Name: Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę ekspresji plazmidu sterowaną transkrypcją do badania stabilności mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych. Technika elektroporacji pipetowej minimalizuje zakłócenia fizjologii komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Francis Migneault był wspierany przez stypendium zapewnione przez Quebec Respiratory Health Network i program szkoleniowy Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), stypendium z FRSQ i stypendium z Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Praca ta była wspierana przez Katedrę Badań Klinicznych Gosselin-Lamarre oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem [YBMOP-79544].

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnej Centrum Badawczego Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Projektowanie i generowanie plazmidu odpowiedzi wyrażającego gen zainteresowania (GOI)
<ol>
	<li>Użyj indukowalnego wektora tetracykliny, takiego jak pTRE-Tight.</li>
	<li>Przeanalizuj sekwencję rządu Indii i miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora, aby zidentyfikować miejsca ograniczeń w MCS, które nie są obecne wewnętrznie w GOI.</li>
	<li>Wyizoluj pierwotne komórki nabłonka pęcherzyków płucnych z płuc samca szczura Sprague-Dawley, jak opisano wcześniej19,20.</li>
	<li>Oczyść całkowite RNA z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych przez ekstrakcję RNA przy użyciu standardowej metody, takiej jak ekstrakcja fenolem/chloroformem lub użycie kolumn wirujących RNA na bazie krzemionki.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja mRNA na komplementarne DNA (cDNA) przy użyciu oligo (dT) i odwrotnej transkryptazy o wysokiej wierności.</li>
	<li>Użyj polimerazy Taq o wysokiej wierności i standardowych technik nakładania się PCR, aby oskrzydlić rząd Indii dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymów restrykcyjnych przy użyciu zaprojektowanych starterów.
	<ol>
		<li>Niech starter do przodu zawiera miejsce wiązania rybosomów w konsensusie Kozaka21, aby poprawić poziomy ekspresji w celu badania ekspresji białek równolegle ze stabilnością mRNA. Należy dołączyć sekwencję kodującą epitop V5 przed GOI w celu odróżnienia ekspresji transfekowanego II od ekspresji endogennej (tabela 1).</li>
		<li>Niech starter odwrotny zawiera sygnał poliadenylacji po kodonie stop.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mutanty mogą być generowane przez sekwencyjną delecję w celu zbadania wpływu różnych regionów 3' UTR na stabilność mRNA GOI przy użyciu odwrotnych starterów kodujących miejsce poliadenylacji, które stopniowo usuwa koniec 3' GOI 3' UTR (<silna klasa = "xfig">Figura 6). Alternatywnie, mutageneza ukierunkowana na PCR może być wykorzystana do ukierunkowania na określony region zainteresowania w klasie 3' UTR<sup="xref">22.</li>
	<li>Trawić indukowalny wektor i wkładkę z wcześniej wybranymi enzymami restrykcyjnymi w odpowiedniej temperaturze inkubacji przez 1 godzinę, a następnie poddawać działaniu fosfatazy podczas reakcji wektora przez 30 minut, aby uniknąć samoligacji.</li>
	<li>Oddzielić strawiony wektor i segmenty insertu za pomocą elektroforezy w 1-1,5% żelu agarozowym (stężenie zależne od wielkości wkładki).</li>
	<li>Za pomocą ostrza i światła UV zbierz fragmenty DNA zawierające pożądaną wstawkę i wektor do ligacji. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Oczyścić zebrane segmenty z żelu agarozowego za pomocą zestawu do oczyszczania PCR na bazie krzemionki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrii przy 260 nm.</li>
	<li>Zliguj GOI i indukowalny wektor za pomocą ligazy DNA T4 za pomocą stosunku wektora do wstawki 1: 3, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ligacji. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 godziny.</li>
	<li>Przekształć reakcję ligacji w kompetentną E. coli (DH5α).
	<ol>
		<li>Dodaj 1-10 ng wektora i genu do probówki zawierającej 100 μl kompetentnych komórek. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut, a następnie komory poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 42 °C przez 45 s. Umieść probówkę na lodzie na 2 minuty i dodaj 900 μl podłoża RT LB. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min.</li>
		<li>Rozprowadzić 100 μl reakcji na płytce agarowej LB z odpowiednim antybiotykiem (np. 100 μg/ml ampicyliny dla wektora pTRE-Tight) w celu wyselekcjonowania przekształconych bakterii. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wybrać poszczególne kolonie za pomocą pętli inokulacyjnej lub końcówki o pojemności 20 μl i inkubować przez noc w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej odpowiedni antybiotyk w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Przekształcone bakterie mogą być przechowywane w zapasach glicerolu w temperaturze -80 °C w stosunku 400:600 pożywki LB do glicerolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrahować plazmidowe DNA za pomocą kolumn plazmidowych na bazie krzemionki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrii przy 260 nm. Potwierdzić wprowadzenie rządu Indii za pomocą analizy ograniczeń i jego orientację oraz brak mutacji potencjalnie wprowadzonych podczas RT-PCR przez sekwencjonowanie.</li>
</ol>
2. Transfekcja plazmidu odpowiedzi wyrażającego interesujący nas gen (GOI) do pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych
<ol>
	<li>Wyizolować komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II z płuc szczura.</li>
