Name: Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj techniki mikromanipulacji i mikroskopii świetlnej, takie jak FRAP i fotoaktywacja, do badania dynamiki białek cytoszkieletu w żywych komórkach. Metody te umożliwiają śledzenie ruchliwości białek i ich wpływu na zachowanie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za wsparcie finansowe (grant nr RO2414/5-1 dla KR).

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li>
<li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).</li>
<li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li>
<li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li>
<li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21356831">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988(2008).</li>
<li>Small, J. V., Rottner, K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007/978-90-481-9301-1">Actin-based Motility</a>. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).</li>
<li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li>
<li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li>
<li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li>
<li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li>
<li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li>
<li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li>
<li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li>
<li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+dynamics+during+keratocyte+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li>
<li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832(2017).</li>
<li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).</li>
<li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu omawiamy krytyczne etapy technik opisanych w tym artykule oraz sposób, w jaki można je zoptymalizować pod kątem zastosowania w różnych warunkach eksperymentalnych.
Mikroiniekcja to metoda, którą można zastosować do monitorowania w komórkach natychmiastowych efektów wprowadzenia białek egzogennych, inhibitorów lub leków. Może to być szczególnie korzystne dla określenia funkcji białek w trudnych do transfekcji typach komórek lub w sytuacjach, gdy długotrwała ekspresja nie jest pożądana. Należy zauważyć, że przeżycie niektórych typów komórek różni się w zależności od macierzy zewnątrzkomórkowej, na której są wysiane. Większość typów komórek śródbłonkowych, nabłonkowych lub podobnych do fibroblastów, nawet małych, takich jak keratocyty ryb (patrz Dang i wsp.21 oraz Anderson i Cross22) mogą być z powodzeniem wstrzykiwane. Istnieją jednak wyjątki, takie jak komórki B16-F1 wysiane na lamininie, które stanowią doskonały modelowy system migracji komórek, ale z niewiadomych przyczyn są niekompatybilne z iniekcją na tego typu podłoże. W przypadku komórek fibroblastów NIH3T3 rutynowo wykonujemy iniekcje na podłożu fibronektyny, a dodatkowe techniki fotomanipulacji, takie jak FRAP (nawet z fotoaktywacją; pokazane dla komórek B16-F1 tutaj) mogą być równie dobrze wykonywane w tych fibroblastach (patrz np . Köstler i wsp.3). Należy również wziąć pod uwagę, że różne białka, zgodnie z ich właściwościami funkcjonalnymi i celami eksperymentu, mogą potrzebować różnej ilości czasu, aby wywołać zmiany, od sekund do godzin. Zaletą tej techniki jest to, że dawkowanie/stężenie czynnika egzogennego może być kontrolowane dokładniej na poziomie pojedynczej komórki niż np. w przypadku transfekcji plazmidowej. Ponadto znakowanie fluorescencyjne białka nie jest konieczne, aby zagwarantować jego obecność w komórce, co może zwiększyć elastyczność, jeśli wymagana jest jednoczesna wielokanałowa wizualizacja innych białek znakowanych fluorescencyjnie. Mikroiniekcja może być szczególnie przydatna do analizy natychmiastowego wpływu określonych białek lub mieszanin białek na dynamiczne zmiany morfologii komórek lub cytoszkieletu (np . Dang i wsp.21 dla przykładu natychmiastowego wpływu inhibitora kompleksu Arp2/3 na migrację Arpin). Wadą tej techniki jest jej inwazyjność, która może powodować uszkodzenie komórek lub wpływać na morfologię komórek. Dlatego ważną kwestią podczas wykonywania mikroiniekcji jest monitorowanie żywotności komórek. Wprowadzona tutaj metoda opiera się na ręcznej manipulacji. W warunkach przetestowanych pod kątem zgodności z udanymi wstrzyknięciami, takich jak fibroblasty rosnące na podłożu fibronektyny, opisany tutaj protokół ręcznego wstrzykiwania pozwala na prawie 100% skuteczność; Jest to niezbędne w przypadku połączenia tego podejścia z zaawansowanymi i czasochłonnymi eksperymentami uzupełniającymi, w tym mikroskopią wideo lub FRAP, jak opublikowano wcześniej3. Nie wyklucza to, że od czasu do czasu pojedyncze komórki mogą cierpieć z powodu zdarzenia mikroiniekcji, które można bezpiecznie rozpoznać po nagłych zmianach kontrastu zarówno jądra, jak i cytoplazmy, a następnie retrakcji krawędzi komórki. Takie rzadkie przypadki eksperymentalne są wykluczane i w związku z tym nie są brane pod uwagę do dalszych analiz.
Powszechnie stosowane jest jednak również podejście półautomatyczne, na przykład polegające na szybkim (<300 ms) sterowanym maszynowo opuszczaniu igły zbiegającym się ze wzrostem ciśnienia wtrysku, tak że igła musi być umieszczona nad każdą komórką tylko przed odpowiednim wstrzyknięciem. Wskaźnik powodzenia półautomatycznych zastrzyków jest z definicji niższy niż w przypadku podejścia ręcznego opisanego powyżej, po prostu dlatego, że jest ono zoptymalizowane pod kątem szybkości, po której następuje analiza wielu komórek, które pomyślnie przetrwały to leczenie; W związku z tym nie polega na udanym wstrzyknięciu pojedynczej komórki. Dlatego, w przeciwieństwie do analizy pojedynczych komórek, półautomatyczne iniekcje lepiej nadają się do analizy efektów iniekcji kilkuset komórek, np. za pomocą wideomikroskopii przy małym powiększeniu lub po utrwaleniu i barwieniu komórek. Niezależnie od zastosowanego podejścia szczegółowego, mikroiniekcja nie stanowi testu punktu końcowego, ale może być łączona z różnymi technikami, w tym FRAP lub fotoaktywacją3.
Określając szybkość obrotu białek za pomocą FRAP, intensywność lasera musi być zoptymalizowana, w zależności od ustawień mikroskopu i warunków obrazowania (powiększenie, obiektywy itp., a także typ komórki, struktura i białko fluorescencyjne do fotowybielania). Należy pamiętać, że przy optymalnej mocy lasera skuteczne wybielanie łączy się z najmniejszymi możliwymi fotouszkodzeniami, aby uniknąć skurczu lub całkowitego wycofania analizowanej struktury (np . lamellipodia lub filopodia), a nawet uszkodzenia na poziomie komórkowym. Idealnie byłoby, gdyby osiągnięto co najmniej 70-80% skuteczności wybielania, chociaż całkowite wybielanie może być utrudnione przez niezwykle szybką rotację białka, w którym to przypadku wszystko powyżej 50% może być również dopuszczalne. Optymalna moc bielenia dla danej struktury i barwnika fluorescencyjnego powinna być testowana doświadczalnie, zaczynając od niskiej mocy lasera, a następnie stopniowo ją zwiększając. Oczywiście, każdy barwnik fluorescencyjny może być z definicji wybielany światłem laserowym w pobliżu szczytu wzbudzenia (488 nm dla często stosowanych barwników zielonych, takich jak FITC lub EGFP). Jednak lasery o krótszych długościach fal, takie jak lasery bliskiego UV, zapewniają większe moce, a zatem mogą być również wykorzystywane do wydajnego wybielania powszechnie stosowanych barwników. Rutynowo używamy lasera diodowego o długości fali 405 nm (120 mW) do wybielania zarówno barwników EGFP, jak i czerwonych barwników fluorescencyjnych (takich jak mCherry), choć w przypadku tych ostatnich z nieco mniejszą skutecznością (dane nie pokazane). Ponieważ dioda o długości fali 405 nm może być również używana do fotoaktywacji PA-GFP (patrz poniżej), zapewnia ona temu systemowi maksymalną elastyczność.
