Name: W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji w pełni przetworzonego białka KRAS4b z komórek owadnich. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiego plonu farnezylowanego i metylowanego białka do badań biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie w klonowaniu i ekspresji od Carissy Grose, Jen Melhalko i Matta Drew z Laboratorium Ekspresji Białek, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Projekt ten został sfinansowany w całości lub w części ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr 1. HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych

<ol><li>Cox, A. D., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation%3A+more+than+just+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation: more than just glue.</a> Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).</li>
<li>Zhang, F. L., Casey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Prenylation%3A+Molecular+Mechanisms+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).</li>
<li>Hottman, D. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+prenylation+and+synaptic+plasticity%3A+implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease.</a> Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).</li>
<li>Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+and+cognition+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">HDL and cognition in neurodegenerative disorders.</a> Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).</li>
<li>Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pleiotropic+effect+of+statins%3A+prevention+of+cardiac+hypertrophy+by+cholesterol-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms.</a> Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).</li>
<li>Kohnke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPase+prenylation+hierarchy+and+its+potential+role+in+choroideremia+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease.</a> PLoS One. 8 (12), 81758(2013).</li>
<li>Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+prenylation+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting protein prenylation for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).</li>
<li>Kho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tagging-via-substrate+technology+for+detection+and+proteomics+of+farnesylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).</li>
<li>Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAAX+geranylgeranyl+transferase+transfers+farnesyl+as+efficiently+as+geranylgeranyl+to+RhoB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).</li>
<li>Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dragging+ras+back+in+the+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dragging ras back in the ring.</a> Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+in+Membrane+Biochemistry+and+Biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics.</a> Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).</li>
<li>Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Step-by-step+Method+for+the+Reconstitution+of+an+ABC+Transporter+into+Nanodisc+Lipid+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).</li>
<li>Dementiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-Ras4B+lipoprotein+synthesis%3A+biochemical+characterization%2C+functional+properties%2C+and+dimer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation.</a> Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+recombinant+human+Kirsten-ras+%284B%29+p21+produced+at+high+levels+in+Escherichia+coli+and+insect+baculovirus+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).</li>
<li>Gillette, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Farnesylated+and+Methylated+Proteins+in+an+Engineered+Insect+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).</li>
<li>Agamasu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+Prenylation+Is+Required+for+Bivalent+Binding+with+Calmodulin+in+a+Nucleotide-Independent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner.</a> Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Talsania, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Assembly+and+Annotation+of+the+Trichoplusia+ni+Tni-FNL+Insect+Cell+Line+Enabled+by+Long-Read+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies.</a> Genes. 10 (2), 79(2019).</li>
<li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Lowe, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+polyisoprenylated+Ras+proteins+in+the+insect%2Fbaculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system.</a> Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).</li>
<li>Dharmaiaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+recognition+of+farnesylated+and+methylated+KRAS4b+by+PDE%CE%B4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+drug%2FLipid+membrane+interactions+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore.</a> Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).</li>
<li>Fisher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+with+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).</li>
<li>Lakshman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biophysical+analysis+defines+key+components+modulating+recruitment+of+the+GTPase+KRAS+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak zauważono w sekcji Reprezentatywne wyniki, najbardziej krytycznym etapem podczas oczyszczania jest obchodzenie się z próbką w czasie, gdy znajduje się ona w niższej zawartości soli. Ograniczenie czasu, w którym próbka jest wystawiona na działanie mniej niż 200 mM NaCl, pomoże zmniejszyć opady i zwiększyć wydajność próbki. Interpretacja wyników CEX może być trudna, jeśli profil nie spełnia oczekiwań (zob. rys. 2). Dopóki protokół nie stanie się rutyną, zaleca się, aby frakcje elucyjne CEX...

Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w definiowaniu funkcjonalnej aktywności białek. Modyfikacje, takie jak fosforylacja i glikozylacja, są dobrze znane. Modyfikacje lipidów są jednak gorzej scharakteryzowane. Szacuje się, że aż 0,5% wszystkich białek komórkowych może być prenylowanych1. Prenylacja to przeniesienie 15-węglowego farnezylu lub 20-węglowego łańcucha lipidowego geranylgeranylu do białka akceptorowego zawierającego motyw CAAX2. Prenylowane białka są zaangażowane w progresję wielu chorób ludzkich, w tym przedwczesnego starzenia się3, Alzheimer's4, dysfunkcja serca5, choroideremia6, oraz cancer7. Małe GTPazy, HRAS, NRAS i KRAS1, laminy jądrowe i kinetochory CENP-E i F są białkami farnezylowanymi w stanie podstawowym. Inne małe GTPazy, a mianowicie RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 i RRAS to geranylgeranylated8, podczas gdy RhoB może być farnezylowany lub geranylgeranylated9.
Mała GTPaza KRAS4b działa jak przełącznik molekularny, zasadniczo przekazując sygnał zewnątrzkomórkowy czynnikowi wzrostu do wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnału, które stymulują wzrost i proliferację komórek, poprzez wiele interakcji białko-białko. Istnieją dwa kluczowe aspekty biochemii KRAS4b, które są niezbędne dla jego aktywności. Po pierwsze, białko przechodzi cyklicznie między nieaktywnym GDP a aktywnym stanem związanym z GTP, w którym aktywnie angażuje się w efektory. Po drugie, C-końcowy region polilizyny oraz farnezylowana i karboksymetylowana cysteina kierują białko do błony plazmatycznej, umożliwiając rekrutację i aktywację dalszych efektorów. Zmutowany KRAS4b jest onkogennym czynnikiem powodującym raka trzustki, jelita grubego i płuc10, a zatem interwencja terapeutyczna przyniosłaby ogromne korzyści kliniczne. Produkcja autentycznie zmodyfikowanego białka rekombinowanego, które jest farnezylowane i karboksymetylowane, umożliwiłoby biochemiczne badania przesiewowe przy użyciu KRAS4b w połączeniu z substytutami błony, takimi jak liposomy lub nanodyski lipidowe11,12.
Transferaza farnezylowa (FNT) katalizuje dodanie pirofosforanu farnezylu do C-końcowej cysteiny w motywie CAAX w KRAS4b. Po prenylacji białko jest transportowane do retikulum endoplazmatycznego (ER), gdzie enzym konwertujący Ras (RCE1) rozszczepia trzy reszty C-końcowe. Ostatnim etapem przetwarzania jest metylacja nowej C-końcowej reszty farnezylocysteiny przez białko błonowe ER, metylotransferazę karboksylową izoprenylocysteiny (ICMT). Ekspresja rekombinowanego KRAS4b w E. coli powoduje produkcję niemodyfikowanego białka. Wcześniejsze próby wytworzenia przetworzonego KRAS4b były ograniczone ze względu na niewystarczającą wydajność dla strukturalnych lub przesiewowych badań przesiewowych leków lub nie udało się podsumować natywnego dojrzałego białka o pełnej długości13,14. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje zmodyfikowany system ekspresji komórek owadów oparty na bakulowirusie i metodę oczyszczania, która generuje wysoce oczyszczony, w pełni przetworzony KRAS4b przy wydajności 5 mg / L hodowli komórkowej.
Staranna charakterystyka białek jest niezbędna do sprawdzenia jakości rekombinowanych białek przed rozpoczęciem badań z zakresu biologii strukturalnej lub badań przesiewowych leków. Dwa kluczowe parametry w pełni przetworzonego KRAS4b to walidacja prawidłowej modyfikacji prenylu oraz dostępność farnezylowanego i karboksymetylowanego C-końca (FMe) do interakcji z substytutami błonowymi lub lipidami. Spektrometria mas z jonizacją elektronrozpylającą (ESI-MS) KRAS4b-FMe została wykorzystana do pomiaru masy cząsteczkowej i potwierdzenia obecności modyfikacji farnezylu i karboksymetylu. Natywna spektrometria mas, w której próbki są spryskiwane rozpuszczalnikami niedenaturującymi, została wykorzystana do wykazania, że KRAS4b-FMe był również związany ze swoim kofaktorem GDP. Na koniec wykorzystano spektroskopię powierzchniowego rezonansu plazmonowego do pomiaru bezpośredniego wiązania KRAS4b-FMe z unieruchomionymi liposomami.