	<li>Zasiać komórki o gęstości 1 x 10 6 komórek/cm2 na 100 mm szalki Petriego z kompletną minimalną pożywką niezbędną (kompletny MEM). Complete MEM to MEM uzupełniony 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycyny, Septra (3 μg/ml trimetoprimu i 17 μg/ml sulfametoksazolu), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) i 2 mM L-glutaminy. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia umieścić 500 μl kompletnego MEM bez antybiotyku w każdym dołku nowej 12-dołkowej płytki i ogrzać płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Na tym etapie ważne jest, aby stosować płodową surowicę bydlęcą wolną od zanieczyszczających tetracyklin lub o poziomie zbyt niskim, aby zakłócać indukowalność.</li>
	<li>Przygotować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające plazmid z indukowalnym GOI (plazmidem GOI) i wektorem regulatorowym (np. pTet-Off), dodając 1 μg plazmidu GOI i 1 μg wektora regulatorowego na studzienkę w temperaturze pokojowej. W przypadku eksperymentów koekspresyjnych z białkami wiążącymi RNA (RBP) do mieszanki DNA dodaje się 1 μg wektora konstytutywnego (np. pcDNA3) wyrażającego RPB będący przedmiotem zainteresowania (<silna klasa = "xfig">Figura 7).</li>
	<li>Odessać pożywkę i delikatnie przepłukać komórki PBS (bez wapnia i magnezu) podgrzanym w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml 0,05% trypsyny podgrzanej w temperaturze 37 °C i inkubować komórki, aż komórki zostaną odłączone (2-4 min). Zneutralizuj trypsynę, dodając 10 ml kompletnego MEM bez antybiotyku.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml, przemyć szalkę Petriego 4 ml pożywki, aby zebrać jak najwięcej pozostałych komórek, a następnie odwirować zawiesinę komórek przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie odessać i wyrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Policz i oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do resuspensji o stężeniu 4 x 107 komórek/ml. Dodać komórki z probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 2.4 w stężeniu 400 000 komórek na studzienkę i delikatnie je wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Umieścić probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnić ją 3,5 ml buforu elektrolitycznego.</li>
	<li>Włóż pozłacaną końcówkę elektrody do pipety, całkowicie dociskając tłok. Delikatnie wymieszać zawartość probówki o pojemności 1,5 ml i ostrożnie odessać komórki pipetą. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do końcówki, ponieważ spowoduje to wyładowanie łukowe podczas elektroporacji i doprowadzi do zmniejszenia wydajności transfekcji.</li>
	<li>Włóż pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, odpowiadający napięciu impulsu 1 450 V i 2 impulsom o szerokości 20 ms, a następnie naciśnij Start na ekranie dotykowym.</li>
	<li>Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do studzienki uprzednio wypełnionej kompletnym MEM bez antybiotyku, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.11-2.14 dla pozostałych próbek.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze. Po 2 dniach zastąp pożywkę kompletnym MEM z antybiotykami.</li>
	<li>Potwierdź powodzenie transfekcji, obserwując ekspresję eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym lub za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wektora kontrolnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i wymaga dodatkowego etapu transfekcji przy użyciu innego plazmidu eksprymującego eGFP, takiego jak pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>
3. Indukcja zahamowania transkrypcji przez rząd Indii
UWAGA: Komórki mogą być wstępnie potraktowane pożądanymi zabiegami przed indukcją doksycykliny, aby ocenić ich wpływ na stabilność mRNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C w sposób bezpieczny przed światłem. Doksycyklina, pochodna tetracykliny, jest stosowana zamiast tetracykliny, ponieważ ma dłuższy okres półtrwania (2x) niż tetracyklina. Co więcej, niższe stężenie doksycykliny jest wymagane do całkowitej inaktywacji tet operon23. 
	UWAGA: Doksycyklina może wpływać na ekspresję mRNA endogennego GOI. Aby to zweryfikować, należy zbadać wpływ 24-godzinnego leczenia doksycykliną na komórki pęcherzyków płucnych, aby potwierdzić brak jakichkolwiek zmian w ekspresji GOI (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór doksycykliny o stężeniu 1 μg/ml w pełnym MEM 72 godziny po transfekcji i ogrzać go do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 1 ml kompletnego MEM zawierającego 1 μg/ml doksycykliny na studzienkę, aby zahamować transkrypcję GOI.</li>
	<li>Inkubować wiele dołków w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez różne okresy czasu od 15 minut do 6 godzin, aby ocenić okres półtrwania mRNA rządu Indii.</li>
	<li>Pod koniec zabiegu umyj komórki lodowatym PBS i poddaj je lizie za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji fenolowo-chloroformowego RNA, dodając 500 μl buforu na studzienkę i wstrząsając płytką w celu homogenizacji komórek.</li>
	<li>Wyizolować RNA zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nm. Próbki RNA o proporcjach 260:230 i 260:280 wynoszących odpowiednio 1,8 i 2,0 są uważane za czyste. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
4. Określanie stabilności mRNA GOI
<ol>
	<li>Potraktuj 1 μg całkowitego RNA DNA bez RNAzyZyZy I (stopień amplifikacji), aby usunąć wszelkie ślady plazmidowego DNA, które mogłyby zakłócać późniejszą amplifikację DNA.
	<ol>