Do fotowybielania struktur komórkowych B16-F1 i białek fluorescencyjnych zastosowano lasera o mocy 405 nm w zakresie od 65 do 100 mW. Analizując fotobielony obszar, należy wziąć pod uwagę, czy dana struktura zachowała się w swoim pierwotnym kształcie w analizowanym okresie. Na przykład, analizując obrót białek na końcach lamellipodiów, należy zwrócić uwagę, czy krzywizna lamellipodiów nie ulega znaczącym zmianom w czasie, ponieważ zmiany krzywizny mogą prowadzić do niedokładnych wyników, jeśli analizowany obszar/kontur nie obejmuje w pełni całości struktury w każdym mierzonym klatce. Ponadto należy zauważyć, że wiązki osadzone w lamellipodiach, takie jak mikrokolce, mogą powodować odchylenia w intensywności fluorescencji. Jak pokazano na rysunku 2b (biała strzałka w przedziale czasowym 9 s), struktura przypominająca mikrokolce znajduje się obok mierzonego obszaru fotowybielanego, ale pozostaje poza nim przez cały czas trwania pomiaru, a zatem nie powoduje żadnych niedokładności. Dla analizy obrotu białek ważnymi względami przy wyborze lokalizacji i wielkości analizowanych regionów jest to, że na ich fluorescencję w czasie nie powinny mieć znaczącego wpływu zmiany w morfologii komórek lub czynniki inne niż trudne do uniknięcia fotowybielanie akwizycyjne. Na przykład struktury wnoszące istotny wkład ilościowy do analizowanej struktury nie powinny wychodzić poza mierzony obszar podczas analizy; Ponadto niepowiązane, fluorescencyjne jednostki, takie jak struktury pęcherzykowe, które przyciągają białko, nie powinny wchodzić w pole zainteresowania podczas analizy. W celu określenia szybkości polimeryzacji aktyny blaszkowatej należy zwrócić uwagę, aby nie analizować lamellipodiów chowanych lub marszczonych (tj. fałdowanych do góry), ponieważ będzie to miało duży wpływ na dokładność wyników. Ponadto retrakcja obszarów blaszkowatych może wydawać się szybką translokacją do tyłu, potencjalnie prowadząc do przeszacowania szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej. Dodatkową kwestią jest odległość wewnątrzkomórkowych regionów normalizacyjnych (przyjmowanych jako pozycje referencyjne dla korekcji fotowybielania akwizycyjnego) od rzeczywistej pozycji fotowybielania, która powinna być wystarczająco duża, aby uniknąć bezpośredniego wpływu obszaru fotowybielanego.
Podczas tworzenia optymalnych warunków do fotoaktywacji konstruktów znakowanych PA-GFP należy zachować ostrożność, aby uniknąć natychmiastowego wybielania podczas fotoaktywacji. W naszej pracy najlepsze wyniki uzyskano przy mocy lasera 5-10 razy mniejszej niż normalnie stosowana do wybielania EGFP. W celu uzyskania obrazu fotoaktywowanych cząsteczek czas ekspozycji i odstęp czasu między klatkami powinny być zoptymalizowane, biorąc pod uwagę wielkość regionów i struktur, które mają być fotoaktywowane i analizowane, a także potencjalną ruchliwość fotoaktywowanych białek do innych lokalizacji subkomórkowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich rodzajów obrazowania fluorescencyjnego, utrzymanie żywotności komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania fizjologicznie istotnych wyników.
Zasadniczo, fotokonwersja z zielonego na czerwony białek fluorescencyjnych, takich jak mEos lub warianty Dronpa12, stanowi równie skuteczną metodę śledzenia dynamiki i obrotu struktur subkomórkowych, takich jak blaszki (patrz np. Burnette i wsp.23). Zaletą tej drugiej metody, w przeciwieństwie do PA-GFP, byłaby możliwość śledzenia dynamiki białka przed i po konwersji z dwoma różnymi kolorami, bez konieczności koekspresji dodatkowego białka czerwonej fluorescencji. Jednak w naszych wstępnych eksperymentach zakres zmiany kontrastu i intensywność sygnału fluorescencyjnego uzyskanego po fotoaktywacji PA-GFP był większy w porównaniu z sondami fotokonwertowanymi, być może ze względu na lepsze cechy spektralne zielonych i czerwonych sond fluorescencyjnych (dane nie pokazane). W każdym razie szczegółowe badania nad obrotem włókien aktynowych w wypukłościach na krawędziach komórek, takich jak lamellipodia lub ogony aktynowe wywołane wirusem krowianki, zostały do tej pory opublikowane tylko przy użyciu pochodnych PA-GFP 5,6,24.
Rozważając, który region komórki przeanalizować po fotoaktywacji, należy wziąć pod uwagę kilka czynników, które omówiono na konkretnym przykładzie pokazanym tutaj (włączenie monomerów aktyny na krawędzi komórki po aktywacji w cytozolu), ale z pewnością można je ekstrapolować na różne analogiczne problemy naukowe. Po pierwsze, mierząc szybkość inkorporacji lamelipodialnej cytozolowo fotoaktywowanych białek, na przykład, w różnych warunkach eksperymentalnych (jak wykazano w Dimchev i wsp.6), rozmiary regionów cytozolowych i ich odległości do krawędzi blaszkowatych powinny być porównywalne między grupami doświadczalnymi. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że podczas fotoaktywacji regionów cytozolowych grubość komórki jest większa w pozycjach bliższych jądra. Aktywacja grubszych regionów komórkowych może skutkować większymi ilościami aktywowanych białek, biorąc pod uwagę, że dystrybucja białka, które ma być aktywowane, jest jednorodnie rozmieszczona w cytozolu. Wreszcie, poziomy ekspresji białka, które ma być aktywowane, mogą być z pewnością bardzo zmienne w poszczególnych komórkach. Ze względu na wszystkie te rozważania dotyczące zmienności, kluczowe jest porównanie poziomów inkorporacji cytozolowo aktywowanych białek w innych miejscach komórki w stosunku do całkowitej fluorescencji uzyskanej po aktywacji w określonych regionach.
