Name: Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów mysich za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro. Ta metoda umożliwia ekspresję białek bez cytotoksyczności i immunogenności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

<ol><li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li>
<li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages%3A+obstacles+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biolology%22%5BJournal%5D)">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li>
<li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li>
<li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li>
<li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li>
<li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li>
<li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li>
<li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEMO%2FIKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li>
<li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+Assembly%2C+Production%2C+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół wysoce wydajnej transfekcji zwykle trudnych do transfekcji pierwotnych makrofagów za pomocą transkrybowanego mRNA in vitro. Co ważne, transfekcja makrofagów przy użyciu tego protokołu nie indukuje śmierci komórki ani nie aktywuje sygnalizacji prozapalnej, co wskazuje, że ani odczynnik do transfekcji, ani transfekowane mRNA nie są rozpoznawane jako niewłasne.
Jakość mRNA ma kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji makrofagów przy użyciu tego protokołu. Dlat...

Makrofagi to komórki fagocytarne, które specjalizują się w wykrywaniu, spożywaniu i degradacji mikrobów, komórek apoptotycznych i resztek komórkowych. Ponadto pomagają koordynować odpowiedzi immunologiczne poprzez wydzielanie cytokin i chemokin oraz prezentowanie antygenów limfocytom T i limfocytom B. Makrofagi odgrywają również ważną rolę w wielu innych procesach, takich jak gojenie się ran, miażdżyca, nowotworzenie i otyłość.
Aby móc wykrywać cząsteczki niebędące własnymi, takie jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) i cząsteczki nie na miejscu, takie jak wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), makrofagi są wyposażone w duży zestaw receptorów rozpoznawania wzorców (PRR)1. Niestety, sprawia to również, że makrofagi są szczególnie trudne do transfekcji2 jako odczynnik transfekcji3 i transfekowane kwasy nukleinowe4,5,6,7 często są rozpoznawane przez PRR jako nie-self. Z tego powodu transfekcja makrofagów przy użyciu metod chemicznych lub fizycznych8 zwykle powoduje aktywację i degradację transfekowanych kwasów nukleinowych makrofagów, a nawet samobójstwo makrofagów poprzez piroptozę, formę programowanej śmierci litycznej komórki wywoływanej po rozpoznaniu cytozolowych PAMP/DAMPs, takich jak DNA lub obce RNA9. Biologiczna transfekcja makrofagów przy użyciu wirusów, takich jak adenowirusy lub lentiwirusy jako wektory, jest często bardziej wydajna, jednak budowa takich wektorów wirusowych jest czasochłonna i wymaga sprzętu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 210,11.
Tak więc, mimo że makrofagi są przedmiotem intensywnych badań, analiza ich funkcji na poziomie molekularnym jest utrudniona, ponieważ jedno z najważniejszych narzędzi biologii molekularnej, transfekcja konstruktów kwasów nukleinowych do egzogennej ekspresji białek, jest prawie niemożliwa do zastosowania. To często zmusza badaczy do używania linii komórkowych podobnych do makrofagów, a nie makrofagów w dobrej wierze. Zastosowania transfekcji konstruktu kwasu nukleinowego obejmują ekspresję zmutowanych lub znakowanych wersji białek, nadekspresję określonego białka, reekspresję białka na odpowiednim tle nokautu oraz ekspresję białek z innych gatunków (np. Rekombinaza Cre lub przewodnik RNA i Cas9 do docelowego nokautu genu).
Tutaj opisujemy protokół, który pozwala na wysoce efektywną transfekcję (zwykle trudnych do transfekcji) pierwotnych makrofagów, czyli mysich makrofagów otrzewnowych (PM) i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) z mRNA generowanym z matryc DNA, takich jak plazmidy. Co ważne, transkrybowane in vitro mRNA wygenerowane przy użyciu tego protokołu zawiera naturalnie występujące zmodyfikowane nukleozydy 5-metylo-CTP i pseudo-UTP, które zmniejszają immunogenność i zwiększają stabilność4,6,7,12,13. Co więcej, końce 5' mRNA transkrybowanego in vitro są defosforylowane przez fosfatazę antarktyczną, aby zapobiec rozpoznaniu przez kompleks RIG-I14,15. Minimalizuje to wrodzone rozpoznawanie immunologiczne mRNA transkrybowanego in vitro. Dzięki naszemu łatwemu do wykonania protokołowi osiągane są wskaźniki transfekcji między 50-65% (makrofagi otrzewnowe (PM)) i 85% (BMDM), przy czym, co ważne, nie obserwuje się cytotoksyczności ani immunogenności. Opisujemy szczegółowo (i) w jaki sposób immunologicznie wyciszone mRNA do transfekcji może być generowane z konstruktów DNA, takich jak plazmidy, oraz (ii) samą procedurę transfekcji.

