W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

Nasz protokół pozwala na izolację i separację prawidłowo przetworzonych KRAS z wysoką wydajnością. Produkcja autentycznie farnezylowanego i karboksymetylowalnego KRAS umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, w których KRAS znajduje się w błonie, podobnie jak w komórkach ssaków. Wysoka wydajność protokołu odróżnia go od wcześniejszych prac.

Zazwyczaj oczyszczamy od trzech do pięciu miligramów białka na litr materiału do odciągania. Pozwala nam to na prowadzenie różnorodnych eksperymentów biofizycznych i biologii strukturalnej. KRAS jest zmutowany w 20% nowotworów i 90% w nowotworach trzustki.

Tak więc posiadanie protokołu do produkcji autentycznie przetworzonego białka jest bardzo przydatne do opracowywania badań przesiewowych leków, dzięki czemu można badać rzeczywiste białko tak, jak wyglądałoby na błonie komórek rakowych. Protokół ten jest również bardzo przydatny do badania innych białek, które są farnezylowane i w pełni przetwarzane w komórkach. W związku z tym wszystko, co musisz zrobić, to zamienić KRAS na interesujące Cię białko i umieścić je w bakulowirusie.

Kluczowe etapy to te związane z chromatografią kationitową. Używanie odpowiedniej kolumny i ograniczanie czasu, w którym białko znajduje się w buforze o niskiej zawartości soli, jest niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Zrozumienie, że opady nie są zdarzeniem typu kula śnieżna, pomaga poprowadzić tych, którzy są nowicjuszami w protokole.

Jest to wzmocnione przez pokazanie konieczności podzielenia obciążenia kolumny kationowymiennej na wiele mniejszych obciążeń. Po lizie komórek, klarowaniu lizatu i oczyszczeniu białka docelowego przez IMAC, przeanalizuj frakcje białkowe za pomocą strony SDS i barwienia Coomassie. Połącz frakcje szczytowe i dializa basenu przez noc w stosunku do dwóch litrów buforu D w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia wyjąć próbkę z dializy i odwirować ją pod ciśnieniem 4 000 g przez 10 minut w celu usunięcia osadu. Końcowa próbka dializowana i klarowana jest często nadal mętna, ale może być nałożona na kolumnę CEX bez dalszej obróbki. Przygotować 20-mililitrową kolumnę kationowymienną, przemłukując ją trzema objętościami kolumny buforu G, a następnie trzema objętościami kolumny buforu F. Następnie rozcieńczyć 20 mililitrów dializowanej próbki do końcowego stężenia chlorku sodu wynoszącego 100 milimolów, dodając 20 mililitrów buforu E i nałożyć próbkę do kolumny wymiennika.

Bardzo ważne jest, aby rozcieńczyć niewielką ilość próbki zamiast wszystkich na raz, a rozcieńczone próbki należy nałożyć na kolumnę natychmiast po rozcieńczeniu, aby ograniczyć wytrącanie się białka. Kontynuować ładowanie kolumny świeżo rozcieńczoną próbką, ponieważ poprzednie rozcieńczenie zbliża się do końca wsadu. Następnie przepłukać kolumnę do absorbancji podstawowej 280 buforem F, który zwykle wymaga objętości trzech kolumn.

Eluować białko z kolumny o gradiencie 400 mililitrów od buforu F do 65% buforu G, zbierając eluent w sześciu mililitrowych frakcjach. Po zakończeniu gradientu kontynuuj mycie kolumny dla dodatkowych 1,5 objętości kolumny 65% buforu G. Wybierz frakcje dodatnie na podstawie zarówno strony SDS, jak i analizy barwienia Coomassie Blue, a także kontroli śladu UV chromatogramu. Następnie połącz białko i strawij je proteazą His6 TEV zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Po trawieniu i dializie załaduj białko do 20-mililitrowej kolumny IMAC zrównoważonej buforem A w ilości trzech mililitrów na minutę. Podczas tej chromatografii zebrać siedem mililitrów frakcji i przemyć kolumnę łącznie trzema objętościami buforu A lub do momentu osiągnięcia absorbancji linii podstawowej. Eluuj białko docelowe za pomocą pięciokolumnowego gradientu objętości buforu C od 0% do 10% i zbierz siedem frakcji mililitrowych.

Następnie zidentyfikuj frakcje dodatnie za pomocą strony SDS. Po przeanalizowaniu za pomocą strony SDS, oczyszczony lizat powinien zawierać ciemne pasmo, które migruje do około 65 kilodaltonów, co odpowiada białku fuzyjnemu His6-MBP-tev-KRAS4b. Współwyrażany FNTAb migruje do 48 kilodaltonów.

Etap CEX w procesie oczyszczania ma kluczowe znaczenie, ponieważ zmniejsza zakres proteolizy i wzbogaca w pełni przetworzone białko, ale jest najbardziej skomplikowaną częścią protokołu. Typowy wynik z tego etapu ma wyraźny pik trzy z KRAS4b-FMe, ale profile elucji mogą być zmienne. Analiza masy w stanie nienaruszonym przy użyciu ESIMS potwierdza dokładną masę cząsteczkową białek, a tym samym względną proporcję farnezylacji lub karboksymetylacji.

Podczas gdy typowe końcowe partie zawierały wykrywalny KRAS4b-FARN, odsetek ten wynosił mniej niż 15% pod względem wysokości piku z tej analizy. Do wyznaczenia masy KRAS4b związanej z GDP wykorzystano natywną analizę masy. Rozpuszczalnik próbki wymieniono na octan amonu, aby zapewnić łagodniejszą jonizację, dzięki czemu natywny kompleks pozostał nienaruszony.

Interakcję KRAS4b-FMe i liposomów zmierzono za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, aby potwierdzić, że farnezylacja i karboksymetylacja są wymagane do wiązania KRAS4b-FMe z błonami. Zgodnie z oczekiwaniami, KRAS4b-FMe wiązał się z liposomami, podczas gdy nieprzetworzony KRAS4b nie. Minimalizacja czasu, w którym białko jest narażone na działanie niskiej zawartości soli, jest najważniejszym aspektem protokołu, który wpływa na wydajność.

Białko osiąga to niskie stężenie soli tylko przez krótki czas po rozcieńczeniu w buforze E. Białko może być wykorzystywane do różnych eksperymentów biofizycznych, które wykorzystują mimetyki błonowe, takie jak liposomy lub nanodyski, do zbadania, z którymi lipidami oddziałuje KRAS. Korzystając z tych danych, możemy zacząć ekstrapolować, w jaki sposób KRAS oddziałuje z błoną plazmatyczną komórki. Korzystając z oczyszczonego KRAS-FMe, nasi koledzy byli w stanie rozwiązać rentgenowską strukturę krystaliczną KRAS w kompleksie z opiekunem, który jest specyficzny dla farnezylowanej i metylowanej formy tego białka.