Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji
21 lutego 2020
Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.
Protokół ten umożliwia rejestrację pełnej zależności funkcjonalnej odpowiedzi stężenia agonisty GPCR z jednej populacji komórek i zapewnia szczegółową charakterystykę agonisty nawet w przypadku małej liczby próbek komórek. Główną zaletą dozowania seryjnego jest zwiększenie przepustowości, ponieważ do pełnej analizy stężenie-odpowiedź wystarczy pojedynczy studzienka. Technika ta doskonale nadaje się do badania pojedynczej transdukcji w rzadkich i złożonych modelach biologicznych, takich jak formaty narządów na chipie w zamkniętych pojemnikach mikroprzepływowych.
Protokół nie jest trudny do wykonania, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni sprzęt. Przygotowanie różnych roztworów ligandów GPCR o odpowiednim stężeniu jest kluczem do sukcesu. Michael Skiba, doktorant, i Anne Mildner, studentka studiów licencjackich z naszego laboratorium zademonstrują procedurę.
W celu wysiewu komórek na matryce elektrod, dodaj odpowiednie stężenie komórek do studzienek każdej matrycy elektrod i pozwól komórkom osiąść jednorodnie na dnie studzienek przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Po co najmniej 36 godzinach w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, należy sprawdzić warstwy komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby zapewnić pełne pokrycie każdej elektrody komórkami. Następnie zastąp pożywkę do hodowli komórkowych w każdym dołku odpowiednią objętością wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy.
Aby rozpocząć zapis impedancji, umieść matrycę elektrod w uchwycie matrycy połączeniowej analizatora impedancji i potwierdź prawidłowy kontakt o niskiej impedancji między elektrodami a analizatorem impedancji. Wybierz typ elektrody i/lub format wielodołkowy w interfejsie użytkownika oprogramowania. Jeśli dostępne są tryby akwizycji danych o jednej i wielu częstotliwościach, a liczba odwiertów do analizy jest niska lub rozdzielczość czasowa nie jest krytyczna, wybierz nagrania z wieloma częstotliwościami.
Aby zapewnić maksymalną rozdzielczość czasową, wybierz pojedynczą częstotliwość monitorowania. Następnie rozpocznij pobieranie danych przebiegu czasu i wybierz folder danych, w którym chcesz zapisać dane. Odczyty impedancji będą rejestrowane z określoną liczbą częstotliwości dla każdej studzienki Aby zainicjować protokół dodawania szeregowego w trybie agonistycznym dla ośmiodołkowej matrycy, dodaj 30 mikrolitrów najniższego stężenia agonisty interesującego komórki.
Następnie pozwól komórkom zareagować i zrównoważyć się przez określony okres czasu przed dodaniem 30 mikrolitrów następnego najwyższego stężenia, aż do dodania każdego szeregowego rozcieńczenia agonisty. Aby przeanalizować dane, odejmij impedancję ostatniego punktu danych przed pierwszym dodaniem roztworu agonisty i ustaw czas dodawania na zero, aby znormalizować wartości impedancji. Wykreśl przebieg czasowy znormalizowanej impedancji i wykreśl poszczególne przebiegi czasu, aby określić maksima impedancji po każdym kroku dodawania.
Skomponuj arkusz danych z tymi wartościami i wykreśl wartości maksymalnej zmiany impedancji w funkcji stężenia agonisty. Następnie należy zastosować procedurę dopasowywania danych, aby określić połowę maksymalnych stężeń efektywnych i maksymalną odpowiedź przy użyciu czteroparametrowego modelu logistycznego. W tym reprezentatywnym eksperymencie 10 roztworów o rosnącym stężeniu histaminy dodawano sekwencyjnie do komórek co 15 minut, a zmianę impedancji mierzono w każdym punkcie czasowym.
Zmiany impedancji można następnie wykreślić jako funkcję stężenia histaminy i funkcji przenoszenia czteroparametrowego modelu logistycznego dopasowanego do eksperymentalnych punktów danych z siedmiu odwiertów. Aby uwzględnić możliwą regulację w dół receptora histaminowego, odczulanie komórek lub nadmierną stymulację, zakres danych do analizy można zmniejszyć, jak pokazano w tym pojedynczym eksperymencie z dawkowaniem seryjnym. Do danych można następnie zastosować optymalizację trzyparametrową, zapewniając dla tej analizy połowę maksymalnego stężenia efektywnego wynoszącego 0,75 plus minus 0,12 mikromola.
Dodanie antagonisty receptora histaminowego difenhydraminy na 20 minut przed pierwszą histaminą powoduje opóźniony wzrost impedancji w schemacie dawkowania seryjnego, co odpowiada potrzebie wyższego agonisty w celu wywołania odpowiedzi komórki. W zależności dawka-odpowiedź działanie antagonisty jest wyrażone jako przesunięcie krzywych w prawo, odpowiadające wzrostowi skutecznego stężenia o połowę maksymalnego, pod warunkiem, że antagonista jest ligandem konkurencyjnym w stosunku do agonisty. Skuteczne zastosowanie schematu dozowania seryjnego jest technicznie łatwe, ale wymaga przemyślanego planowania, ponieważ trudno jest wykonać wszystkie kroki w odpowiednim czasie.
