Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Dzwonek elektroniczny Ponieważ makrofagi specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia innego niż własne, są one szczególnie trudne do transfekcji. Opisujemy protokół, który pozwala na wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy. Główną zaletą naszej metody jest to, że wysokie wskaźniki transfekcji są osiągane przy braku wykrywalnej cytotoksyczności lub immunogenności.

Procedurę zademonstruje Marc Herb, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od rozmrożenia wszystkich składników zestawu do transkrypcji RNA. Wiruj odczynniki przez pięć sekund i obracaj je przez dwie sekundy w temperaturze 2 000 razy g, a następnie trzymaj je na lodzie do momentu użycia.

Przygotować reakcję transkrypcji RNA in vitro w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 mikrolitra zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Obracaj rurkę i obracaj ją w dół. Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, mieszając z prędkością 400 obr./min na mieszalniku termicznym.

Po inkubacji dodać dwa mikrolitry DNazy I bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej. Zwiruj i odkręć rurkę w dół i inkubuj ją w mieszalniku termicznym przez kolejne 15 minut. Zarezerwuj dwumikrolitrową porcję produktu poddanego działaniu Dnazy na żel kontrolny i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W przypadku ogonowania poliA dodaj pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego polimerazy poliA i pięć mikrolitrów polimerazy poliA do reakcji poddanej działaniu Dnazy. Wiruj i odkręć mieszankę. Następnie inkubuj go w mieszalniku termicznym przez 30 minut.

Po zakończeniu reakcji należy pobrać dwumikrolitrową porcję żelu kontrolnego i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj odczynniki defosforylacji 5-prime bezpośrednio do produktu z ogonkami poliA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Odwiruj i odwiruj rurkę i inkubuj ją w mieszalniku termicznym przez kolejne 30 minut.

Postępuj zgodnie z reakcją defosforylacji z dwuminutową inkubacją w temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu podgrzania dezaktywacji fosfatazy antarktycznej. Następnie oczyść transkrybowane mRNA in vitro za pomocą dedykowanego zestawu do oczyszczania RNA. Zmierzyć stężenie i czystość wymytego mRNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.

Uruchom denaturujący żel agarozowy z wcześniej zebranymi podwielokrotnościami, aby zweryfikować obecność pojedynczego produktu, prawidłową długość transkryptu i ogonowanie poliA. Przygotuj się do transfekcji, dodając wstępnie obliczoną objętość buforu do transfekcji mRNA pomniejszoną o objętości odczynnika do transfekcji mRNA i mRNA do probówki reakcyjnej. Rozmrozić zapas mRNA i delikatnie go wymieszać, obracając probówkę.

Następnie dodaj wstępnie obliczoną objętość mRNA do probówki reakcyjnej. Odwirować i odwirować mieszaninę reakcyjną i odczynnik do transfekcji mRNA, a następnie dodać odpowiednią objętość odczynnika do transfekcji mRNA do probówki z mieszanką reakcyjną. Obracaj rurkę i obracaj ją w dół.

Następnie inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W międzyczasie zastąp pożywkę hodowlaną makrofagów świeżą, ciepłą pożywką hodowlaną. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny transfekcyjnej dodać mieszaninę do studzienek płytkowych zawierających makrofagi kroplami i po okręgu od zewnątrz do środka studzienki.

Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie transfekcji, delikatnie wymieszaj płytkę, kołysz płytką w kierunku pionowym i poziomym. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej sześć godzin. Po inkubacji przeanalizuj wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub immunoblot.

Najważniejszą częścią tej procedury jest zapewnienie równomiernego rozprowadzenia mieszanki transfekcyjnej, tak aby wszystkie makrofagi miały kontakt z tą samą ilością mRNA. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania mRNA kodujących warianty NEMO i IKK-beta znakowane FLAG do transfekcji pierwotnych makrofagów. Prawidłową wielkość i ogonowanie poliA mRNA zweryfikowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Skuteczność transfekcji potwierdzono poprzez wygenerowanie mRNA kodującego GFP oraz wykonanie analizy cytometrii przepływowej. Szybkość transfekcji wzrastała wraz z ilością transfekowanego mRNA, osiągając 50 do 65% dla PM i 80 do 85% dla BMDM. Zarówno w PM, jak i BMDM poziom ekspresji EGFP w transfekowanych komórkach wzrastał w sposób zależny od czasu i dawki.

Co ważne, analiza makrofagów dodatnich pod względem jodku propidyny lub aneksyny V-dodatniej potwierdziła, że procedura transfekcji nie indukowała śmierci komórek litycznych ani apoptotycznych. Skuteczność transfekcji mRNA kodujących warianty Nemo lub IKK-beta znakowane FLAG analizowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wskaźniki wynosiły około 60% dla mRNA Nemo i 55% dla mRNA IKK-beta.

Protokół ten został również wykorzystany do wygenerowania mRNA kodującego rekombinazę Cre. Transfekcja 400 000 BMDM z 400 nanogramami mRNA rekombinazy Cre spowodowała prawie całkowite wyczerpanie białka Nemo po 48 godzinach, co wskazuje na wysoce wydajną transfekcję. Brak jakichkolwiek wykrywalnych ilości interleukiny 1 beta, interleukiny-6 i czynnika martwicy nowotworu wskazuje, że procedura transfekcji nie aktywuje sygnalizacji prozapalnej.

Nasza stosunkowo prosta metoda pozwala wreszcie na efektywną ekspresję zmutowanych lub znakowanych białek w pierwotnych makrofagach. To znacznie posunęłoby naprzód analizę funkcji makrofagów na poziomie molekularnym.