Opisaliśmy, w jaki sposób mikroiniekcja może być wykorzystana jako narzędzie do badania wpływu białek na morfologię komórek i zilustrowaliśmy to, wykazując silną indukcję struktur lamelipodialnych w komórkach fibroblastów NIH3T3 mikrowstrzykiwanych małą GTPazą Rac1. Wcześniej zastosowaliśmy tę technikę do interferencji z funkcją Arp2 / 3 w komórkach, którym wstrzyknięto C-końcową domenę WCA Scar / WAVE3. Różne parametry w komórkach, którym podano mikroiniekcję, można analizować za pomocą innych testów, takich jak FRAP lub fotoaktywacja. Opisaliśmy, w jaki sposób FRAP i fotoaktywacja mogą być wykorzystane do badania subkomórkowej dynamiki i ruchliwości monomerów aktyny. FRAP był wcześniej używany przez naszą grupę5 do badania obrotu białek lokalizujących się w blaszkach, takich jak VASP, Abi, kortaktyna, kofilina i białko capping, lub do wyjaśnienia obrotu składników w zrostach ogniskowych w obecności i braku sygnalizacji Rac4. Co więcej, pomiar szybkości polimeryzacji aktyny można osiągnąć poprzez fotowybielanie β-aktyny5 znakowanej EGFP, ale istnieją alternatywne metody. Można również zastosować śledzenie niejednorodności fluorescencyjnych obserwowanych przez sondy kompatybilne z obrazowaniem żywych komórek, znakujące komórkowe filamenty aktynowe, takie jak Lifeact25 6,26. Zaletą jest to, że można uniknąć nadekspresji β-aktyny, która jest w stanie zwiększyć wysunięcie krawędzi komórki i migrację, a tym samym potencjalnie zakłóca konkretny test lub pytanie eksperymentalne (patrz np. Kage i wsp.Rozdział 26; Peckham i wsp.27). Jednak wyraźną wadą sondy Lifeact jest jej szybka kinetyka wiązania z filamentami aktyny, tak że bielenie struktur filamentów aktynowych oznaczonych przez Lifeact w komórkach dostarcza informacji tylko o obrocie sondy, ale nie o obrocie włókien aktynowych, z którymi się wiąże25. Śledzenie niejednorodności fluorescencji stosowane wcześniej 6,26 zapewnia praktyczny kompromis, bardzo podobny do szeroko stosowanego śledzenia plamek fluorescencyjnych włączonych do nitkowatych struktur cytoszkieletu (patrz np. Salmon i Waterman28), ale może nie być tak proste w użyciu i tak precyzyjne jak FRAP struktur F-aktyny znakowanych EGFP. Fotoaktywacja została przez nas zastosowana do oszacowania szybkości włączania monomerycznej aktyny do wystających lamellipodiów, a także jej ruchliwości w cytozolu, w kontekście eksperymentalnie dostrojonych poziomów cytozolowej F-aktyny6. Technika ta jest przydatna do badania ruchliwości i dystrybucji białek pochodzących ze stosunkowo dużych obszarów, takich jak regiony cytozolowe. Jednak badanie rozmieszczenia białek pochodzących ze stosunkowo małych struktur aktywowanych światłem; Na przykład stożki wzrostu mogą być trudne ze względu na małą liczbę aktywowanych cząsteczek fluorescencyjnych, słabe sygnały, a tym samym brak czułości. Potencjalne techniki alternatywne dla fotoaktywacji lub fotokonwersji fluorescencji (patrz wyżej) mogą obejmować odwrotny FRAP, który polega na fotowybielaniu całej komórki z wyjątkiem ROI, a następnie śledzeniu ruchliwości cząsteczek fluorescencyjnych z dala od tego obszaru. Technika ta nie wymaga nadekspresji fotoaktywowanych wersji białek, ale zawsze wiąże się z ekspozycją na niezwykle wysoką dawkę lasera, co może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak fotouszkodzenia.
Oczywiste jest, że fotoaktywacja i FRAP nie są w stanie rozróżnić, czy białka poruszają się jako monomery, dimery, czy nawet małe oligomery, i czy poruszają się w połączeniu z dodatkowymi partnerami wiążącymi. Informacje tego rodzaju można uzyskać za pomocą technik spektroskopii korelacji fluorescencji29 lub alternatywnie FLIM-FRET30. Niemniej jednak FRAP i fotoaktywacja stanowią proste podejścia do bezpośredniej oceny lokalnej i globalnej dynamiki białek w komórkach, niezależnie od białka będącego przedmiotem zainteresowania, lokalizacji subkomórkowej lub typu badanej komórki.

Monitorowanie czasoprzestrzennej dynamiki białek i innych cząsteczek w żywych komórkach stało się podstawowym narzędziem w wielu dziedzinach biologii komórkowej i molekularnej. Zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej, w tym transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i obrazowanie czasu życia fluorescencji FRET (FRET-FLIM), czyli FRAP, utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) i fotoaktywacji oraz wiele innych, pozwalają na czasowe i przestrzenne śledzenie oddziaływań białko-białko, zmian konformacyjnych, a także określanie kinetyki dyfuzji i lokalizacji różnych białek w komórce1,2. Techniki FRAP i fotoaktywacji, w szczególności, są szeroko stosowane do badania regulatorów cytoszkieletu aktynowego i migracji komórek. Techniki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z dodatkowymi technikami mikromanipulacji, takimi jak mikroiniekcja3, i obejmują ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Pozwalają one na oszacowanie kinetyki asocjacji białek ze strukturami bogatymi w aktynę zaangażowanymi w migrację komórek, takimi jak filopodia lub lamellipodia, obrót białek w zrostach ogniskowych4 lub rozgałęzione sieci aktynowe5. Umożliwiają również określenie szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej, ocenę dyspersji aktyny monomerycznej w cytozolu, szybkość translokacji subkomórkowego monomeru aktyny do polimeryzujących włókien aktynowych w wystających lamellipodiach6 i inne parametry.
FRAP to metoda wizualizacji i ilościowego określania mobilności białek w żywej komórce, pierwotnie opracowana w latach siedemdziesiątych przez Axelrod7. Obszar zainteresowania (ROI) w komórce, wypełniony białkami znakowanymi fluorescencyjnie, jest przejściowo wystawiony na działanie lasera o dużej intensywności, wystarczającej do spowodowania bielenia cząsteczek fluoroforu obecnych w tym regionie w określonym krótkim okresie czasu. Niebielone, znakowane fluorescencyjnie białka znajdujące się poza obszarem zwrotu z inwestycji podczas bielenia będą dyfundować i infiltrować wybielony obszar w zależności od ich dynamiki czasoprzestrzennej, powodując z czasem przemieszczenie fotobielonych cząsteczek. Szybkość odzysku fluorescencji w wybielonych obszarach zależy od różnych czynników, w tym od wielkości i szybkości dyfuzji danej cząsteczki oraz oczywiście szybkości jej obrotu w przypuszczalnie powiązanej wybielonej strukturze. W ten sposób rozpuszczalne białka będą pośredniczyć w odzyskiwaniu fluorescencji w wybielonym ROI szybko poprzez dyfuzję, podczas gdy białka ściśle związane ze strukturami, takimi jak zrosty ogniskowe, będą miały dłuższe czasy obrotu, ponieważ ich odzysk fluorescencji będzie zależał zarówno od dyfuzji rozpuszczalnej frakcji białka, jak i kinetyki dysocjacji-asocjacji frakcji związanej ze strukturą. Odzyskiwanie fluorescencji jest zwykle nabywane i oznaczane ilościowo do momentu osiągnięcia początkowego poziomu intensywności fluorescencji przed wybielaniem. Nie dzieje się tak jednak, jeśli część początkowej intensywności fluorescencji należy do tzw. frakcji nieruchomej, która nie jest w stanie zostać uzupełniona przez dyfuzję lub uzupełnia się w bardzo wolnym tempie w porównaniu z większością cząsteczek składających się na frakcję ruchomą. Aby określić tempo wymiany białek, generowane są krzywe FRAP, reprezentujące zakres odzyskiwania fluorescencji w czasie. Na podstawie tych krzywych odzysku można obliczyć średnie czasy połowicznego zaniku białka. Tworząc dopasowania krzywych średnich danych FRAP, a tym samym analiz matematycznych, można również wywnioskować, czy średnia szybkość obrotu frakcji ruchomej stanowi złożenie jednej jednorodnej populacji cząsteczek, czy też składa się z dwóch lub więcej subpopulacji cząsteczek obracających się w różnym tempie. Oprócz szacowania szybkości obrotu białek za pomocą podejść ilościowych, śledzenie odzyskiwania fotobielonych regionów w lamellipodiach może również pozwolić na dokładne ilościowe określenie parametrów ruchliwości lamelipodiów, takich jak przepływ wsteczny, wypukłość i szybkość polimeryzacji aktyny. Tym samym FRAP jest wszechstronnym narzędziem do oceny różnych parametrów w strukturach żywych komórek.
