Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ogólnym celem zastosowania kombinacji technik mikromanipulacji i mikroskopii świetlnej, takich jak FRAP i fotoaktywacja, jest monitorowanie dynamiki przestrzenno-czasowej białek zaangażowanych w regulację i migrację cytoszkieletu w różnych warunkach lub w sposób zależny od szlaku sygnałowego. Omówione tutaj metody mikromanipulacji są przydatne do bezpośredniego dostarczania dowolnego rodzaju cząsteczki do komórek, a także do indukowanej światłem manipulacji aktywnością białka w określonych lokalizacjach subkomórkowych. Tak więc główną zaletą przedstawionych tutaj technik jest to, że pozwalają one określić chwilowe efekty, jakie białka wywierają na komórki, wraz ze śledzeniem ich ruchliwości w komórce.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przejść wcześniej wyhodowane komórki B16-F1 w stosunku od jednego do pięciu do trzycentymetrowego plastikowego naczynia. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Umyj komórki PBS, odessaj PBS i dodaj trypsynę EDTA, aby odłączyć komórki.

Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych do trypsynizowanych komórek. Ponownie zawiesić i przenieść komórki do probówek sokoła, po tym wirowaniu z prędkością 1000 obr./min przez trzy do pięciu minut. Po umieszczeniu komórek B16-F1 w trzycentymetrowym naczyniu i pozostawieniu ich do rozprzestrzeniania się przez co najmniej sześć godzin, należy przeprowadzić transfekcję komórek B16-F1, dodając mieszaninę 500 nanogramów konstruktu DNA i jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji w roztworze zawierającym 150 milimolowy chlorek sodu.

W przypadku komórek B16-F1 pokryj 15-milimetrowe szkiełka nakrywkowe 150 mikrolitrami roztworu lamininy i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku komórek NIH 3T3 pokryj szkiełka nakrywkowe roztworem fibronektyny i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć inkubowane lamininy i fibronektyny szkiełka nakrywkowe PBS, a następnie odessać PBS.

Wysiew dwa mililitry fibroblastów NIH 3T3 w stosunku od jednego do 20 z naczynia zlewającego się na szkiełka nakrywkowe pokryte fibronektyną. Odpipetować dwa mililitry transfekowanych komórek B16-F1 w stosunku od 1 do 30 z naczynia zlewającego się na szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą. Następnie pozwól komórkom rozprzestrzenić się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą i fibronektyną przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed mikroskopią.

Umieść szkło nakrywkowe stroną z ogniwami do góry na przewodzącej ciepło aluminiowej komorze obrazowania RC-26. Następnie umieść plastikowy uszczelniacz na wierzchu szkła nakrywkowego, aby zapewnić bezpieczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a komorą, przymocuj, przykręcając plastikowy uszczelniacz do przesuwnych zacisków komory, aby uniknąć wycieku medium. Teraz odpipetuj wstępnie podgrzaną pożywkę mikroskopową o temperaturze 37 stopni Celsjusza do centralnego obszaru.

Włóż czujkę ciepła w wyznaczone miejsce w komorze i połącz elektrody komory z automatycznym regulatorem temperatury TC-324B utrzymującym stałą temperaturę 37 stopni Celsjusza. Odwirować wcześniej rozmrożony roztwór białkowy o stężeniu 10 000 G przez co najmniej 30 minut, aby usunąć agregaty białkowe, które mogą prowadzić do zatkania igły, jeśli są obecne w kapilarze mikroiniekcji. Za pomocą elastycznej końcówki pipety naładować igłę do mikroiniekcji jednym mikrolitrem roztworu białkowego od tyłu.

Jeśli w końcówce igły znajdują się pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w podstawę igły, aby je usunąć. Następnie ostrożnie wyreguluj uchwyt igły na urządzeniu do mikromanipulacji. Po wkręceniu igły do mikroiniekcji w uchwyt igły, należy docisnąć igłę za pomocą ciśnieniowego urządzenia do mikroiniekcji, a następnie przenieść końcówkę igły do pożywki do hodowli komórkowych.