		<li>W probówce PCR o pojemności 0,2 ml połącz 1 μg całkowitego RNA, 1 μl 10x buforu reakcyjnego DNazy I, 1 μl DNAzy I (1 U/μL) i wodę wolną od RNAzy, aby uzyskać całkowitą objętość 10 μL.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Dezaktywować DNAzę I, dodając 1 μl 25 mM EDTA do 10 μl mieszaniny reakcyjnej i inkubując reakcję w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA zubożonego w DNA do cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do syntezy cDNA z mieszanką oligo(dT) i losowych starterów heksamerowych w celu poprawy wydajności odwrotnej transkrypcji.
	<ol>
		<li>Na krótko dodać 4 μl 5x mieszaniny reakcyjnej, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4 μl wody wolnej od RNAzy do 11 μl całkowitej mieszaniny RNA zubożonej w DNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 20 μL. Dobrze wymieszaj reakcję, pipetując ją w górę iw dół.</li>
		<li>Inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 25 °C, następnie 20 minut w temperaturze 46 °C, a następnie dezaktywować reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 1 minutę. Każda reakcja da 50 ng/μL produktu cDNA.</li>
		<li>Rozcieńczyć reakcję cDNA do stężenia 5 ng/μl, dodając 180 μl wody klasy biologii molekularnej do mieszaniny reakcyjnej o objętości 20 μl. Przechowywać produkty cDNA w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do wykonywania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie starterów qPCR do przodu i do tyłu specyficznych dla rządu Indii.
	<ol>
		<li>Ze względu na endogenną ekspresję GOI w komórkach, startery muszą być zaprojektowane tak, aby amplifikować amplikon 100-150 pz epitopu V5 sprzężonego z GOI (Tabela 1).</li>
		<li>Wewnętrzne referencyjne startery genów muszą być również używane jako kontrole normalizacji. Zwykle geny porządkowe, takie jak geny beta-aktyny i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1, są używane jako geny odniesienia. Nie można ich jednak używać z tym systemem indukcyjnym ze względu na zmienność wydajności transfekcji. Zamiast tego ekspresja transkryptu tTA-Ad jest oceniana w celu normalizacji, ponieważ jego ekspresja jest konstytutywna w komórkach ze względu na aktywność promotora wirusa cytomegalii. Każda zmiana jego ekspresji mierzona za pomocą qPCR będzie reprezentatywna dla skuteczności transfekcji (startery: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' i reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; amplikon 129 pz) i pozwoli na normalizację ekspresji transfekowanych klonów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować każdą reakcję qPCR w trzech egzemplarzach, używając głównej mieszanki barwników SYBR Green.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć mieszaninę cDNA o stężeniu 5 ng/μl do stężenia 1,25 ng/μl za pomocą wody klasy biologii molekularnej.</li>
		<li>Połącz 5 μl SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μl wody klasy biologii molekularnej, 0,45 μl 7,5 μM startera do przodu, 0,45 μl 7,5 μM startera odwrotnego i 4 μl 1,25 ng/μL cDNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 μL. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół na 96-dołkowej płytce PCR. Użyj optycznej folii samoprzylepnej, aby upewnić się, że pokrywa płyty jest szczelna i zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu.</li>
		<li>Odwirować na krótko mieszaninę reakcyjną przez odwirowanie i umieścić płytkę w termocyklerze qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikować znakowane V5 amplikony GOI i tTA-Ad przy użyciu następujących warunków qPCR: 95 °C przez 10 minut jako etap denaturacji, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 10 s, 58 °C przez 15 s i 72 °C przez 20 s. Po przeprowadzeniu cykli amplifikacji należy wygenerować krzywą topnienia o wysokiej rozdzielczości w celu oceny określonych temperatur topnienia pożądanych amplikonów i zapewnienia braku pików amplikonu szumu.
	<ol>
		<li>Uwzględnij kontrole ujemne dla qRT-PCR, wykonując qPCR z RNA jako matrycą bez odwrotnej transkryptazy, aby służyć jako kontrola potencjalnego zanieczyszczenia plazmidowego DNA i qPCR bez dodatku cDNA do mieszaniny qPCR, aby zapewnić brak dimerów starterów lub zanieczyszczeń.</li>
		<li>Optymalne stężenie cDNA, wydajność startera i stężenie muszą być zoptymalizowane zgodnie z rządem Indii za pomocą testu krzywej standardowej. W tym celu należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie przy użyciu cDNA z komórek niepoddanych działaniu substancji (hodowanych bez doksycykliny). Krzywa standardowa jest generowana przez wykreślenie wartości Cq w stosunku do logarytmu czynnika rozcieńczenia cDNA, a wydajność amplifikacji (E) oblicza się zgodnie z nachyleniem krzywej wzorcowej przy użyciu następującego wzoru: 
		E = 10-1/nachylenie 
		UWAGA: Wydajność amplifikacji powinna wynosić około 0,9 do 1,05. W przeciwnym razie podkłady muszą zostać przeprojektowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj dane qPCR przy użyciu metody porównawczej Cq, normalizując wartości ekspresji GOI do ekspresji tTA-Ad w celu uzyskania względnych poziomów ekspresji GOI i podania jego ekspresji jako procentu ekspresji mRNA GOI w komórkach tego samego zwierzęcia w punkcie początkowym (t = 0) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Okres półtrwania określa się na podstawie stałej szybkości (K) krzywej degradacji mRNA GOI za pomocą następującego równania: 
	t1/2 = ln 2/K.</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Niski współczynnik transfekcji komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej był poważnym ograniczeniem dla stosowania systemu Tet-Off do oceny stabilności mRNA w tych komórkach. Ograniczenie to zostało jednak przezwyciężone przez elektroporację pipet, co pozwoliło na uzyskanie 25–30% skuteczności transfekcji (ilustracje 1 i 3)26.
Pomiar stabilności transkryptu ma fundamentalne znaczenie dla zrozum...