<table><tbody><tr><td>5-metylo-CTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1138S</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fosfataza antarktyczna</td><td>New England BioLabs</td><td>M0289</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny fosfatazy antarktycznej (10x)</td><td>New England BioLabs</td><td>B0289</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-NEMO/IKK&gamma</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41046</td><td>przechowywane w temperaturze -20 & stopni; Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-&beta-aktynowe</td><td>C Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td>przechowywane w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>szalki Petriego 92,16 mm z krzywkami</td><td>Sarstedt</td><td>821,473</td><td>przechowywane w RT</td></tr><tr><td>CD11b Mikrogranulki mysz i człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td>przechowywane w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Rekombinaza Cre + T7-Promotor starter do przodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&acute;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinaza Cre + T7-Promotor odwrócony starter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&prime;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; </td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA C: Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>przechowywany w RT</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-GAAATTAATACGACTACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&acute;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>eGFP + T7-Promotor podkład odwrócony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&acute;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&acute;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Bufor Fast Digest (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B64</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Polimeraza o wysokiej wierności z korektą: Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0491S</td><td>przechowywana w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor starter do przodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&prime;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>IKK&beta; + T7-Promotor starter odwrócony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5&prime;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&prime;, przechowywany w temperaturze -20 &deg; </td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji mRNA C in vitro: zestaw mRNA HiScribe T7 ARCA (z ogonem poliA)</td><td>New England BioLabs</td><td>E2060</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>przechowywane w RT</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>przechowywane w RT</td></tr><tr><td>bufor transfekcji mRNA i odczynnik: jetMESSENGER</td><td>Polyplus transfekcja</td><td>409-0001DE</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Mutant IKK&beta; Plazmid IKK-2S177/181E</td><td>Addgene</td><td>11105</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zmutowany plazmid NEMOC54/347A</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>plazmid pEGFP-N3</td><td>Addgene</td><td>62043</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>poly(I:C)</td><td>Calbiochem</td><td>528906</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; Plazmid</td></tr><tr><td></td><td></td> C<td>pPGK-Cre</td><td>F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nowe warianty indukowalnej rekombinazy Cre: nowy mutant białka fuzyjnego Cre-PR wykazuje zwiększoną czułość i rozszerzony zakres indukowalności. Kwasy nukleinowe Res. 29, 47e (2001). przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>pseudo-UTP (100 mM)</td><td>Jena Biosience</td><td>NU-1139S</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-myszy CD11b, BioLegend sprzężony z APC</td><td></td><td>101212</td><td>przechowywany w temperaturze 4 &; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom F4/80, sprzężone z PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; </td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania C RNA: Zestaw do czyszczenia transkrypcji MEGAclear</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Środek powierzchniowo czynny rozkładający RNAzy: RnaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td>przechowywany w RT</td></tr><tr><td>Ultrapure LPS z E.coli O111:B4</td><td>Invivogen</td><td></td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dziki typ IKK&beta; plazmid</td><td>Addgene</td><td>11103</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Plazmid NEMO typu dzikiego</td><td>Addgene</td><td>27268</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & deg; Z</td></tr></tbody></table>

wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mrna transkrybowanego in vitro