Fotoaktywacja to metoda używana do śledzenia dyfuzji i ruchliwości białek lub cząsteczek pochodzących z wyznaczonego miejsca komórkowego. Technika ta wykorzystuje na przykład wariant białka zielonej fluorescencji typu dzikiego (GFP), początkowo opracowany przez Pattersona i Lippincotta-Schwartza8, który jest zmutowany w sposób, który pozwala na znaczne zwiększenie jego fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe (UV) (około 400 nm; tutaj 405 nm). Jak opisali Patterson i wsp., chromofory GFP typu dzikiego występują jako mieszana populacja obojętnych fenoli i anionowych fenolanów, które wytwarzają odpowiednio główny pik absorbancji przy około 397 nm i mniejszy przy 475 nm. Po naświetlaniu białka światłem UV populacja ulega fotokonwersji, przechodząc w kierunku formy anionowej. Po wzbudzeniu przez 488 nm, fotoprzekształcone/fotoaktywowane białko wykazuje 3-krotny wzrost fluorescencji, co w praktyce jest niewystarczające do rozróżnienia między aktywowanym i nieaktywowanym GFP ze względu na wysoką wewnętrzną fluorescencję tła. Jednak zmniejszenie intensywności tła osiągnięto poprzez wprowadzenie pojedynczej mutacji aminokwasowej do sekwencji GFP (substytucja histydyny w pozycji 203). Powstały mutant T203H, znany również jako fotoaktywowalny GFP (PA-GFP), charakteryzuje się znacznym zmniejszeniem absorbancji mniejszego piku, który po napromieniowaniu światłem UV zwiększa się prawie 100-krotnie, gdy następnie wzbudza światło o długości 488 nm. W związku z tym nadekspresja białek znakowanych PA-GFP jest szeroko stosowanym podejściem, które pozwala na określenie dyfuzji i ruchliwości cząsteczek w komórkach. Wcześniej zastosowaliśmy aktynę znakowaną PA-GFP, aby określić szybkość dyspersji monomerów aktyny z dala od regionów cytozolowych, umożliwiając nie tylko zbadanie ich ruchliwości w cytozolu, ale także szybkość ich włączenia do wystającej blaszkowatej sieci aktynowej 6. Nowsze piśmiennictwo opisuje również nowe, fotokonwertowalne białka, które w zasadzie mogą być stosowane w analogiczny sposób, ale mają potencjalną przewagę, ponieważ są widoczne już przed fotokonwersją. Przykładami dla tej grupy białek fluorescencyjnych są Dendra2 i mEos29,10,11,12.
W tym artykule wyjaśniamy metodologię mikrowstrzykiwania komórek białkami. Dalej wyjaśniamy, w jaki sposób można połączyć tę technikę z FRAP poprzez fotowybielanie białek zaangażowanych w regulację i ruchliwość cytoszkieletu aktynowego oraz jak można wyprowadzić krzywe FRAP i czas połowicznego powrotu frakcji ruchomych. Ponadto podajemy przykład, w jaki sposób technika FRAP może być wykorzystana do określenia szybkości polimeryzacji aktyny sieci lamelipodialnych. Udostępniamy również instrukcje i wskazówki, jak przeprowadzać eksperymenty fotoaktywacyjne, które można wykorzystać do określenia cytozolowej ruchliwości monomerycznej aktyny i szybkości inkorporacji aktyny do lamellipodiów. Techniki te, oczywiście, nie ograniczają się tylko do śledzenia składników cytoszkieletu aktynowego, ale po potencjalnie wymaganej umiarkowanej adaptacji lub optymalizacji mogą być szeroko stosowane do innych typów komórek lub do badania różnych białek, struktur i parametrów.

