Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Moje badania odkrywają mutacje genetyczne w nowotworach, aby poprawić diagnozę i leczenie. Aby zapocząć, zarejestruj informacje o próbce w Laboratory Information Management System i wypełnij formularz świadomej zgody na testy mutacji genów. Używając jednorazowych ostrzy mikrotomowych, wycięto fragmenty z niedrobnokomórkowego raka płuc, formalną i utrwaloną próbkę z parafiną.

Następnie wykonuj rutynowe barwienia hematoksylyną i eozyną, aby ocenić zawartość komórek nowotworowych. Do ekstrakcji kwasów nukleinowych, używając mikrotomu, przeciąń formalny i stały blok osadzony w parafinie, aby uzyskać wstęgę, i umieść wstęgę w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Przenieś probówkę do wyznaczonego miejsca wejścia próbki na automatycznym przyrządzie ekstrakcyjnym.

Następnie użyj automatycznego narzędzia ekstrakcyjnego z automatycznym zestawem do ekstrakcji. Zamień ręczne kroki pipetowania na automatyczny system ekstrakcji nukleinowych z magnetycznymi kulkami. Następnie wybierz program C1102 na instrumencie.

Wybierz czas inkubacji próbki po dewoskowaniu na 16 godzin i ustaw objętość elucian na 100 mikrolitrów. Użyj spektrofotometrii, aby zweryfikować czystość DNA. Następnie użyj zestawu wykrywającego z fluorescencyjnymi barwnikami specyficznymi dla sekwencji, aby wykonać test fluorometryczny dla precyzyjnego pomiaru stężenia DNA.

Aby przygotować fragmentowane DNA genomowe za pomocą ultradźwięków, wymieszaj 200 nanogramów DNA genomowego w 50 mikrolitrach buforu o niskim zawartości tris-EDTA. Umieść probówkę w schłodzonej stojaku na próbki, utrzymywanej w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza. Ustaw parametry instrumentu zgodnie z protokołem i rozpocznij fragmentację DNA.

Aby rozpocząć automatyczne przygotowanie biblioteki, naciśnij przycisk zasilania, aby uruchomić system i poczekać na zakończenie inicjalizacji. Przejdź do ustawień programu, wybierz uruchom protokół i wybierz protokół BurningRock HS. Ustaw typ próbki na DNA wysokiej jakości, ilość nanogramów wejściowych na 50, cykle pre-PCR na 12, a cykle po PCR na 12. Następnie kliknij Run, aby przejść dalej.

Następnie wkłada gotowy wkład odczynnikowy do wyznaczonego slotu instrumentu, co automatycznie zweryfikuje jego położenie i status. Po załadowaniu próbek naciśnij start, aby rozpocząć autonomiczny bieg. Obserwuj wskaźniki LED w systemie, aby monitorować postępy.

Po zakończeniu programu kliknij OK, aby potwierdzić, a system automatycznie przeniesie ostateczną bibliotekę do tube bibliotecznego, kończąc przygotowania do biblioteki. Zmierz stężenie zarówno przedbibliotecznej, jak i całkowitej biblioteki za pomocą fluorometrii. Rozcieńcz bibliotekę sekwencjonów do 1,6 pikomolara i 1300 mikrolitrów do operacji sekwencjonowania.

Kontroluj środowisko sekwencjonowania, utrzymując temperaturę i wilgotność wewnątrz. Pełna kontrola jakości danych wyjściowych instrumentu poprzez weryfikację jakości bazy powyżej Q 30 oraz filtra przepuszczającego gęstość klastra. Zoptymalizowany proces detekcji niezawodnie zidentyfikował kilka klinicznie możliwych do działania zmian genomowych w reprezentatywnych próbkach nowotworów.

Wyniki sekwencjonowania wykazały wysokoczęstotliwościowy EGFR p. Mutacja missense L858R, towarzysząca znaczącemu wzmocnieniu liczby kopii genu EGFR. Zaobserwowano umiarkowane wzmocnienie genu MET oraz niskie amplifikowanie genu BRAF.

Próbka wykazywała obciążenie mutacją guza pośredniego oraz stabilny status mikrosatelitarny. Wszystkie docelowe loci genów, w tym ALK, BRAF, KRAS i ROS1, osiągnęły 100% wskaźnik wykrywalności w czterech eksperymentach replikowanych. Każda mutacja była konsekwentnie wykrywana we wszystkich czterech powtarzających się eksperymentach, przy oczekiwanych wartościach liczebności pozostających w normie fluktuacji, NJS zapewnia profil genetyczny kompresyjny w przypadku niedrobnokomórkowego raka płuca, wykrywając jednocześnie powszechne, rzadkie i nowe geny.

Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na połączeniu patologii molekularnej ze sztuczną inteligencją, aby badać nowe biomarkery raka płuc.