Opracowano kilka technik określania okresu półtrwania mRNA. Technika rozpadu impulsowego, która wykorzystuje znakowane mRNA, pozwala na jednoczesną ocenę dużej puli mRNA przy minimalnych zakłóceniach komórkowych. Jednak podejście to nie pozwala na bezpośrednie oszacowanie okresu półtrwania pojedynczego transkryptu genu i nie może być zaimplementowane do badania potranskrypcyjnej modulacji mRNA po stymulacji czynnikami wzrostu, ROS, alarminami lub stanem zapalnym1.
Stosowanie inhibitorów transkrypcji, takich jak aktynomycyna D i α-amanityna, jest stosunkowo prostą metodą pomiaru kinetyki degradacji mRNA w czasie. Jedną z głównych zalet tego podejścia w porównaniu z poprzednimi technikami (tj. pościg impulsowy) jest możliwość bezpośredniego oszacowania okresu półtrwania danego transkryptu i porównania, jak różne terapie mogą wpływać na kinetykę jego degradacji. Jednak znaczący szkodliwy wpływ inhibitorów transkrypcji na fizjologię komórki stanowi główną wadę tego podejścia2. Rzeczywiście, hamowanie transkryptomu całej komórki za pomocą tych leków ma negatywny efekt uboczny w postaci zakłócenia syntezy kluczowych elementów zaangażowanych w stabilność mRNA, takich jak mikroRNA (miRNA), a także ekspresji i syntezy białek wiążących RNA, które są ważne dla degradacji i stabilności mRNA. Poważne zaburzenia transkrypcji genów przez te leki mogą zatem sztucznie modyfikować krzywe degradacji transkryptów.
System indukcji promotora reprezentuje trzecie podejście do pomiaru okresu półtrwania określonego mRNA. Metoda ta mierzy degradację określonego mRNA w podobny sposób, jak metody wykorzystujące inhibitory transkrypcji. Często stosowane są dwa rodzaje systemów indukcyjnych: indukowany surowicą promotor c-fos 3 oraz system indukowany Tet-Off4. W przypadku systemu c-fos nie jest konieczne stosowanie inhibitorów transkrypcji, które mogą być toksyczne dla komórki. Metoda ta wymaga jednak synchronizacji cyklu komórkowego, co uniemożliwia ocenę rzeczywistej stabilności transkryptu podczas interphase5. W przeciwieństwie do tego, system Tet-Off pozwala na silną ekspresję genu zainteresowania (GOI) pod kontrolą syntetycznego promotora regulowanego tetracykliną. System ten wymaga obecności dwóch elementów, które muszą zostać kotransfekowane do komórki, aby działały. Pierwszy plazmid (pTet-Off) wykazuje ekspresję białka regulatorowego tTA-Adv, hybrydowego syntetycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z represora prokariotycznego TetR (z Escherichia coli) połączonego z trzema domenami transaktywacji transkrypcji z białka wirusowego HSV VP16. Rząd Indii klonuje się do plazmidu pTRE-Tight pod kontrolą syntetycznego promotora (PTight), składającego się z minimalnej sekwencji promotora wirusa cytomegalii (CMV) połączonej z siedmioma powtórzeniami sekwencji operatora tetO. Transkrypcja genu za PTight zależy od interakcji TetR z tetO. W obecności tetracykliny lub jej pochodnej, doksycykliny, represor TetR traci swoje powinowactwo do operatora tetO, co prowadzi do zaprzestania transkrypcji4. Charakterystyka systemu Tet-Off sprawia, że jest on idealnym modelem do badania specyficznej ekspresji mRNA w komórkach eukariotycznych przy jednoczesnym unikaniu potencjalnych efektów plejotropowych, które są wtórne do braku prokariotycznych sekwencji regulatorowych w komórce eukariotycznej6. Zazwyczaj podwójnie stabilne linie komórkowe Tet-Off (HEK 293, HeLa i PC12) są używane z tym systemem do integracji kopii regulatora i plazmidów odpowiedzi w celu wygodnego dostępu do kontrolowanej ekspresji genów7,8,9.
Kilka modeli komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli zostało wykorzystanych do badania biologii komórkowej i molekularnej nabłonka pęcherzyków płucnych. Przez lata naukowcy intensywnie wykorzystywali ludzkie lub gryzonie pierwotne komórki10,11, a także unieśmiertelnione linie komórkowe, takie jak ludzkie komórki A549 lub szczurze RLE-6TN12,13. Chociaż są one na ogół mniej proliferacyjne i trudniejsze do hodowli i transfekcji, komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej pozostają złotym standardem w badaniu funkcji i dysfunkcji nabłonka pęcherzyków płucnych w stanach fizjologicznych i patologicznych. Rzeczywiście, unieśmiertelnione linie komórkowe, takie jak komórki A549, nie wykazują złożonych cech i fenotypów komórek pierwotnych, podczas gdy komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej podsumowują główne właściwości nabłonka pęcherzyków płucnych, w szczególności zdolność do tworzenia spolaryzowanej i szczelnej bariery14,15. Niestety, komórki te są bardzo odporne na konwencjonalne techniki transfekcji, takie jak te wykorzystujące liposomy, co sprawia, że użycie systemu indukowanego przez promotor, takiego jak Tet-Off, jest bardzo trudne.
Posttranskrypcyjna modulacja mRNA jest jedną z najskuteczniejszych metod szybkiego modulowania ekspresji genu transkryptu16. Region mRNA 3' bez translacji (3' UTR) odgrywa ważną rolę w tym mechanizmie. Wykazano, że w przeciwieństwie do 5' UTR, istnieje wykładnicza korelacja między długością 3' UTR a złożonością komórkową i morfologiczną organizmu. Ta korelacja sugeruje, że 3' UTR, podobnie jak regiony kodujące mRNA, został poddany naturalnej selekcji, aby umożliwić coraz bardziej złożoną modulację potranskrypcyjną w trakcie ewolucji17. 3' UTR zawiera kilka miejsc wiązania białek i miRNA, które wpływają na stabilność i translację transkryptu.
W obecnej pracy opracowaliśmy narzędzie do badania roli wysoce konserwatywnych domen w 3' UTR GOI do kontroli stabilności transkryptu. Skupiliśmy się na nabłonkowym kanale sodowym, podjednostce alfa (αENaC), która odgrywa kluczową rolę w fizjologii nabłonka pęcherzyków płucnych18. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej zostały z powodzeniem przejściowo transfekowane dwoma składnikami systemu Tet-Off, co pozwala na badanie roli 3' UTR w stabilności mRNA za pomocą systemu, który minimalnie wpływa na fizjologię i metabolizm komórki w porównaniu ze stosowaniem inhibitorów transkrypcji z innymi protokołami. Opracowano strategię klonowania w celu odróżnienia ekspresji GOI od ekspresji genu endogennego przy użyciu epitopu o ekspresji nieendogennej (V5). Plazmidy odpowiedzi i regulatorowe zostały następnie przeniesione do komórek nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą techniki elektroporacji pipetowej. Następnie mierzono ekspresję transkryptu poprzez inkubację komórek z doksycykliną w różnych odstępach czasu. Okres półtrwania transkryptu oceniano za pomocą RT-qPCR zmodyfikowaną metodą Cq przy użyciu transfekowanego produktu mRNA tTA-Ad do normalizacji. Dzięki naszemu protokołowi oferujemy wygodny sposób badania potranskrypcyjnej modulacji transkryptu w różnych warunkach i bardziej szczegółowego definiowania udziału regionów nieulegających translacji.