<table><tbody><tr><td>B16-F1 komórki czerniaka skóry myszy&nbsp;</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VA</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>Komórki NIH-3T3</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VA</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g / L glukozy&nbsp;</td><td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Niemcy</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F-12 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu&nbsp; (SKO)</td><td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>F7524</td><td>Lot054M3396</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-glumatyna 200mM (100x)</td><td>Life Technolgies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 5000 U/mL</td><td>Technologie życia</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Bufor do powlekania&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Własnej roboty: 50mM Tris ph7,4, 150mM NaCl</td></tr><tr><td>Fibronectin z ludzkiego osocza&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, Francja</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei</td><td>buffer Polyplus Transfekcja, Illkirch, Francja</td><td>702-50</td><td>150mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-aktynowy plazmid DNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>opisane w Koestler et al.2008</td></tr><tr><td>plazmid pEGFP-aktyny DNA</td><td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Białko Rac1 do mikroiniekcji</td><td></td><td></td><td>Oczyszczone jako wersja oznaczona GST i odcięte od GST przed wstrzyknięciem</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do mikroiniekcji</td><td>Własnej produkcji: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70 000 MW, sondy molekularne z utrwalaną lizyną</td><td>, Thermno Fisher Scientific, Niemcy</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop okrągłe okulary nakrywkowe 15mm, nr 1&nbsp;</td><td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Niemcy</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip Końcówki kapilarne do mikroiniekcji</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy&nbsp;</td><td>ACC Silicones, Bridgewater, Anglia</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa otwarta diamentowa komora obrazowania kąpieli</td><td>Przyrządy Warner</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop: Axio Observer&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Jena, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat CoolSnap-HQ2&nbsp;</td><td>Fotometria, Tucson, źródło światła AZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG4&nbsp;</td><td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło laserowe&nbsp;</td><td>Mikrowtryskiwacz Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td>Z wbudowaną sprężarką do zasilania ciśnieniem</td></tr><tr><td>System mikromanipulatora Nikon Narishige</td><td>Nikon Instruments, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Visiview v2.1.4</td><td>Visitron Systems, Puchheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metamorph v7.8.10</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot v.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Badanie czasoprzestrzennej dynamiki białek może ujawnić ich funkcjonalne znaczenie w różnych kontekstach. W tym artykule omówiono, w jaki sposób odzysk fluorescencyjny po fotowybielaniu (FRAP) i techniki fotoaktywacji mogą być wykorzystane do badania czasoprzestrzennej dynamiki białek w lokalizacjach subkomórkowych. Pokazujemy również, w jaki sposób techniki te umożliwiają proste określenie różnych parametrów związanych z regulacją cytoszkieletu aktyny i ruchliwością komórek. Co więcej, mikroiniekcja komórek jest dodatkowo opisywana jako alternatywne leczenie (potencjalnie poprzedzające lub uzupełniające wyżej wymienione techniki fotomanipulacji) w celu wywołania natychmiastowego wpływu translokowanych białek na morfologię i funkcję komórki. Mikromanipulacje, takie jak wstrzykiwanie białek lub miejscowe stosowanie leków przenikających błonę plazmatyczną lub inhibitorów cytoszkieletu, może służyć jako potężne narzędzie do rejestrowania natychmiastowych konsekwencji danego leczenia na zachowanie komórek na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. Przykładem tego jest natychmiastowa indukcja wypukłości krawędzi komórek blaszkowatych przez wstrzyknięcie rekombinowanego białka Rac1, jak ustalono ćwierć wieku temu. Ponadto udostępniamy protokół określania obrotu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)-VASP, polimerazy filamentu aktynowego wyraźnie gromadzącej się na blaszkowatych końcach komórek B16-F1, wykorzystując FRAP i obejmując powiązaną analizę danych i dopasowanie krzywej. Przedstawiamy również wytyczne dotyczące szacowania szybkości polimeryzacji sieci aktynowej lamellipodial, czego przykładem są komórki eksprymujące β-aktynę znakowaną EGFP. Na koniec podano instrukcje, jak badać tempo ruchliwości monomeru aktyny w cytoplazmie komórki, a następnie włączanie aktyny w miejscach szybkiego składania włókien, takich jak końcówki wystających lamellipodiów, przy użyciu podejść fotoaktywacyjnych. Żaden z tych protokołów nie jest ograniczony do składników lub regulatorów cytoszkieletu aktynowego, ale można go łatwo rozszerzyć, aby w analogiczny sposób zbadać czasoprzestrzenną dynamikę i funkcję białek w różnych strukturach subkomórkowych lub kontekstach funkcjonalnych.

Rysunek 1g, h przedstawia obrazy w kontraście fazowym fibroblasta NIH3T3 przed oraz 10 min po mikroiniekcji Rac1, który jest małą GTPazą z rodziny Rho zdolną do indukowania tworzenia lamellipodiów poprzez oddziaływanie z kompleksem WAVE. Komórka jest najpierw wizualizowana przed mikroiniekcją (Rysunek 1g), aby potwierdzić jej żywotność i morfologię, np. brak lamellipodiów. W 10 min po mikroiniekcji komórka wyraźnie zmieniła swoją morfologię, co jest oczekiwanym efektem tej procedury i wskazuje na prawidłowe wykonanie iniekcji (Rysunek 1h).
Dla uproszczenia i przejrzystości przedstawiamy w dalszej części przykładowe wyniki analizy FRAP oraz fotoaktywacji w komórkach, które nie zostały dodatkowo poddane mikroiniekcji.
Analiza wymiany białka VASP znakowanego EGFP na krawędzi lamellipodium została przedstawiona na Rysunku 2a-f. Należy zauważyć, że VASP lokalizuje się również w nowo powstających i dojrzałych adhezjach ogniskowych, widocznych jako małe i wydłużone kropki wewnątrz komórki18,19. Intensywność fluorescencji w obszarze lamellipodium z wyraźną akumulacją VASP na krawędzi została poddana fotowybieleniu, a następnie mierzona w każdym przedziale czasowym poprzez śledzenie konturu ROI przed, w trakcie i po wybieleniu, w miarę jak lamellipodium wysuwa się do przodu. Ponieważ wybielone białka EGFP-VASP są zastępowane przez nie wybielone cząsteczki w tych miejscach, obserwuje się stopniowy powrót fluorescencji (Rysunek 2b). Krzywa powrotu FRAP uzyskana w ten sposób i znormalizowana do intensywności sprzed wybielenia (wyrażonej jako 1) widoczna jest na Rysunku 2c. Wydajność fotowybielania może się różnić i w tym przykładzie wynosiła około 20% wartości sprzed wybielenia, co określono na podstawie wartości w t0 (pierwsza klatka po fotowybieleniu). Wzrost fluorescencji osiąga plateau w pokazanym przykładzie na poziomie około 80% fluorescencji sprzed wybielenia. W strukturze statycznej w czasie trwania eksperymentu, takiej jak adhezja ogniskowa, różnica między intensywnością przed wybieleniem a fluorescencją plateau osiągniętą po powrocie jest definiowana jako frakcja nieruchoma (IF, czerwona strzałka na Rysunku 2c, e), natomiast ilość fluorescencji odzyskanej między momentem wybielenia a pełnym powrotem jest definiowana jako frakcja ruchoma (zielona strzałka dwustronna na Rysunku 2c, e). Należy zauważyć, że w strukturze dynamicznie zmieniającej się, takiej jak analizowana tutaj krawędź lamellipodium, zakres IF może reprezentować nie tylko nieruchome cząsteczki, ale może również wynikać ze zmniejszenia prędkości wysuwania, ponieważ wiadomo, że intensywność EGFP-VASP zależy od tego parametru18. Aby obliczyć czas połowiczny powrotu, stworzono krzywą dopasowania w programie Sigma plot (Rysunek 2d). W tym przypadku wartość parametru „b” wyznaczona z Równania 2 wynosi 0,0754, co po podstawieniu do funkcji logarytmicznej (Równanie 4) daje szacowany czas połowiczny powrotu wynoszący 9,19 s (Rysunek 2d, prawy panel), co w tej konkretnej komórce jest wynikiem stosunkowo szybkim w porównaniu do średnich opublikowanych wcześniej5. Należy zaznaczyć, że czasy połowiczne powrotu mogą czasami znacznie różnić się między komórkami w obrębie tej samej populacji. Dlatego w celu uzyskania reprezentatywnych wyników zaleca się wyznaczanie tego parametru jako średniej z co najmniej 15-20 komórek. Aby zilustrować stopień wariancji, wygenerowano średnie arytmetyczne powrotu EGFP-VASP uśrednione z 15 komórek dla każdego punktu czasowego (Rysunek 2e), a średnie dopasowania krzywych utworzono i przedstawiono w analogiczny sposób (Rysunek 2f).
