Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

Nasz model pozwala więc na badanie potranskrypcyjnej modulacji określonego transkryptu w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej oraz ich stanów fizjologicznych i patofizjologicznych. Tak więc przejściowa transfekcja pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych ma minimalny wpływ na fizjologię i metabolizm komórki, co stanowi wyraźną przewagę nad klasycznymi protokołami wykorzystującymi inhibitory transkrypcji. W celu wytworzenia plazmidu odpowiedzi wyrażającego gen będący przedmiotem zainteresowania, sekwencja genu i wiele miejsc klonowania indukowalnego wektora muszą być analizowane w celu zidentyfikowania sekwencji rozpoznawania w wielu miejscach klonowania, które nie są obecne wewnętrznie w genie.

Korzystając z polimerazy taq o wysokiej wierności i standardowych technik nakładania się PCR, należy otoczyć gen będący przedmiotem zainteresowania dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymów restrykcyjnych za pomocą starterów o zaprojektowanym kształcie. Sekwencja kodująca epitop V5 przed genem będącym przedmiotem zainteresowania musi być włączona w celu odróżnienia ekspresji transfekowanego genu od ekspresji endogennej. Mutanty mogą być generowane przez sekwencyjną delecję w celu zbadania wpływu różnych trzech pierwszych regionów nieulegających translacji na stabilność mRNA genu przy użyciu odwrotnych starterów kodujących miejsce poliadenylacji, które stopniowo usuwa trzy pierwsze końce nieulegającego translacji regionu.

Ostatecznie insercja genu będącego przedmiotem zainteresowania może zostać potwierdzona przez analizę restrykcyjną. Orientację genów i brak mutacji potencjalnie wprowadzonych podczas rtPCR można potwierdzić za pomocą sekwencjonowania. W celu transfekcji pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu płuc szczura, należy zasiać komórki w ilości od jednego do 10 do szóstego komórek na centymetr kwadratowy na 100-milimetrowych szalkach Petriego w obecności kompletnej minimalnej niezbędnej pożywki.

Hodowla przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki bez antybiotyku do każdej studzienki nowej 12-dołkowej płytki i podgrzej płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas tej inkubacji dodaj jeden mikrogram plazmidu odpowiedzi i jeden mikrogram wektora regulatorowego do jednej 1,5 mililitrowej probówki na studzienkę.

Przemyj komórki nabłonka pęcherzyków płucnych 10 mililitrami na studzienkę PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu i potraktuj komórki pięcioma mililitrami na studzienkę 37 stopni Celsjusza 0,05% trypsyny przez dwie do czterech minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 mililitrów na studzienkę kompletnego podłoża bez antybiotyku i zbierz komórki do nowej 50-mililitrowej probówki. Umyj naczynie czterema mililitrami świeżej pożywki, aby zebrać pozostałe komórki i osadzać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS w celu zliczenia i ponownie odwirować komórki. Zawiesić osad o gęstości cztery razy 10 do siódmej komórki na mililitr buforu do respensji i dodać cztery razy 10 do piątej komórki do każdej probówki plazmidu i wektora, delikatnie mieszając. Umieść jedną probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnij probówkę 3,5 mililitra buforu elektrolitycznego.

Całkowicie wciśnij tłok, aby włożyć pozłacaną końcówkę elektrody do pipety i delikatnie wymieszaj zawartość probówki. Ostrożnie zassać komórki pipetą i włożyć pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie. Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych i naciśnij Start na ekranie dotykowym.

Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do jednego dołka wstępnie podgrzanej płytki 12-dołkowej. Gdy wszystkie komórki zostaną poddane elektroporacji i platerowane, umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, zastępując supernatant w każdym dołku kompletnym podłożem z antybiotykami po dwóch dniach. Powodzenie transfekcji można potwierdzić przez ekspresję EGFP obserwowaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej z użyciem wektora kontrolnego.