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr jasnoliniowy</td><td>Sigma-Aldrich Z359629</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform - Klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Mikroskop odwrócony Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED z kontrastem fazowym</td><td></td> Leica-DNase <td></td><td></td></tr><tr><td>I, stopień wzmocnienia</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>hyklan doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (D-PBS), bez wapnia i magnezu</td><td>Bioprodukty żubrów</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol - klasa biologii molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td> Zestaw do syntezy cDNA <td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół z agarem (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Pseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, proszek</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego MSC-Advantage Class II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy Mupid-exU</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 &micro; L Zestaw</td><td>startowy Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically kompetentnyE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>wektor pcDNA3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pcDNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatynowaTaqDNA Polimeraza High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Zaawansowany wektor</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight wektor</td><td>Takara Bio 631059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone komórki nabłonka pęcherzyków płucnych</td> Zestaw do ekstrakcji żelem N.A.N.A.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie systemu PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 6 i 7 Flex Applied</td><td>Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex System do PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkowy Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko TNF-alfa</td> szczura <td>R& Amp; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet System Approved FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Odczynnik Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Woda, biologia molekularna Klasa</td><td>Bioprodukty żubra</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mrna w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Badanie regulacji potranskrypcyjnej jest fundamentalne dla zrozumienia modulacji danego informacyjnego RNA (mRNA) i jej wpływu na homeostazę i metabolizm komórek. Rzeczywiście, fluktuacje w ekspresji transkryptu mogą modyfikować wydajność translacji i ostatecznie aktywność komórkową transkryptu. Opracowano kilka podejść eksperymentalnych w celu zbadania okresu półtrwania mRNA, chociaż niektóre z tych metod mają ograniczenia, które uniemożliwiają prawidłowe badanie modulacji potranskrypcyjnej. System indukcji promotora może wyrażać interesujący nas gen pod kontrolą syntetycznego promotora regulowanego tetracykliną. Metoda ta pozwala na oszacowanie okresu półtrwania danego mRNA w dowolnych warunkach eksperymentalnych bez naruszania homeostazy komórki. Jedną z głównych wad tej metody jest konieczność transfekcji komórek, co ogranicza zastosowanie tej techniki w izolowanych komórkach pierwotnych, które są wysoce odporne na konwencjonalne techniki transfekcji. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej były szeroko wykorzystywane do badania biologii komórkowej i molekularnej nabłonka pęcherzyków płucnych. Unikalne cechy i fenotyp pierwotnych komórek pęcherzyków płucnych sprawiają, że niezbędne jest badanie potranskrypcyjnych modulacji genów będących przedmiotem zainteresowania w tych komórkach. Dlatego naszym celem było opracowanie nowego narzędzia do badania potranskrypcyjnych modulacji mRNA będących przedmiotem zainteresowania w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej. Zaprojektowaliśmy szybki i wydajny protokół transfekcji przejściowej, aby wprowadzić kontrolowany transkrypcji system ekspresji plazmidu do pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych. Ta strategia klonowania, wykorzystująca epitop wirusa do znakowania konstruktu, pozwala na łatwe odróżnienie ekspresji konstruktu od endogennych mRNA. Stosując zmodyfikowaną metodę cyklu kwantyfikacji ΔΔ (Cq), ekspresję transkryptu można następnie określić ilościowo w różnych odstępach czasu w celu zmierzenia jego półtrwania. Nasze dane pokazują skuteczność tego nowatorskiego podejścia w badaniu regulacji potranskrypcyjnej w różnych stanach patofizjologicznych w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.