Szybkość polimeryzacji sieci aktynowej w lamellipodium stanowi sumę wysunięcia sieci do przodu oraz przepływu retrogradacyjnego. Metodę FRAP można zastosować do pomiaru szybkości polimeryzacji aktyny poprzez transfekcję komórek (w tym przypadku B16-F1) β-aktyną znakowaną EGFP i fotowybielenie wysuniętego obszaru lamellipodium (Rycina 2g). W celu analizy polimeryzacji sieci aktynowej w lamellipodium ocenia się w czasie odzyskiwanie fluorescencji β-aktyny znakowanej EGFP po wybieleniu. Ponieważ polimeryzacja monomerów aktyny postępuje na końcach aktywnych (barbed ends) filamentów aktynowych w lamellipodium (które wszystkie są skierowane do przodu20), sieć jest stale przemieszczana do tyłu i posuwa się do przodu; szybkości tych procesów można łatwo wyznaczyć poprzez spolaryzowany powrót fluorescencji po fotowybieleniu. Odzyskiwanie fluorescencji w lamellipodium kończy się w momencie, gdy strefa wybielona dotrze do strefy przejścia między tylną częścią lamellipodium a lamelą, która charakteryzuje się niższą gęstością wiązek filamentów ułożonych bardziej poziomo, ulegających wymianie znacznie wolniej niż w lamellipodium. Jak pokazano na Rycynie 2g, odzyskiwanie fluorescencji można wizualizować jako linię równoległą do krawędzi, przesuwającą się do tyłu w stronę lameli, co pozwala na pomiar odległości wysunięcia i przepływu retrogradacyjnego (przedstawionych oddzielnie na prawym panelu Ryciny 2g odpowiednio jako pomarańczowe i czerwone strzałki dwustronne).
Zastosowaliśmy również fotoaktywację w komórkach B16-F1 przetransfekowanych PA-GFP-actin, aby śledzić mobilność monomerów aktyny w cytozolu oraz tempo ich wbudowywania w wysuwające się lamellipodia. Jak pokazano na Rysunku 3a, b, region cytozolu został fotoaktywowany poprzez naświetlenie laserem 405 nm, podczas gdy obrazy były pozyskiwane w kanale GFP co 1,5 s w celu wizualizacji rozkładu fotoaktywowanej aktyny znakowanej GFP. Fotoaktywowaną GFP-aktynę widać dyfundującą z regionu cytozolu na Rysunku 3b. Tempo spadku intensywności fluorescencji w fotoaktywowanym regionie cytozolu przedstawiono jako procent początkowej intensywności w t0 (pierwsza klatka po fotoaktywacji; Rysunek 3c). Fotoaktywowana aktyna wbudowuje się również w końcach lamellipodiów, gdzie nowe monomery aktyny są dodawane do rosnących końców „barbed” wydłużających się filamentów aktyny podczas protruzji. Aby oszacować tempo wbudowywania w lamellipodium, mierzyliśmy w czasie intensywność fluorescencji dwuwymiarowego konturu/regionu o szerokości około 5 µm i wysokości 1 µm; region ten był stale przesuwany wraz z końcem lamellipodium w miarę jego wysuwania się. Wbudowywanie aktyny przedstawiono jako procent intensywności fluorescencji fotoaktywowanego regionu cytozolu w t0 (Rysunek 3d). W miarę postępu wydłużania filamentów aktyny, nowe monomery aktyny były wbudowywane w przednią część lamellipodium. Część tych monomerów aktyny pochodziła stochastycznie z puli cytozolowej, w której monomery zostały fotoaktywowane. Skutkuje to szybkim wzrostem fluorescencji w lamellipodiach w ciągu pierwszych 20 s po fotoaktywacji. W miarę dodawania nowych monomerów do przedniej części lamellipodium, wcześniej wbudowane monomery aktyny przemieszczają się wraz z filamentami w kierunku lamelli poprzez przepływ retrogradywny. Z czasem ROI zostaje całkowicie wypełnione fluorescencyjnymi monomerami i osiągany jest poziom plateau fluorescencji (Rysunek 3d). Następnie obserwuje się stopniowy spadek fluorescencji, gdy po dyfuzji fotoaktywowanych monomerów w całej komórce, do przedniej części lamellipodium coraz częściej dodawane są monomery aktyny niefotoaktywowane. Ten spadek fluorescencji osiągnie nowe plateau, gdy tylko w całej komórce zostanie uzyskana równowaga między monomerami fotoaktywowanymi a niefotoaktywowanymi (dane nie zostały przedstawione).
Mobilność monomerów aktyny w całej cytozolu wyznaczono poprzez pomiar intensywności fluorescencji w obszarach o jednakowej wielkości, położonych oddalenie od regionu fotoaktywnego (przedstawiono to na Rysunku 3a za pomocą regionów oznaczonych kolorami od R1 do R5). Jak pokazano na Rysunku 3e, intensywność fluorescencji w każdym z tych obszarów stopniowo maleje wraz z oddalaniem się od fotoaktywowanego regionu cytozolu, ponieważ frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny ulega coraz większemu rozcieńczeniu monomerami nieaktywowanymi (tj. niefluorescencyjnymi). Ponadto szczyt fluorescencji jest osiągany później: im dalej od regionu fotoaktywnego znajduje się mierzony obszar, tym więcej czasu potrzeba na dyfuzję monomerów aktyny do tych regionów. Reprezentatywną wartość stopnia infiltracji monomerów aktyny do każdego regionu można wyznaczyć poprzez ilościowe określenie czasu połowicznego osiągnięcia plateau fluorescencji. Im bardziej oddalony jest dany region, tym dłużej trwa dyfuzja fotoaktywowanej aktyny do niego, a w konsekwencji więcej czasu potrzeba na osiągnięcie plateau fluorescencyjnego, co ostatecznie prowadzi do wyższej wartości t1/2 (Rysunek 3e).