Aby zahamować transkrypcję genu będącego przedmiotem zainteresowania, 72 godziny po transfekcji zastąp supernatant jednym mililitrem na studzienkę kompletnej pożywki uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr świeżo przygotowanej adoksycykliny. Aby ocenić okres półtrwania mRNA interesującego genu, należy umieścić płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej od 15 minut do sześciu godzin. Mycie jednej studzienki jednym mililitrem lodowatego PBS przed lizą komórek za pomocą 500 mikrolitrów buforu do lizy z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA chloroformu fenolowego i delikatne wstrząsanie w każdym eksperymentalnym punkcie czasowym.

Następnie wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami zestawu i określ wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nanometrach. Aby określić stabilność wyizolowanego RNA, najpierw potraktuj jeden mikrogram całkowitego RNA z każdej próbki DNazą wolną od RNazy, aby usunąć wszelkie ślady plazmidowego DNA. Użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy cDNA z mieszanką oligo dT i losowych starterów heksomerowych, aby poprawić wydajność odwrotnej transkrypcji w celu odwrotnej transkrypcji zubożonego całkowitego RNA DNA do cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodaj 180 mikrolitrów wody klasy biologii molekularnej do 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej, aby rozcieńczyć reakcję cDNA w stężeniu pięciu nanogramów na mikrolitr i natychmiast rozcieńczyć mieszaninę cDNA świeżą wodą klasy biologii molekularnej, aby osiągnąć stężenie 1,25 nanograma na mikrolitr. Połącz pięć mikrolitrów głównej mieszanki barwników cyber green z 0,1 mikrolitra wody klasy biologii molekularnej, 0,45 mikrolitra 7,5 mikromolowego startera do przodu, 0,45 mikrolitra 7,5 mikromolowego startera odwróconego i czterech mikrolitrów 1,25 nanograma na mikrolitr cDNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 mikrolitrów. Umieścić próbki w termocyklerze qPCR i amplifikować gen znacznika V5 będący przedmiotem zainteresowania oraz amplikony postępu transaktywatora tetrocykliny przy użyciu warunków qPCR, jak wskazano, i wygenerować krzywą topnienia o wysokiej rozdzielczości w celu oceny określonych temperatur topnienia pożądanych amplikonów i zapewnienia braku pików amplikonu hałasu.

Ta technika elektroporacji pipet umożliwia osiągnięcie od 25 do 30% skuteczności transfekcji, co obserwuje się na podstawie proporcji komórek EGFP wykrytych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Traktowanie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny nie ma znaczącego wpływu na ekspresję endogennego mRNA alfa ENaC w żadnym momencie okresu leczenia. Korzystając z systemu ekspresji plazmidu kontrolowanego transkrypcji, jak pokazano, sygnał V5 alfa ENaC można znormalizować zgodnie z zaawansowanym sygnałem transaktywatora tetracykliny w celu określenia skuteczności transfekcji przy użyciu metody cyklu podwójnej deltyfikacji.

Okres półtrwania mRNA alfa ENaC jest do siedmiu razy krótszy w obecności układu wyłączającego tetracyklinę niż w obecności aktynomycyny D, co potwierdza, że aktynomycyna D prowadzi do sztucznej stabilizacji mRNA alfa ENaC. Ponadto leczenie cykloheksamidem i czynnikiem martwicy nowotworu alfa znacznie zmniejszyło stabilność transkryptu, podczas gdy lipopolisacharydy nie. Znaczące zmiany w modulacji stabilności mRNA V5 alfa ENaC mogą być indukowane w zależności od usuniętych i zawartych regionów trzech głównych regionów nieulegających translacji.

Ponadto nadekspresja specyficznych białek wiążących RNA zmniejsza stabilność mRNA 5-alfa ENaC w porównaniu z transfekcją z pustym plazmidem pcDNA three. Narzędzie to będzie przydatne do badania nowych spostrzeżeń na temat potranskrypcyjnej regulacji kluczowych genów zaangażowanych w funkcję nabłonka pęcherzyków płucnych i ich stanów fizjologicznych lub patologicznych.