Niniejszy protokół został z powodzeniem wykorzystany do stworzenia systemu ekspresji plazmidowej z kontrolą transkrypcyjną typu Tet-Off, w celu oceny znaczenia różnych fragmentów 3' UTR αENaC w modulacji stabilności transkryptu w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.
Pierwszym krokiem w implementacji tego systemu było opracowanie szybkiej, prostej i wydajnej techniki transfekcji pęcherzykowych komórek nabłonkowych...

Tutaj prezentujemy narzędzie, które może być użyte do badania potranskrypcyjnej modulacji transkryptu w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą indukowalnego systemu ekspresji sprzężonego z techniką elektroporacji pipetowej.

Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Nasz model pozwala więc na badanie potranskrypcyjnej modulacji określonego transkryptu w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej oraz ich stanów fizjologicznych i patofizjologicznych. Tak więc przejściowa transfekcja pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych ma minimalny wpływ na fizjologię i metabolizm komórki, co stanowi wyraźną przewagę nad klasycznymi protokołami wykorzystującymi inhibitory transkrypcji. W celu wytworzenia plazmidu odpowiedzi wyrażającego gen będący przedmiotem zainteresowania, sekwencja genu i wiele miejsc klonowania indukowalnego wektora muszą być analizowane w celu zidentyfikowania sekwencji rozpoznawania w wielu miejscach klonowania, które nie są obecne wewnętrznie w genie.Korzystając z polimerazy taq o wysokiej wierności i standardowych technik nakładania się PCR, należy otoczyć gen będący przedmiotem zainteresowania dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymów restrykcyjnych za pomocą starterów o zaprojektowanym kształcie. Sekwencja kodująca epitop V5 przed genem będącym przedmiotem zainteresowania musi być włączona w celu odróżnienia ekspresji transfekowanego genu od ekspresji endogennej. Mutanty mogą być generowane przez sekwencyjną delecję w celu zbadania wpływu różnych trzech pierwszych regionów nieulegających translacji na stabilność mRNA genu przy użyciu odwrotnych starterów kodujących miejsce poliadenylacji, które stopniowo usuwa trzy pierwsze końce nieulegającego translacji regionu.Ostatecznie insercja genu będącego przedmiotem zainteresowania może zostać potwierdzona przez analizę restrykcyjną. Orientację genów i brak mutacji potencjalnie wprowadzonych podczas rtPCR można potwierdzić za pomocą sekwencjonowania. W celu transfekcji pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu płuc szczura, należy zasiać komórki w ilości od jednego do 10 do szóstego komórek na centymetr kwadratowy na 100-milimetrowych szalkach Petriego w obecności kompletnej minimalnej niezbędnej pożywki.Hodowla przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki bez antybiotyku do każdej studzienki nowej 12-dołkowej płytki i podgrzej płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas tej inkubacji dodaj jeden mikrogram plazmidu odpowiedzi i jeden mikrogram wektora regulatorowego do jednej 1,5 mililitrowej probówki na studzienkę.Przemyj komórki nabłonka pęcherzyków płucnych 10 mililitrami na studzienkę PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu i potraktuj komórki pięcioma mililitrami na studzienkę 37 stopni Celsjusza 0,05% trypsyny przez dwie do czterech minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 mililitrów na studzienkę kompletnego podłoża bez antybiotyku i zbierz komórki do nowej 50-mililitrowej probówki. Umyj naczynie czterema mililitrami świeżej pożywki, aby zebrać pozostałe komórki i osadzać komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS w celu zliczenia i ponownie odwirować komórki. Zawiesić osad o gęstości cztery razy 10 do siódmej komórki na mililitr buforu do respensji i dodać cztery razy 10 do piątej komórki do każdej probówki plazmidu i wektora, delikatnie mieszając. Umieść jedną probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnij probówkę 3,5 mililitra buforu elektrolitycznego.Całkowicie wciśnij tłok, aby włożyć pozłacaną końcówkę elektrody do pipety i delikatnie wymieszaj zawartość probówki. Ostrożnie zassać komórki pipetą i włożyć pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie. Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych i naciśnij Start na ekranie dotykowym.Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do jednego dołka wstępnie podgrzanej płytki 12-dołkowej. Gdy wszystkie komórki zostaną poddane elektroporacji i platerowane, umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, zastępując supernatant w każdym dołku kompletnym podłożem z antybiotykami po dwóch dniach. Powodzenie transfekcji można potwierdzić przez ekspresję EGFP obserwowaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej z użyciem wektora kontrolnego.Aby zahamować transkrypcję genu będącego przedmiotem zainteresowania, 72 godziny po transfekcji zastąp supernatant jednym mililitrem na studzienkę kompletnej pożywki uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr świeżo przygotowanej adoksycykliny. Aby ocenić okres półtrwania mRNA interesującego genu, należy umieścić płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej od 15 minut do sześciu godzin. Mycie jednej studzienki jednym mililitrem lodowatego PBS przed lizą komórek za pomocą 500 mikrolitrów buforu do lizy z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA chloroformu fenolowego i delikatne wstrząsanie w każdym eksperymentalnym punkcie czasowym.Następnie wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami zestawu i określ wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nanometrach. Aby określić stabilność wyizolowanego RNA, najpierw potraktuj jeden mikrogram całkowitego RNA z każdej próbki DNazą wolną od RNazy, aby usunąć wszelkie ślady plazmidowego DNA. Użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy cDNA z mieszanką oligo dT i losowych starterów heksomerowych, aby poprawić wydajność odwrotnej transkrypcji w celu odwrotnej transkrypcji zubożonego całkowitego RNA DNA do cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.Dodaj 180 mikrolitrów wody klasy biologii molekularnej do 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej, aby rozcieńczyć reakcję cDNA w stężeniu pięciu nanogramów na mikrolitr i natychmiast rozcieńczyć mieszaninę cDNA świeżą wodą klasy biologii molekularnej, aby osiągnąć stężenie 1,25 nanograma na mikrolitr. Połącz pięć mikrolitrów głównej mieszanki barwników cyber green z 0,1 mikrolitra wody klasy biologii molekularnej, 0,45 mikrolitra 7,5 mikromolowego startera do przodu, 0,45 mikrolitra 7,5 mikromolowego startera odwróconego i czterech mikrolitrów 1,25 nanograma na mikrolitr cDNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 mikrolitrów. Umieścić próbki w termocyklerze qPCR i amplifikować gen znacznika V5 będący przedmiotem zainteresowania oraz amplikony postępu transaktywatora tetrocykliny przy użyciu warunków qPCR, jak wskazano, i wygenerować krzywą topnienia o wysokiej rozdzielczości w celu oceny określonych temperatur topnienia pożądanych amplikonów i zapewnienia braku pików amplikonu hałasu.Ta technika elektroporacji pipet umożliwia osiągnięcie od 25 do 30% skuteczności transfekcji, co obserwuje się na podstawie proporcji komórek EGFP wykrytych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Traktowanie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny nie ma znaczącego wpływu na ekspresję endogennego mRNA alfa ENaC w żadnym momencie okresu leczenia. Korzystając z systemu ekspresji plazmidu kontrolowanego transkrypcji, jak pokazano, sygnał V5 alfa ENaC można znormalizować zgodnie z zaawansowanym sygnałem transaktywatora tetracykliny w celu określenia skuteczności transfekcji przy użyciu metody cyklu podwójnej deltyfikacji.Okres półtrwania mRNA alfa ENaC jest do siedmiu razy krótszy w obecności układu wyłączającego tetracyklinę niż w obecności aktynomycyny D, co potwierdza, że aktynomycyna D prowadzi do sztucznej stabilizacji mRNA alfa ENaC. Ponadto leczenie cykloheksamidem i czynnikiem martwicy nowotworu alfa znacznie zmniejszyło stabilność transkryptu, podczas gdy lipopolisacharydy nie. Znaczące zmiany w modulacji stabilności mRNA V5 alfa ENaC mogą być indukowane w zależności od usuniętych i zawartych regionów trzech głównych regionów nieulegających translacji.Ponadto nadekspresja specyficznych białek wiążących RNA zmniejsza stabilność mRNA 5-alfa ENaC w porównaniu z transfekcją z pustym plazmidem pcDNA three. Narzędzie to będzie przydatne do badania nowych spostrzeżeń na temat potranskrypcyjnej regulacji kluczowych genów zaangażowanych w funkcję nabłonka pęcherzyków płucnych i ich stanów fizjologicznych lub patologicznych.