Następnie umieść igłę w polu widzenia za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, a następnie znajdź interesującą cię komórkę i stopniowo opuszczaj igłę nad komórkę. W przypadku mikroiniekcji należy delikatnie dotknąć błony plazmatycznej komórki, co może wystarczyć do przeniknięcia do komórki lub wspomóc przejściowe pęknięcie błony poprzez bardzo delikatne dotknięcie zestawu mikroskopu. Należy przerwać proces wstrzykiwania, gdy tylko widoczny jest przepływ do komórki, przesuwając końcówkę igły do góry w pożywce.

Przed wyzwoleniem lasera przełącz się na kanał GFP i zainicjuj akwizycję obrazu poklatkowego. Następnie ręcznie narysuj obszar, który ma zostać wybielony na kanale GFP, patrząc na wyświetlacz. Rozpocznij fotowybielanie za pomocą ręcznego spustu lasera 405 nanometrów co najmniej trzy do czterech klatek po rozpoczęciu akwizycji obrazu.

Ustaw akwizycję obrazu GFP 488 nanometr w oprogramowaniu na 500 milisekund ekspozycji i 1500 milisekundowy interwał czasowy. Następnie dostosuj ustawienia oprogramowania do nagrywania dwukanałowych lub trzykanałowych filmów poklatkowych, zaznaczając kwadrat serii długości fal i wybierając żądaną liczbę kanałów w menu pozyskiwania długości fali. Przed wyzwoleniem lasera zainicjuj akwizycję obrazu poklatkowego i ręcznie narysuj obszar, który ma być fotoaktywowany na kanale kontrastu fazowego podczas viewwyświetlacz.

Następnie zainicjuj fotoaktywację poprzez ręczne wyzwolenie lasera 405 nanometrów co najmniej trzy do czterech klatek po zainicjowaniu akwizycji obrazu. W celu analizy wyników FRAP otwórz filmy poklatkowe pochodzące z VisiView w oprogramowaniu MetaMorph. Wyznacz wartości intensywności fotobielonych obszarów dla każdego punktu czasowego odzyskiwania fluorescencji, ręcznie rysując odpowiednie obszary za pomocą MetaMorph.

Narysuj kształt na czubku blaszki, który pokrywa całość lub część obszaru fotobielonego i w razie potrzeby ręcznie dostosuj jego położenie na kolejnych klatkach, aby śledzić zmiany intensywności blaszek w danym regionie w czasie podczas przemieszczenia posuwającej się końcówki. W celu korekcji tła i akwizycji fotowybielania należy przeanalizować odpowiednio obszary na zewnątrz i wewnątrz komórek. Po wybraniu obszaru zainteresowania wyodrębnij jego wartości intensywności w MetaMorph za pomocą menu mierz pomiary regionu.

Upewnij się, że w menu konfiguracji wybrano opcje czasu, który upłynął i średniej intensywności. Kliknij otwórz dziennik i wybierz dynamiczną wymianę danych. Następnie kliknij OK, aby otworzyć arkusz kalkulacyjny Excela i ponownie kliknij przycisk Otwórz dziennik, aby wkleić wartości MetaMorph do Excela.

Użyj wartości intensywności pochodzących z MetaMorph, aby obliczyć krzywe odzyskiwania fluorescencji FRAP, wklejając wartości intensywności do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednie formuły. Odzyskiwanie fluorescencji obszaru wybielonego fotometrem jest znormalizowane do obszarów tła i wewnątrz. Aby obliczyć czas połowicznego odzysku fluorescencji, wklej wartości krzywych odzyskiwania fluorescencji wraz z odpowiadającymi im czasami do SigmaPlot, a następnie wykonaj dopasowanie krzywej za pomocą narzędzia kreatora dynamicznego dopasowania wykładniczego wzrostu do maksimum, wybierając funkcję mono lub dwuwykładniczą w zależności od najlepszego dopasowania krzywej.