<table><tbody><tr><td>1,8 ml probówki Safe-Lock, naturalne</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 mm Cl SS z blokowaną wkładką Fiolki z automatycznym samplerem</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>AVANTI POLARNE LIPIDY</td><td></td> 850457 <td>kupić jako płynne zapasy w chloroformie</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfo-L-seryna (POPS)</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>840034</td><td>zakupu jako płynne zapasy w chloroformie</td></tr><tr><td>5427R Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td><td>argonowy Gaz powietrzny</td><td>Płytka testowa ARUP</td><td></td></tr><tr><td>384</td><td>CORNING</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Biacore T200 GE</td><td>Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie uszczelki Snap-It, T / S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>Branson Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatografii kationowymiennej (CEX)</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose</td></tr><tr><td>Wysokowydajny CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek Dyna Pro Spektrometr</td><td>masowy Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>Użyj odczynnika klasy lub lepszej</td></tr><tr><td>Fiolki Gilson Probówki 7x14 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki z gwintem z wkładkami</td> <td>z pianki PTFESpecjalności naukowe</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa/stołowa</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td><td>zdolna do 4,000 xg</td></tr><tr><td>proteazy wirusa wytrawiania tytoniu His6-tytoniu (TEV)</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>Oczyszczona zgodnie z Raran-Kurussi i in. (2017) Usuwanie znaczników powinowactwa z proteazą TEV. W: Burgess-Brown N. (red.) Heterologiczna ekspresja genów w E. coli. Metody w biologii molekularnej, tom 1586. Humana Press, Nowy Jork, NY</td></tr><tr><td>Immobilizowana chromatografia powinowactwa metali (IMAC) kolumna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>Własne zaopatrzenie w wodę, Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Rezystywność 18 M&Omega; 0-cm</td></tr><tr><td>Zestaw ekstrudera do lipidów z uchwytem</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td></td></tr> 610023 <tr><td>Ciekły azot</td><td>Airgas</td> Mikrofluidyzator <td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH</td><td>Mikrofluidyzator</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC, 4 um, 3.0 x 50 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088645</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna MabPac SEC-1, 5 um, 300 &Aring;, 2.1 x 150 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MagTran</td><td>Metanol Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, klasa HPLC</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>System chromatograficzny NGC System chromatograficzny</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl bez EDTA i innych chelatorów</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Gumowe nasadki typ 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>Series S Układ czujnika L1</td><td></td> Spektrofotometr <td>GE Healthcare</td> 29104993 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>Absorbace przy 280nm</td></tr><tr><td>Ultra-15 Filtry odśrodkowe, 10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>membrana PES</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtry wirówkowe</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima - L80K</td><td>zdolna do 100 000 xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC (pompa, separator kolumnowy i system LC)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Woda, klasa HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>Może korzystać z własnego źródła wody (patrz poniżej)</td></tr><tr><td>Strzykawka Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtr</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Oprogramowanie</td><td></td><td>proteomiczne</td></tr></tbody></table>

w pełni przetworzony rekombinowany kras4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Prenylacja białek jest kluczową modyfikacją, która jest odpowiedzialna za kierowanie białek do błon wewnątrzkomórkowych. KRAS4b, który jest zmutowany w 22% nowotworów u ludzi, jest przetwarzany przez farnezylację i karboksymetylację ze względu na obecność motywu pudełka "CAAX" na C-końcu. Zmodyfikowany system bakulowirusa został wykorzystany do ekspresji farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w komórkach owadów i został opisany wcześniej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe, praktyczne oczyszczanie i charakterystykę biochemiczną białka. W szczególności zastosowano chromatografię powinowactwa i wymiany jonowej, aby oczyścić białko do jednorodności. Nienaruszona i natywna spektrometria mas została wykorzystana do walidacji poprawności modyfikacji KRAS4b i weryfikacji wiązania nukleotydów. Na koniec zmierzono asocjację błonową farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b z liposomami za pomocą spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonowego.