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrofagi to komórki fagocytarne wyspecjalizowane w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. W tym celu są one wyposażone w szeroką gamę receptorów rozpoznawania wzorców (PRR). Niestety, sprawia to również, że makrofagi są szczególnie trudne do transfekcji, ponieważ odczynnik do transfekcji i transfekowane kwasy nukleinowe są często rozpoznawane przez PRR jako niewłasne. Dlatego transfekcja często powoduje aktywację makrofagów i degradację transfekowanych kwasów nukleinowych, a nawet samobójstwo makrofagów. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję mysich pierwotnych makrofagów, takich jak makrofagi otrzewnowe (PM) i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) za pomocą mRNA in vitro transkrybowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy. Dzięki temu prostemu protokołowi wskaźniki transfekcji wynoszą około 50-65% dla PM i około 85% dla BMDM bez obserwowania cytotoksyczności lub immunogenności. Szczegółowo opisujemy wytwarzanie mRNA do transfekcji z konstruktów DNA, takich jak plazmidy i procedura transfekcji.

Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do generowania mRNA kodującego warianty NEMO i IKKβ z tagiem FLAG w celu transfekcji pierwotnych makrofagów16. Plasmidy kodujące dziki typ NEMO z tagiem FLAG (NEMOWT) oraz mutant NEMO C54/347A z tagiem FLAG (NEMOC54/374A) (patrz Tabela materiałów) zawierają już promotor T7 w odpowiedniej orientacji (Rycina 1A). W związku z tym należało jed...