Parametry uzyskane przez rozwiązanie wybranej funkcji można wkleić do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednią formułę, która pozwala obliczyć odpowiedni czas połowicznego czasu odzyskiwania w ciągu kilku sekund. Do pomiaru dyfuzji fotoaktywowanej aktyny po aktywacji, a także jej akumulacji w określonym regionie, takim jak blaszka, użyj MetaMorph, aby określić intensywność w czasie w odpowiednich regionach, a także na zewnątrz komórki, w celu określenia fluorescencji tła dla normalizacji. W celu zbadania dokładnej szybkości przemieszczania się fotoaktywowanej aktyny z dala od obszaru aktywacji lub jej szybkości włączania w blaszkę, wygeneruj krzywe fluorescencji na podstawie danych pochodzących wcześniej z MetaMorph.

Wklej wartości intensywności dla obszaru tła używanego do normalizacji, fotoaktywowanego regionu cytozolowego lub obszaru blaszkowatego, który ma być badany, do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednie formuły. Pokazano tutaj obrazy kontrastu twarzy komórki fibroblastu NIH 3T3 przed i po mikrowstrzyknięciu małej GTPazy Rac1. Po około 12 minutach od mikroiniekcji komórka zmieniła swoją morfologię, co wskazuje na udane wstrzyknięcie.

Recykling bielonego EGFP VASP przez niebielone cząsteczki na końcówce lamellipodium pokazano tutaj. W tym konkretnym przykładzie fluorescencja odzyskiwania plasuje się na poziomie około 80% fluorescencji przed wybielaniem. Po fotoaktywacji fotoaktywowana aktyna GFP szybko dyfunduje z obszaru cytozolowego.

Frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny przemieszcza się do przodu, tworząc szybki wybuch fluorescencji w lamellipodiach. Włączenie fluorescencji jest znacznie niższe w blaszkach odległych od obszaru fotoaktywowanego, ponieważ frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny zostaje rozcieńczona nieaktywowanymi monomerami podczas ich podróży przez cytozol. Ponieważ fotoaktywowana aktyna GFP z czasem dyfunduje z obszaru fotoaktywowanego, jest stale zastępowana przez niefotoaktywowaną aktynę niefluorescencyjną.

W konsekwencji obserwuje się stopniowy spadek intensywności fluorescencji tego obszaru. Z biegiem czasu blaszki w pobliżu obszaru aktywacji cytozolu szybko włączają aktynę fluorescencyjną. Następujący spadek fluorescencji jest po prostu spowodowany depolimeryzacją aktyny i dyfuzją monomerów z dala od blaszki.

Tak więc, gdy eksperymenty są przeprowadzane na jednym systemie mikroskopowym, połączenie mikroiniekcji i technik FRAP lub fotoaktywacji można realistycznie przeprowadzić w ciągu kilku minut, w zależności od charakteru badanych białek. Zawsze pamiętaj, aby być szczęśliwym przed, w trakcie i po mikromanipulacji lub po ekspozycji na światło lasera. W przypadku FRAP i fotoaktywacji szczególnie ważne jest, aby wybrany region zachowywał swoją integralność strukturalną przez cały czas trwania filmu.

Procedura mikroiniekcji może być uzupełniona miejscowym stosowaniem leków przenikających błonę plazmatyczną lub inhibitorów cytoszkieletu w celu przeciwdziałania natychmiastowym konsekwencjom danego leczenia na poziomie subkomórkowym. Techniki mikromanipulacji utorowały drogę do zbadania właściwości dyfuzji i dynamiki subkomórkowej składników i kompleksów cytoszkieletu oraz do zrozumienia szlaków regulujących morfogenezę komórek z drugiej ręki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić i monitorować dynamikę czasoprzestrzenną białek cytozolowych, białek włączonych do aktu wewnątrz cytoszkieletu lub znajdujących się w różnych organellach subkomórkowych, ostatecznie odkrywając kinetykę regulacji komórek.