryczny dla precyzyjnego pomiaru stężenia DNA.
Aby przygotować fragmentowane DNA genomowe za pomocą ultradźwięków, wymieszaj 200 nanogramów DNA genomowego w 50 mikrolitrach buforu o niskim zawartości tris-EDTA. Umieść probówkę w schłodzonej stojaku na próbki, utrzymywanej w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Ustaw parametry instrumentu zgodnie z protokołem i rozpocznij fragmentację DNA.
Aby rozpocząć automatyczne przygotowanie biblioteki, naciśnij przycisk zasilania, aby uruchomić system i poczekać na zakończenie inicjalizacji. Przejdź do ustawień programu, wybierz uruchom protokół i wybierz protokół BurningRock HS. Ustaw typ próbki na DNA wysokiej jakości, ilość nanogramów wejściowych na 50, cykle pre-PCR na 12, a cykle po PCR na 12. Następnie kliknij Run, aby przejść dalej.
Następnie wkłada gotowy wkład odczynnikowy do wyznaczonego slotu instrumentu, co automatycznie zweryfikuje jego położenie i status. Po załadowaniu próbek naciśnij start, aby rozpocząć autonomiczny bieg. Obserwuj wskaźniki LED w systemie, aby monitorować postępy.
Po zakończeniu programu kliknij OK, aby potwierdzić, a system automatycznie przeniesie ostateczną bibliotekę do tube bibliotecznego, kończąc przygotowania do biblioteki. Zmierz stężenie zarówno przedbibliotecznej, jak i całkowitej biblioteki za pomocą fluorometrii. Rozcieńcz bibliotekę sekwencjonów do 1,6 pikomolara i 1300 mikrolitrów do operacji sekwencjonowania.
Kontroluj środowisko sekwencjonowania, utrzymując temperaturę i wilgotność wewnątrz. Pełna kontrola jakości danych wyjściowych instrumentu poprzez weryfikację jakości bazy powyżej Q 30 oraz filtra przepuszczającego gęstość klastra. Zoptymalizowany proces detekcji niezawodnie zidentyfikował kilka klinicznie możliwych do działania zmian genomowych w reprezentatywnych próbkach nowotworów.
Wyniki sekwencjonowania wykazały wysokoczęstotliwościowy EGFR p. Mutacja missense L858R, towarzysząca znaczącemu wzmocnieniu liczby kopii genu EGFR. Zaobserwowano umiarkowane wzmocnienie genu MET oraz niskie amplifikowanie genu BRAF.
Próbka wykazywała obciążenie mutacją guza pośredniego oraz stabilny status mikrosatelitarny. Wszystkie docelowe loci genów, w tym ALK, BRAF, KRAS i ROS1, osiągnęły 100% wskaźnik wykrywalności w czterech eksperymentach replikowanych. Każda mutacja była konsekwentnie wykrywana we wszystkich czterech powtarzających się eksperymentach, przy oczekiwanych wartościach liczebności pozostających w normie fluktuacji, NJS zapewnia profil genetyczny kompresyjny w przypadku niedrobnokomórkowego raka płuca, wykrywając jednocześnie powszechne, rzadkie i nowe geny.
Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na połączeniu patologii molekularnej ze sztuczną inteligencją, aby badać nowe biomarkery raka płuc.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje zautomatyzowany, akredytowany zgodnie z ISO15189 przepływ pracy sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania docelowo modyfikowanych zmian genomowych w formalinowo fiksowanych i osadzanych w parafinie tkankach nowotworowych drobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Proces obejmuje rejestrację próbek, cięcie na sekcje i ekstrakcję kwasów nukleinowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Onkologia
- Genomika
- Patologia
Tło
- Drobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) jest powszechnym typem raka płuca.
- Identyfikowanie zmian genomowych jest kluczowe dla terapii docelowych.
- Formalinowo fiksowane i osadzone w parafinie tkanki są często wykorzystywane w badaniach nad rakiem.
- Zautomatyzowane przepływy pracy mogą poprawić wydajność i dokładność testów genomowych.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego przepływu pracy sekwencjonowania dla próbek NSCLC.
- Poprawa wykrywania docelowo modyfikowanych zmian genomowych.
- Zapewnienie zgodności ze standardami ISO15189.
Stosowane metody
- Rejestracja informacji o próbce w Systemie Zarządzania Informacją Laboratorium.
- Cięcie sekcji z formalinowo fiksowanych i osadzanych w parafinie próbek za pomocą ostrza mikrotomowego.
- Przeprowadzenie rutynowego barwienia hematoksyliną i eozyną do oceny zawartości komórek nowotworowych.
- Ekstrakcja kwasów nukleinowych za pomocą zautomatyzowanego instrumentu ekstrakcyjnego.
Główne wyniki
- Udana ekstrakcja kwasów nukleinowych z próbek NSCLC.
- Uzyskanie wysokiej jakości danych genomowych dla docelowo modyfikowanych zmian.
- Przepływ pracy wykazał zgodność z akredytacją ISO15189.
- Poprawa zdolności diagnostycznych w leczeniu NSCLC.
Wnioski
- Zautomatyzowany przepływ pracy sekwencjonowania jest skuteczny w przypadku NSCLC.
- Zgodność z ISO15189 zwiększa wiarygodność wyników.
- Ten protokół można dostosować do innych rodzajów raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Comprehensive detection of actionable genomic alterations in non-small cell lung cancer (NSCLC) is critical for precision oncology and portfolio advancement. Automated, ISO15189-certified next-generation sequencing (NGS) workflows enable high-confidence identification of mutations, fusions, and amplifications, supporting robust target validation and risk-adjusted decision-making. Standardized, reproducible NGS processes reduce technical variability and accelerate translational research integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise identification of driver mutations and gene amplifications for functional target validation.
- Supports biological de-risking by detecting both common and rare genomic alterations in NSCLC samples.
- Facilitates predictive confidence in target selection through rigorous quality control and replicate concordance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genomic profiles for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Standardizes sample processing and library preparation to ensure reproducibility and quantitative reliability.
- Automated workflows minimize human error, supporting scalable and high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational continuity in NSCLC research.
- Enables risk-adjusted advancement by providing comprehensive mutation and amplification data for preclinical models.
- Supports integration of molecular pathology and emerging biomarker discovery for future translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This NGS workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by delivering high-fidelity genomic data from clinical NSCLC samples.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation detection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative genomic outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-quality, statistically validated readouts for cross-condition comparison and decision support.
- Translational Research: Ensures biomarker alignment and continuity from discovery through preclinical validation in NSCLC.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for ongoing molecular profiling across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and rigorous QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable genomic data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NSCLC and other oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, NGS instrumentation, and bioinformatics analysis.
- Demands access to automated extraction and library preparation systems with validated protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample input, QC thresholds, and data interpretation.
- Must adapt protocols for varying tumor cellularity and FFPE sample quality.
- Turnaround time and technical complexity remain practical considerations for clinical and translational deployment.