Dozowanie seryjne utorowało drogę do przeprowadzania badań stężenie-odpowiedź za pomocą innych systemów odczytu, które są ograniczone pod względem liczby próbek monitorowanych równolegle. Szczególne zalety dawkowania seryjnego pozwalają na badanie transdukcji sygnału za pośrednictwem receptora z zupełnie nowymi odczytami, które są wrażliwe na inne zmiany fenotypowe, takie jak cytomechanika. Podczas przygotowywania roztworów podstawowych agonisty receptora należy nosić rękawice i okulary ochronne, ponieważ mogą one być niebezpieczne w przypadku wdychania lub połknięcia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia rejestrację pełnej funkcjonalnej zależności odpowiedzi od stężenia agonisty GPCR w jednej populacji komórek z wykorzystaniem bezetykietowych pomiarów impedancji. Główną zaletą dawkowania seryjnego jest zwiększenie przepustowości, ponieważ pojedyncza studzienka jest wystarczająca do pełnej analizy zależności odpowiedzi od stężenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Farmakologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Białka GPCR odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie aktywacji indukowanej agonistą jest niezbędne dla rozwoju leków.
- Tradycyjne metody mogą wymagać większych próbek komórek.
- Niniejszy protokół jest odpowiedni dla rzadkich i złożonych modeli biologicznych.
Cel badania
- W celu zademonstrowania rejestracji aktywacji GPCR w czasie rzeczywistym.
- W celu zapewnienia szczegółowej charakterystyki agonistów.
- W celu zwiększenia przepustowości w analizie odpowiedzi na stężenie.
Zastosowane metody
- Bezznakownikowe pomiary impedancji.
- Sekwencyjne dawkowanie ligandów GPCR.
- Układ z pojedynczą mikroelektrodą.
- Przygotowanie roztworów ligandów o odpowiednich stężeniach.
Główne wyniki
- Pomyślny zapis pełnych zależności dawka-odpowiedź.
- Zwiększona przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.
- Wykazana wykonalność przy niskiej liczbie komórek w próbce.
- Możliwość zastosowania w formatach organ-on-chip w pojemnikach mikrofluidycznych.
Wnioski
- Niniejszy protokół usprawnia badanie receptorów GPCR w złożonych modelach.
- Zapewnia on niezawodną metodę charakterystyki agonistów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne obszary badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezznakownikowe testy GPCR oparte na impedancji charakteryzują się ograniczoną przepustowością w badaniach zależności dawka-odpowiedź ze względu na koszty macierzy elektrod oraz ograniczenia wynikające z sekwencyjnego rejestrowania sygnałów z poszczególnych studzienek. Protokół seryjnego dodawania agonistów pozwala na uzyskanie pełnych krzywych odpowiedzi stężeniowej z jednej warstwy komórek, co znacząco zwiększa wydajność testu przy jednoczesnym zachowaniu monitorowania w czasie rzeczywistym. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie zapotrzebowania na próbki biologiczne i poprawę efektywności danych w wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pełną charakterystykę zależności dawka-odpowiedź przy użyciu minimalnych próbek komórek.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zużycie odczynników i macierzy elektrod dzięki konsolidacji wielopunktowych testów w formatach jednoparametrowych (single-well).
- Pewność prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez dostarczenie ilościowych pomiarów EC50 i skuteczności w wyniku seryjnych dodatków agonistów.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje powtarzalne, rozdzielone w czasie odczyty impedancji do profilowania w trybie agonistycznym i antagonistycznym.
- Wartość operacyjna: Kompatybilne z automatycznym dozowaniem cieczy w celu przygotowania rozcieńczeń seryjnych w formatach płytek mikrotitracyjnych.
- Standaryzacja testu: Umożliwia spójną normalizację linii bazowej i wykrywanie wartości maksymalnych w kolejnych krokach dawkowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Układ istotny dla choroby: Możliwość zastosowania w odniesieniu do poziomów ekspresji rekombinowanych i endogennych GPCR w modelach istotnych fizjologicznie.
- Biomarker translacyjny: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez korelację zmian impedancji ze stanami aktywacji receptorów.
- Ciągłość modelu przedklinicznego: Ułatwia przygotowanie do screeningu w systemach organ-on-chip i mikroprzepływowych przy ograniczonej dostępności próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda dawkowania seryjnego integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, szczególnie w sytuacjach, gdy kluczowe są oszczędność próbek oraz przepustowość testów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie ścieżek sygnałowych i funkcjonalną walidację celów poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym kinetyki aktywacji GPCR.
- Przesiewanie: Umożliwia wysokotreściowe profilowanie agonistów przy zmniejszonym zużyciu dołków, co zwiększa efektywność wykorzystania płytek.
- Analityka: Dostarcza ilościowe maksima impedancji jako zmienne zależne do czteroparametrycznego modelowania logistycznego zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Wspierają postępy przedkliniczne poprzez generowanie wiarygodnych danych o sile działania agonistów w systemach o niskiej liczbie komórek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę opartą na impedancji do seryjnego dodawania ligandów dla wielu celów GPCR i typów sprzężenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez kompleksową charakterystykę agonistów z pojedynczych populacji.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość i efektywność kosztową poprzez minimalizację zużycia jednorazowych macierzy elektrod na jedną krzywą odpowiedź-dawka.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając szybką eksplorację SAR przy ograniczonym materiale biologicznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki odtwarzalnemu wyznaczaniu EC50 w kampaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu precyzyjnych rozcieńczeń seryjnych ligandów GPCR w stężeniach roboczych.
- Zależne od kompatybilności analizatora impedancji z możliwością rejestracji czasowej w pojedynczych dołkach oraz odejmowania linii bazowej.
- Wymaga ustandaryzowanych odstępów czasowych między dodaniami agonistów w celu zapewnienia równowagi i stabilności odpowiedzi.
- Wiąże się z optymalizacją objętości i częstotliwości dodawania w celu zapobiegania zaburzeniom przepływu cieczy lub nadmiernej stymulacji receptorów.
- Obejmuje rozważania dotyczące protokołów preinkubacji antagonistów w celu oceny wiązania konkurencyjnego i przesunięcia w prawo krzywych dawka-odpowiedź.