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Ten film opisuje metodę regulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach poprzez transfekcję plazmidem zawierającym interesujący nas gen i plazmid regulatorowy. Ekspresja tego plazmidu może być kontrolowana przez tetracyklinę lub jej syntetyczne analogi, co czyni ten system użytecznym modelem do badania regulowanej ekspresji genów.

Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off

Transgeniczne myszy lub wektory wirusowe zostały użyte do zwiększenia ekspresji białka w płucach. Jednak techniki te są czasochłonne, trudne technicznie i mają niezamierzone skutki, które mogą zakłócić wyniki. Nasz protokół transfekcji białek wykorzystuje odczynnik do transfekcji na bazie lipidów i ultradrobny mikrorozpylacz, aby równomiernie dostarczyć aktywne białko do komórek płuc.

Transfekcja białek płuc myszy

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są trudne do transdukcji. Protokół ten opisuje produkcję lentiwirusów i ich koncentrację, a także optymalne warunki hodowli niezbędne do osiągnięcia wysoce wydajnych transdukcji w tych komórkach poprzez różnicowanie do pseudostratyfikowanego nabłonka.

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

Poznaj metodę ekspresji plazmidu sterowaną transkrypcją do badania stabilności mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych. Technika elektroporacji pipetowej minimalizuje zakłócenia fizjologii komórek.

Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych (Wideo) | JoVE Journal

Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

Przeglądaj więcej filmów