Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji
February 21st, 2020
Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.
Protokół ten umożliwia rejestrację pełnej zależności funkcjonalnej odpowiedzi stężenia agonisty GPCR z jednej populacji komórek i zapewnia szczegółową charakterystykę agonisty nawet w przypadku małej liczby próbek komórek. Główną zaletą dozowania seryjnego jest zwiększenie przepustowości, ponieważ do pełnej analizy stężenie-odpowiedź wystarczy pojedynczy studzienka. Technika ta doskonale nadaje się do badania pojedynczej transdukcji w rzadkich i złożonych modelach biologicznych, takich jak formaty narządów na chipie w zamkniętych pojemnikach mikroprzepływowych.
Protokół nie jest trudny do wykonania, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni sprzęt. Przygotowanie różnych roztworów ligandów GPCR o odpowiednim stężeniu jest kluczem do sukcesu. Michael Skiba, doktorant, i Anne Mildner, studentka studiów licencjackich z naszego laboratorium zademonstrują procedurę.
W celu wysiewu komórek na matryce elektrod, dodaj odpowiednie stężenie komórek do studzienek każdej matrycy elektrod i pozwól komórkom osiąść jednorodnie na dnie studzienek przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Po co najmniej 36 godzinach w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, należy sprawdzić warstwy komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby zapewnić pełne pokrycie każdej elektrody komórkami. Następnie zastąp pożywkę do hodowli komórkowych w każdym dołku odpowiednią objętością wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy.
Aby rozpocząć zapis impedancji, umieść matrycę elektrod w uchwycie matrycy połączeniowej analizatora impedancji i potwierdź prawidłowy kontakt o niskiej impedancji między elektrodami a analizatorem impedancji. Wybierz typ elektrody i/lub format wielodołkowy w interfejsie użytkownika oprogramowania. Jeśli dostępne są tryby akwizycji danych o jednej i wielu częstotliwościach, a liczba odwiertów do analizy jest niska lub rozdzielczość czasowa nie jest krytyczna, wybierz nagrania z wieloma częstotliwościami.
Aby zapewnić maksymalną rozdzielczość czasową, wybierz pojedynczą częstotliwość monitorowania. Następnie rozpocznij pobieranie danych przebiegu czasu i wybierz folder danych, w którym chcesz zapisać dane. Odczyty impedancji będą rejestrowane z określoną liczbą częstotliwości dla każdej studzienki Aby zainicjować protokół dodawania szeregowego w trybie agonistycznym dla ośmiodołkowej matrycy, dodaj 30 mikrolitrów najniższego stężenia agonisty interesującego komórki.
Następnie pozwól komórkom zareagować i zrównoważyć się przez określony okres czasu przed dodaniem 30 mikrolitrów następnego najwyższego stężenia, aż do dodania każdego szeregowego rozcieńczenia agonisty. Aby przeanalizować dane, odejmij impedancję ostatniego punktu danych przed pierwszym dodaniem roztworu agonisty i ustaw czas dodawania na zero, aby znormalizować wartości impedancji. Wykreśl przebieg czasowy znormalizowanej impedancji i wykreśl poszczególne przebiegi czasu, aby określić maksima impedancji po każdym kroku dodawania.
Skomponuj arkusz danych z tymi wartościami i wykreśl wartości maksymalnej zmiany impedancji w funkcji stężenia agonisty. Następnie należy zastosować procedurę dopasowywania danych, aby określić połowę maksymalnych stężeń efektywnych i maksymalną odpowiedź przy użyciu czteroparametrowego modelu logistycznego. W tym reprezentatywnym eksperymencie 10 roztworów o rosnącym stężeniu histaminy dodawano sekwencyjnie do komórek co 15 minut, a zmianę impedancji mierzono w każdym punkcie czasowym.
Zmiany impedancji można następnie wykreślić jako funkcję stężenia histaminy i funkcji przenoszenia czteroparametrowego modelu logistycznego dopasowanego do eksperymentalnych punktów danych z siedmiu odwiertów. Aby uwzględnić możliwą regulację w dół receptora histaminowego, odczulanie komórek lub nadmierną stymulację, zakres danych do analizy można zmniejszyć, jak pokazano w tym pojedynczym eksperymencie z dawkowaniem seryjnym. Do danych można następnie zastosować optymalizację trzyparametrową, zapewniając dla tej analizy połowę maksymalnego stężenia efektywnego wynoszącego 0,75 plus minus 0,12 mikromola.
Dodanie antagonisty receptora histaminowego difenhydraminy na 20 minut przed pierwszą histaminą powoduje opóźniony wzrost impedancji w schemacie dawkowania seryjnego, co odpowiada potrzebie wyższego agonisty w celu wywołania odpowiedzi komórki. W zależności dawka-odpowiedź działanie antagonisty jest wyrażone jako przesunięcie krzywych w prawo, odpowiadające wzrostowi skutecznego stężenia o połowę maksymalnego, pod warunkiem, że antagonista jest ligandem konkurencyjnym w stosunku do agonisty. Skuteczne zastosowanie schematu dozowania seryjnego jest technicznie łatwe, ale wymaga przemyślanego planowania, ponieważ trudno jest wykonać wszystkie kroki w odpowiednim czasie.