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Dzwonek elektroniczny Ponieważ makrofagi specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia innego niż własne, są one szczególnie trudne do transfekcji. Opisujemy protokół, który pozwala na wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy. Główną zaletą naszej metody jest to, że wysokie wskaźniki transfekcji są osiągane przy braku wykrywalnej cytotoksyczności lub immunogenności.Procedurę zademonstruje Marc Herb, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od rozmrożenia wszystkich składników zestawu do transkrypcji RNA. Wiruj odczynniki przez pięć sekund i obracaj je przez dwie sekundy w temperaturze 2 000 razy g, a następnie trzymaj je na lodzie do momentu użycia.Przygotować reakcję transkrypcji RNA in vitro w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 mikrolitra zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Obracaj rurkę i obracaj ją w dół. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, mieszając z prędkością 400 obr./min na mieszalniku termicznym.Po inkubacji dodać dwa mikrolitry DNazy I bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej. Zwiruj i odkręć rurkę w dół i inkubuj ją w mieszalniku termicznym przez kolejne 15 minut. Zarezerwuj dwumikrolitrową porcję produktu poddanego działaniu Dnazy na żel kontrolny i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W przypadku ogonowania poliA dodaj pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego polimerazy poliA i pięć mikrolitrów polimerazy poliA do reakcji poddanej działaniu Dnazy. Wiruj i odkręć mieszankę. Następnie inkubuj go w mieszalniku termicznym przez 30 minut.Po zakończeniu reakcji należy pobrać dwumikrolitrową porcję żelu kontrolnego i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj odczynniki defosforylacji 5-prime bezpośrednio do produktu z ogonkami poliA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Odwiruj i odwiruj rurkę i inkubuj ją w mieszalniku termicznym przez kolejne 30 minut.Postępuj zgodnie z reakcją defosforylacji z dwuminutową inkubacją w temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu podgrzania dezaktywacji fosfatazy antarktycznej. Następnie oczyść transkrybowane mRNA in vitro za pomocą dedykowanego zestawu do oczyszczania RNA. Zmierzyć stężenie i czystość wymytego mRNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.Uruchom denaturujący żel agarozowy z wcześniej zebranymi podwielokrotnościami, aby zweryfikować obecność pojedynczego produktu, prawidłową długość transkryptu i ogonowanie poliA. Przygotuj się do transfekcji, dodając wstępnie obliczoną objętość buforu do transfekcji mRNA pomniejszoną o objętości odczynnika do transfekcji mRNA i mRNA do probówki reakcyjnej. Rozmrozić zapas mRNA i delikatnie go wymieszać, obracając probówkę.Następnie dodaj wstępnie obliczoną objętość mRNA do probówki reakcyjnej. Odwirować i odwirować mieszaninę reakcyjną i odczynnik do transfekcji mRNA, a następnie dodać odpowiednią objętość odczynnika do transfekcji mRNA do probówki z mieszanką reakcyjną. Obracaj rurkę i obracaj ją w dół.Następnie inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W międzyczasie zastąp pożywkę hodowlaną makrofagów świeżą, ciepłą pożywką hodowlaną. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny transfekcyjnej dodać mieszaninę do studzienek płytkowych zawierających makrofagi kroplami i po okręgu od zewnątrz do środka studzienki.Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie transfekcji, delikatnie wymieszaj płytkę, kołysz płytką w kierunku pionowym i poziomym. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej sześć godzin. Po inkubacji przeanalizuj wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub immunoblot.Najważniejszą częścią tej procedury jest zapewnienie równomiernego rozprowadzenia mieszanki transfekcyjnej, tak aby wszystkie makrofagi miały kontakt z tą samą ilością mRNA. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania mRNA kodujących warianty NEMO i IKK-beta znakowane FLAG do transfekcji pierwotnych makrofagów. Prawidłową wielkość i ogonowanie poliA mRNA zweryfikowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.Skuteczność transfekcji potwierdzono poprzez wygenerowanie mRNA kodującego GFP oraz wykonanie analizy cytometrii przepływowej. Szybkość transfekcji wzrastała wraz z ilością transfekowanego mRNA, osiągając 50 do 65% dla PM i 80 do 85% dla BMDM. Zarówno w PM, jak i BMDM poziom ekspresji EGFP w transfekowanych komórkach wzrastał w sposób zależny od czasu i dawki.Co ważne, analiza makrofagów dodatnich pod względem jodku propidyny lub aneksyny V-dodatniej potwierdziła, że procedura transfekcji nie indukowała śmierci komórek litycznych ani apoptotycznych. Skuteczność transfekcji mRNA kodujących warianty Nemo lub IKK-beta znakowane FLAG analizowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wskaźniki wynosiły około 60% dla mRNA Nemo i 55% dla mRNA IKK-beta.Protokół ten został również wykorzystany do wygenerowania mRNA kodującego rekombinazę Cre. Transfekcja 400 000 BMDM z 400 nanogramami mRNA rekombinazy Cre spowodowała prawie całkowite wyczerpanie białka Nemo po 48 godzinach, co wskazuje na wysoce wydajną transfekcję. Brak jakichkolwiek wykrywalnych ilości interleukiny 1 beta, interleukiny-6 i czynnika martwicy nowotworu wskazuje, że procedura transfekcji nie aktywuje sygnalizacji prozapalnej.Nasza stosunkowo prosta metoda pozwala wreszcie na efektywną ekspresję zmutowanych lub znakowanych białek w pierwotnych makrofagach. To znacznie posunęłoby naprzód analizę funkcji makrofagów na poziomie molekularnym.

highly-efficient-transfection-primary-macrophages-with-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Ten film pokazuje proces transfekcji pierwotnych makrofagów zmodyfikowanym mRNA kodującym zielone białko fluorescencyjne. Te zmodyfikowane mRNA, zaprojektowane w celu zmniejszenia immunogenności i poprawy jej stabilności, zapewniają udaną transfekcję, a następnie ekspresję białek zielonej fluorescencji, co potwierdza mikroskopia fluorescencyjna.

Transfekcja pierwszorzędowych makrofagów zmodyfikowanym mRNA

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Transfekcja do linii komórkowej makrofagów, RAW264.7, jest trudna ze względu na naturalną reakcję komórki na obce materiały. Opisaliśmy tutaj delikatną, ale solidną procedurę transfekcji genów reporterowych lucyferazy do komórek RAW264.7.

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Poznaj wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów mysich za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro. Ta metoda umożliwia ekspresję białek bez cytotoksyczności i immunogenności.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Przeglądaj więcej filmów