Jedną z największych zmiennych w protokole jest ilość ekspresowanego białka docelowego (His6-MBP-tev-KRAS4b). Protokół ten opracowano z wykorzystaniem izolatu z linii komórkowej Trichoplusia ni, Tni-FNL17, zaadaptowanej do wzrostu w zawiesinie i odstawionej od surowicy. Biorąc pod uwagę szeroki zakres wyników raportowanych dla różnych linii komórek owadziego systemu ekspresyjnego bakulowirusowego, zaleca się stosowanie Tni-FNL, przynajmniej początkowo, do produkcji KRAS4b-FMe.
<p clas...

Prenylacja jest ważną modyfikacją białek wiążących błony obwodowe. Komórkami owadów można manipulować w celu wytworzenia farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w ilościach umożliwiających biofizyczne pomiary interakcji białko-białko i białko-lipid

W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Nasz protokół pozwala na izolację i separację prawidłowo przetworzonych KRAS z wysoką wydajnością. Produkcja autentycznie farnezylowanego i karboksymetylowalnego KRAS umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, w których KRAS znajduje się w błonie, podobnie jak w komórkach ssaków. Wysoka wydajność protokołu odróżnia go od wcześniejszych prac.Zazwyczaj oczyszczamy od trzech do pięciu miligramów białka na litr materiału do odciągania. Pozwala nam to na prowadzenie różnorodnych eksperymentów biofizycznych i biologii strukturalnej. KRAS jest zmutowany w 20% nowotworów i 90% w nowotworach trzustki.Tak więc posiadanie protokołu do produkcji autentycznie przetworzonego białka jest bardzo przydatne do opracowywania badań przesiewowych leków, dzięki czemu można badać rzeczywiste białko tak, jak wyglądałoby na błonie komórek rakowych. Protokół ten jest również bardzo przydatny do badania innych białek, które są farnezylowane i w pełni przetwarzane w komórkach. W związku z tym wszystko, co musisz zrobić, to zamienić KRAS na interesujące Cię białko i umieścić je w bakulowirusie.Kluczowe etapy to te związane z chromatografią kationitową. Używanie odpowiedniej kolumny i ograniczanie czasu, w którym białko znajduje się w buforze o niskiej zawartości soli, jest niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Zrozumienie, że opady nie są zdarzeniem typu kula śnieżna, pomaga poprowadzić tych, którzy są nowicjuszami w protokole.Jest to wzmocnione przez pokazanie konieczności podzielenia obciążenia kolumny kationowymiennej na wiele mniejszych obciążeń. Po lizie komórek, klarowaniu lizatu i oczyszczeniu białka docelowego przez IMAC, przeanalizuj frakcje białkowe za pomocą strony SDS i barwienia Coomassie. Połącz frakcje szczytowe i dializa basenu przez noc w stosunku do dwóch litrów buforu D w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia wyjąć próbkę z dializy i odwirować ją pod ciśnieniem 4 000 g przez 10 minut w celu usunięcia osadu. Końcowa próbka dializowana i klarowana jest często nadal mętna, ale może być nałożona na kolumnę CEX bez dalszej obróbki. Przygotować 20-mililitrową kolumnę kationowymienną, przemłukując ją trzema objętościami kolumny buforu G, a następnie trzema objętościami kolumny buforu F. Następnie rozcieńczyć 20 mililitrów dializowanej próbki do końcowego stężenia chlorku sodu wynoszącego 100 milimolów, dodając 20 mililitrów buforu E i nałożyć próbkę do kolumny wymiennika.Bardzo ważne jest, aby rozcieńczyć niewielką ilość próbki zamiast wszystkich na raz, a rozcieńczone próbki należy nałożyć na kolumnę natychmiast po rozcieńczeniu, aby ograniczyć wytrącanie się białka. Kontynuować ładowanie kolumny świeżo rozcieńczoną próbką, ponieważ poprzednie rozcieńczenie zbliża się do końca wsadu. Następnie przepłukać kolumnę do absorbancji podstawowej 280 buforem F, który zwykle wymaga objętości trzech kolumn.Eluować białko z kolumny o gradiencie 400 mililitrów od buforu F do 65% buforu G, zbierając eluent w sześciu mililitrowych frakcjach. Po zakończeniu gradientu kontynuuj mycie kolumny dla dodatkowych 1,5 objętości kolumny 65% buforu G. Wybierz frakcje