Dozowanie seryjne utorowało drogę do przeprowadzania badań stężenie-odpowiedź za pomocą innych systemów odczytu, które są ograniczone pod względem liczby próbek monitorowanych równolegle. Szczególne zalety dawkowania seryjnego pozwalają na badanie transdukcji sygnału za pośrednictwem receptora z zupełnie nowymi odczytami, które są wrażliwe na inne zmiany fenotypowe, takie jak cytomechanika. Podczas przygotowywania roztworów podstawowych agonisty receptora należy nosić rękawice i okulary ochronne, ponieważ mogą one być niebezpieczne w przypadku wdychania lub połknięcia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia rejestrację pełnej zależności koncentracji odpowiedzi funkcjonalnej agonisty GPCR z jednej populacji komórek z wykorzystaniem bezbarwnych pomiarów impedancji. Główną zaletą dozowania seryjnego jest zwiększenie przepustowości, ponieważ do pełnej analizy zależności stężeniowej wystarcza pojedyncza komórka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Farmakologia
- Biologia komórkowa
Wprowadzenie
- GPCR pełnią kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie aktywacji indukowanej przez agonisty jest niezbędne dla rozwoju leków.
- Tradycyjne metody mogą wymagać większych próbek komórek.
- Ten protokół jest odpowiedni dla rzadkich i złożonych modeli biologicznych.
Cel badania
- Demonstracja rejestracji aktywacji GPCR w czasie rzeczywistym.
- Dostarczenie szczegółowej charakterystyki agonisty.
- Zwiększenie przepustowości w analizie zależności stężeniowej.
Wykorzystane metody
- Bezbarwne pomiary impedancji.
- Dozowanie seryjne ligandów GPCR.
- Pojedynczy układ mikroelektrodowy.
- Przygotowanie roztworów ligandów w odpowiednich stężeniach.
Główne wyniki
- Pomyślne rejestrowanie pełnych zależności dawka-odpowiedź.
- Zwiększona przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.
- Wykazano wykonalność przy niskich liczbach próbek komórek.
- Możliwość zastosowania w formatach organ-on-chip w pojemnikach mikroprzepływowych.
Wnioski
- Ten protokół wzmacnia badanie GPCR w złożonych modelach.
- Dostarcza niezawodnej metody do charakterystyki agonisty.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne obszary badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Label-free impedance-based GPCR assays face throughput limitations in dose-response studies due to electrode array costs and sequential well recording constraints. The serial agonist addition protocol enables full concentration response curves from a single cell layer, significantly increasing assay output while maintaining real-time monitoring. This approach supports predictive confidence in target validation by reducing biological sample requirements and enhancing data efficiency in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through full dose-response characterization from minimal cell samples.
- Operational Value: Reduces reagent and electrode array consumption by consolidating multi-point assays into single-well formats.
- Predictive Confidence: Supports lead identification by providing quantitative EC50 and efficacy measurements from serial agonist additions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, time-resolved impedance readouts for agonist and antagonist mode profiling.
- Operational Value: Compatible with automated liquid handling for serial dilution preparation in microtiter plate formats.
- Assay Standardization: Enables consistent baseline normalization and maxima detection across sequential dosing steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to recombinant and endogenous GPCR expression levels in physiologically relevant models.
- Translational Biomarker: Supports mechanistic de-risking by correlating impedance changes with receptor activation states.
- Preclinical Model Continuity: Facilitates screening readiness in organ-on-chip and microfluidic systems with limited sample availability.
Pipeline & Workflow Integration
The serial dosing method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, particularly where sample conservation and assay throughput are critical.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via real-time monitoring of GPCR activation kinetics.
- Screening: Enables high-content agonist profiling with reduced well consumption, improving plate utilization efficiency.
- Analytics: Provides quantitative impedance maxima as dependent variables for four-parameter logistic modeling of dose-response relationships.
- Translational Research: Connects to preclinical advancement by generating reliable agonist potency data from low-cell-number systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable impedance-based platform for serial ligand addition across multiple GPCR targets and coupling types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through comprehensive agonist characterization from single populations.
- Operational Value: Enhances throughput and cost-efficiency by minimizing disposable electrode array usage per dose-response curve.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid SAR exploration with limited biological material.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reproducible EC50 determination in early-stage screening campaigns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in preparing precise serial dilutions of GPCR ligands at working concentrations.
- Dependent on impedance analyzer compatibility with single-well temporal recording and baseline subtraction capabilities.
- Necessitates standardized timing intervals between agonist additions to ensure equilibration and response stability.
- Involves optimization of addition volume and frequency to prevent fluidic disturbance or receptor overstimulation.
- Includes considerations for antagonist pre-incubation protocols to assess competitive binding and rightward shift in dose-response curves.