dodatnie na podstawie zarówno strony SDS, jak i analizy barwienia Coomassie Blue, a także kontroli śladu UV chromatogramu. Następnie połącz białko i strawij je proteazą His6 TEV zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Po trawieniu i dializie załaduj białko do 20-mililitrowej kolumny IMAC zrównoważonej buforem A w ilości trzech mililitrów na minutę. Podczas tej chromatografii zebrać siedem mililitrów frakcji i przemyć kolumnę łącznie trzema objętościami buforu A lub do momentu osiągnięcia absorbancji linii podstawowej. Eluuj białko docelowe za pomocą pięciokolumnowego gradientu objętości buforu C od 0% do 10% i zbierz siedem frakcji mililitrowych.Następnie zidentyfikuj frakcje dodatnie za pomocą strony SDS. Po przeanalizowaniu za pomocą strony SDS, oczyszczony lizat powinien zawierać ciemne pasmo, które migruje do około 65 kilodaltonów, co odpowiada białku fuzyjnemu His6-MBP-tev-KRAS4b. Współwyrażany FNTAb migruje do 48 kilodaltonów.Etap CEX w procesie oczyszczania ma kluczowe znaczenie, ponieważ zmniejsza zakres proteolizy i wzbogaca w pełni przetworzone białko, ale jest najbardziej skomplikowaną częścią protokołu. Typowy wynik z tego etapu ma wyraźny pik trzy z KRAS4b-FMe, ale profile elucji mogą być zmienne. Analiza masy w stanie nienaruszonym przy użyciu ESIMS potwierdza dokładną masę cząsteczkową białek, a tym samym względną proporcję farnezylacji lub karboksymetylacji.Podczas gdy typowe końcowe partie zawierały wykrywalny KRAS4b-FARN, odsetek ten wynosił mniej niż 15% pod względem wysokości piku z tej analizy. Do wyznaczenia masy KRAS4b związanej z GDP wykorzystano natywną analizę masy. Rozpuszczalnik próbki wymieniono na octan amonu, aby zapewnić łagodniejszą jonizację, dzięki czemu natywny kompleks pozostał nienaruszony.Interakcję KRAS4b-FMe i liposomów zmierzono za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, aby potwierdzić, że farnezylacja i karboksymetylacja są wymagane do wiązania KRAS4b-FMe z błonami. Zgodnie z oczekiwaniami, KRAS4b-FMe wiązał się z liposomami, podczas gdy nieprzetworzony KRAS4b nie. Minimalizacja czasu, w którym białko jest narażone na działanie niskiej zawartości soli, jest najważniejszym aspektem protokołu, który wpływa na wydajność.Białko osiąga to niskie stężenie soli tylko przez krótki czas po rozcieńczeniu w buforze E. Białko może być wykorzystywane do różnych eksperymentów biofizycznych, które wykorzystują mimetyki błonowe, takie jak liposomy lub nanodyski, do zbadania, z którymi lipidami oddziałuje KRAS. Korzystając z tych danych, możemy zacząć ekstrapolować, w jaki sposób KRAS oddziałuje z błoną plazmatyczną komórki. Korzystając z oczyszczonego KRAS-FMe, nasi koledzy byli w stanie rozwiązać rentgenowską strukturę krystaliczną KRAS w kompleksie z opiekunem, który jest specyficzny dla farnezylowanej i metylowanej formy tego białka.

fully-processed-recombinant-kras4b-isolating-characterizing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje produkcję tetrameru KLRG1, który jest potężnym narzędziem do analizy ligandów KLRG1.

Protokół produkcji tetrameru KLRG1

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

MRP4 reguluje różne cykliczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od nukleotydów, w tym niedawno wyjaśnioną rolę w migracji komórek. Opisujemy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście do rozwikłania dalszych celów molekularnych MRP4, co skutkuje identyfikacją unikalnego interaktomii MRP4, który odgrywa kluczową rolę w precyzyjnej regulacji migracji fibroblastów.

Metody badania kompleksów makromolekularnych zawierających Mrp4 w regulacji migracji fibroblastów

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji w pełni przetworzonego białka KRAS4b z komórek owadnich. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiego plonu farnezylowanego i metylowanego białka do badań biologicznych.

W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

Przeglądaj więcej filmów