<img alt="Układ i proces mikroiniekcji; wstrzykiwanie materiału do komórek; wyniki obrazowania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Montaż komory obrazowania i procedura mikroiniekcji. (a) Elementy komory obrazowania. (b) Smar silikonowy jest ostrożnie nakładany wokół otworu plastikowej uszczelki. (c) Deckel jest pozycjonowany stroną z komórkami do góry w centrum otworu komory obrazowania. (d) Szczelne zamknięcie zostaje utworzone poprzez umieszczenie plastikowej uszczelki na decklu i zaciśnięcie bocznych zacisków. (e) Medium do mikroskopii jest pipetowane do szczeliny komory. (f) Komora obrazowania jest umieszczana na stole mikroskopu, detektor ciepła i elektrody są podłączone do jednostki grzewczej ustawionej na 37 °C, a komórki adaptują się przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem mikroskopii. W tym przykładzie stół mikroskopu jest również wyposażony w mikromanipulator do przeprowadzania mikroiniekcji, a igła do mikroiniekcji jest zanurzana w medium pokrywającym warstwę komórek w komorze obrazowania. (g) Fibroblast NIH3T3 jest wizualizowany przed mikroiniekcją za pomocą mikroskopii fazokontrastowej. Czerwony krzyżyk w obszarze perinuklearnym wskazuje miejsce przyszłej mikroiniekcji, które odpowiada regionowi o wysokim stężeniu cytoplazmy ze względu na bliskie sąsiedztwo masywnego jądra. (h) 10 min po mikroiniekcji Rac1 komórka reaguje wyraźnym tworzeniem lamellipodiów wokół całej obwodu komórki (wskazane zielonymi strzałkami). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza FRAP szybkości polimeryzacji aktyny; wykresy powrotu fluorescencji; obrazy mikroskopowe; obliczenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: FRAP umożliwia wyznaczenie szybkości obrotu białek lub polimeryzacji aktyny w lamelipodiach. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed fotowybieleniem wskazanego obszaru lamelipodialnego. Różnokolorowe kontury/kształty zostały oznaczone, aby wskazać, które regiony były brane pod uwagę podczas pomiarów natężenia fluorescencji w czasie. Należy zwrócić uwagę na czerwony kontur oznaczony wykrzyknikiem, który wskazuje region cytozolu znajdujący się w obszarze zawierającym liczne pęcherzyki i fałdy powierzchni komórkowej. Dynamicznych obszarów tego typu należy unikać podczas wyboru regionów referencyjnych dla fluorescencji, ponieważ charakteryzują się one silnymi krótkoterminowymi fluktuacjami fluorescencji, co może prowadzić do niedokładnych wyników. (b) Region lamelipodialny komórki wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed i po fotowybieleniu. Powrót sygnału fluorescencyjnego po fotowybieleniu w obrębie regionu zaznaczonego na fioletowo jest wizualizowany w czasie. Strzałka wskazuje wierzchołek mikrokolca, wzbogacony w VASP prawdopodobnie ze względu na wysoką gęstość polimeryzujących tam filamentów aktynowych19. (c) Przykład krzywej powrotu FRAP uzyskanej z kwantyfikacji natężenia fluorescencji fotowybielonego lamelipodium (fioletowy kontur) z punktu b. Czerwona i zielona linia po prawej stronie wskazują odpowiednio frakcję nieruchomą i ruchomą. (d) Dopasowanie krzywej powrotu FRAP z punktu c (panel lewy) oraz przykład metody obliczeniowej użytej do wyznaczenia czasu połownego powrotu (panel prawy). (e) Przykład krzywej powrotu FRAP uzyskanej poprzez uśrednienie krzywych powrotu fluorescencji z 15 komórek, gdzie słupki SEM wskazują stopień zmienności w populacji próbek. (f) Dopasowanie krzywej uzyskane poprzez uśrednienie dopasowań krzywych powrotu FRAP z 15 komórek (panel lewy) oraz przykład metody obliczeniowej użytej do wyznaczenia czasu połownego powrotu (panel prawy). (g) Panele time-lapse wysuwającego się lamelipodium komórki B16-F1 wykazującej ekspresję β-aktyny z tagiem EGFP przed i po wybieleniu wskazanego regionu lamelipodialnego, a następnie powrót fluorescencji w lamelipodium w czasie. Na panelu po prawej stronie podano zmierzone wartości odległości wysunięcia i odległości retrogradnej (odpowiednio na pomarańczowo i czerwono). Obliczenia pod panelami obrazów pokazują, w jaki sposób suma odległości wysunięcia i odległości retrogradnej jest wykorzystywana do wyznaczenia szybkości polimeryzacji sieci aktynowej lamelipodium. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej z fotoaktywacją fluorescencyjną, układ mikroskopowy. Dane dopasowania widmowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Fotoaktywacja PA-GFP-aktyny w celu śledzenia monomerów w całej komórce. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję PA-GFP-aktyny przed wywołaniem fotoaktywacji w obszarze cytozolu wskazanym przez czerwony okrąg (PA). Kontury w różnych kolorach zostały oznaczone, aby wskazać regiony, które uwzględniono w pomiarach natężenia fluorescencji w czasie. (b) Ilustracja rozkładu czasowego PA-GFP-aktyny po fotoaktywacji. Zwraca uwagę stopniowy spadek fluorescencji w fotoaktywowanym obszarze cytozolu (czerwony okrąg), w miarę jak fotoaktywowana aktyna dyfunduje z niego na zewnątrz. Ze względu na dyfuzję do przodu i włączanie w sieć, ilość fotoaktywowanych monomerów aktyny stopniowo wzrasta w lamellipodiach (region cyjanowy) oraz w całym cytozolu (regiony oznaczone różnymi kolorami) w sposób zależny od odległości i czasu. (c) Reprezentatywny spadek czasowy fluorescencji w fotoaktywowanym obszarze cytozolu (czerwony kontur na b). (d) Zmiany czasowe natężenia fluorescencji w obszarze lamellipodialnym (cyjanowy kontur na b). (e) Krzywe reprezentujące zmiany czasowe natężenia fluorescencji w obszarach cytozolu (oznaczone kolorami na b) wynikające z ich położenia w różnych odległościach od miejsca fotoaktywacji. Zauważalne jest, że okresy połowicznego osiągnięcia plateau fluorescencji (wskazane w legendzie po prawej stronie) rosną wraz z odległością danego regionu od miejsca fotoaktywacji, co prawdopodobnie koreluje ze zwiększonym czasem potrzebnym na dyfuzję monomerów aktyny do odpowiedniego obszaru. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Ogólnym celem zastosowania kombinacji technik mikromanipulacji i mikroskopii świetlnej, takich jak FRAP i fotoaktywacja, jest monitorowanie dynamiki przestrzenno-czasowej białek zaangażowanych w regulację i migrację cytoszkieletu w różnych warunkach lub w sposób zależny od szlaku sygnałowego. Omówione tutaj metody mikromanipulacji są przydatne do bezpośredniego dostarczania dowolnego rodzaju cząsteczki do komórek, a także do indukowanej światłem manipulacji aktywnością białka w określonych lokalizacjach subkomórkowych. Tak więc główną zaletą przedstawionych tutaj technik jest to, że pozwalają one określić chwilowe efekty, jakie białka wywierają na komórki, wraz ze śledzeniem ich ruchliwości w komórce.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przejść wcześniej wyhodowane komórki B16-F1 w stosunku od jednego do pięciu do trzycentymetrowego plastikowego naczynia. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Umyj komórki PBS, odessaj PBS i dodaj trypsynę EDTA, aby odłączyć komórki.Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych do trypsynizowanych komórek. Ponownie zawiesić i przenieść komórki do probówek sokoła, po tym wirowaniu z prędkością 1000 obr./min przez trzy do pięciu minut. Po umieszczeniu komórek B16-F1 w trzycentymetrowym naczyniu i pozostawieniu ich do rozprzestrzeniania się przez co najmniej sześć godzin, należy przeprowadzić transfekcję komórek B16-F1, dodając mieszaninę 500 nanogramów konstruktu DNA i jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji w roztworze zawierającym 150 milimolowy chlorek sodu.W przypadku komórek B16-F1 pokryj 15-milimetrowe szkiełka nakrywkowe 150 mikrolitrami roztworu lamininy i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku komórek NIH 3T3 pokryj szkiełka nakrywkowe roztworem fibronektyny i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć inkubowane lamininy i fibronektyny szkiełka nakrywkowe PBS, a następnie odessać PBS.Wysiew dwa mililitry fibroblastów NIH 3T3 w stosunku od jednego do 20 z naczynia zlewającego się na szkiełka nakrywkowe pokryte fibronektyną. Odpipetować dwa mililitry transfekowanych komórek B16-F1 w stosunku od 1 do 30 z naczynia zlewającego się na szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą. Następnie pozwól komórkom rozprzestrzenić się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą i fibronektyną przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed mikroskopią.Umieść szkło nakrywkowe stroną z ogniwami do góry na przewodzącej ciepło aluminiowej komorze obrazowania RC-26. Następnie umieść plastikowy uszczelniacz na wierzchu szkła nakrywkowego, aby zapewnić bezpieczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a komorą, przymocuj, przykręcając plastikowy uszczelniacz do przesuwnych zacisków komory, aby uniknąć wycieku medium. Teraz odpipetuj wstępnie podgrzaną pożywkę mikroskopową o temperaturze 37 stopni Celsjusza do centralnego obszaru.Włóż czujkę ciepła w wyznaczone miejsce w komorze i połącz elektrody komory z automatycznym regulatorem temperatury TC-324B utrzymującym stałą temperaturę 37 stopni Celsjusza. Odwirować wcześniej rozmrożony roztwór białkowy o stężeniu 10 000 G przez co najmniej 30 minut, aby usunąć agregaty białkowe, które mogą prowadzić do zatkania igły, jeśli są obecne w kapilarze mikroiniekcji. Za pomocą elastycznej końcówki pipety naładować igłę do mikroiniekcji jednym mikrolitrem roztworu białkowego od tyłu.Jeśli w końcówce igły znajdują się pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w podstawę igły, aby je usunąć. Następnie ostrożnie wyreguluj uchwyt igły na urządzeniu do mikromanipulacji. Po wkręceniu igły do mikroiniekcji w uchwyt igły, należy docisnąć igłę za pomocą ciśnieniowego urządzenia do mikroiniekcji, a następnie przenieść końcówkę igły do pożywki do hodowli komórkowych.Następnie umieść igłę w polu widzenia za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, a następnie znajdź interesującą cię komórkę i stopniowo opuszczaj igłę nad komórkę. W przypadku mikroiniekcji należy delikatnie dotknąć błony plazmatycznej komórki, co może wystarczyć do przeniknięcia do komórki lub wspomóc przejściowe pęknięcie błony poprzez bardzo delikatne dotknięcie zestawu mikroskopu. Należy przerwać proces wstrzykiwania, gdy tylko widoczny jest przepływ do komórki, przesuwając końcówkę igły do góry w pożywce.Przed wyzwoleniem lasera przełącz się na kanał GFP i zainicjuj akwizycję obrazu poklatkowego. Następnie ręcznie narysuj obszar, który ma zostać wybielony na kanale GFP, patrząc na wyświetlacz. Rozpocznij fotowybielanie za pomocą ręcznego spustu lasera 405 nanometrów co najmniej trzy do czterech klatek po rozpoczęciu akwizycji obrazu.Ustaw akwizycję obrazu GFP 488 nanometr w oprogramowaniu na 500 milisekund ekspozycji i 1500 milisekundowy interwał czasowy. Następnie dostosuj ustawienia oprogramowania do nagrywania dwukanałowych lub trzykanałowych filmów poklatkowych, zaznaczając kwadrat serii długości fal i wybierając żądaną liczbę kanałów w menu pozyskiwania długości fali. Przed wyzwoleniem lasera zainicjuj akwizycję obrazu poklatkowego i ręcznie narysuj obszar, który ma być fotoaktywowany na kanale kontrastu fazowego podczas viewwyświetlacz.Następnie zainicjuj fotoaktywację poprzez ręczne wyzwolenie lasera 405 nanometrów co najmniej trzy do czterech klatek po zainicjowaniu akwizycji obrazu. W celu analizy wyników FRAP otwórz filmy poklatkowe pochodzące z VisiView w oprogramowaniu MetaMorph. Wyznacz wartości intensywności fotobielonych obszarów dla każdego punktu czasowego odzyskiwania fluorescencji, ręcznie rysując odpowiednie obszary za pomocą MetaMorph.Narysuj kształt na czubku blaszki, który pokrywa całość lub część obszaru fotobielonego i w razie potrzeby ręcznie dostosuj jego położenie na kolejnych klatkach, aby śledzić zmiany intensywności blaszek w danym regionie w czasie podczas przemieszczenia posuwającej się końcówki. W celu korekcji tła i akwizycji fotowybielania należy przeanalizować odpowiednio obszary na zewnątrz i wewnątrz komórek. Po wybraniu obszaru zainteresowania wyodrębnij jego wartości intensywności w MetaMorph za pomocą menu mierz pomiary regionu.Upewnij się, że w menu konfiguracji wybrano opcje czasu, który upłynął i średniej intensywności. Kliknij otwórz dziennik i wybierz dynamiczną wymianę danych. Następnie kliknij OK, aby otworzyć arkusz kalkulacyjny Excela i ponownie kliknij przycisk Otwórz dziennik, aby wkleić wartości MetaMorph do Excela.Użyj wartości intensywności pochodzących z MetaMorph, aby obliczyć krzywe odzyskiwania fluorescencji FRAP, wklejając wartości intensywności do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednie formuły. Odzyskiwanie fluorescencji obszaru wybielonego fotometrem jest znormalizowane do obszarów tła i wewnątrz. Aby obliczyć czas połowicznego odzysku fluorescencji, wklej wartości krzywych odzyskiwania fluorescencji wraz z odpowiadającymi im czasami do SigmaPlot, a następnie wykonaj dopasowanie krzywej za pomocą narzędzia kreatora dynamicznego dopasowania wykładniczego wzrostu do maksimum, wybierając funkcję mono lub dwuwykładniczą w zależności od najlepszego dopasowania krzywej.Parametry uzyskane przez rozwiązanie wybranej funkcji można wkleić do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednią formułę, która pozwala obliczyć odpowiedni czas połowicznego czasu odzyskiwania w ciągu kilku sekund. Do pomiaru dyfuzji fotoaktywowanej aktyny po aktywacji, a także jej akumulacji w określonym regionie, takim jak blaszka, użyj MetaMorph, aby określić intensywność w czasie w odpowiednich regionach, a także na zewnątrz komórki, w celu określenia fluorescencji tła dla normalizacji. W celu zbadania dokładnej szybkości przemieszczania się fotoaktywowanej aktyny z dala od obszaru aktywacji lub jej szybkości włączania w blaszkę, wygeneruj krzywe fluorescencji na podstawie danych pochodzących wcześniej z MetaMorph.Wklej wartości intensywności dla obszaru tła używanego do normalizacji, fotoaktywowanego regionu cytozolowego lub obszaru blaszkowatego, który ma być badany, do arkusza kalkulacyjnego Excel zawierającego odpowiednie formuły. Pokazano tutaj obrazy kontrastu twarzy komórki fibroblastu NIH 3T3 przed i po mikrowstrzyknięciu małej GTPazy Rac1. Po około 12 minutach od mikroiniekcji komórka zmieniła swoją morfologię, co wskazuje na udane wstrzyknięcie.Recykling bielonego EGFP VASP przez niebielone cząsteczki na końcówce lamellipodium pokazano tutaj. W tym konkretnym przykładzie fluorescencja odzyskiwania plasuje się na poziomie około 80% fluorescencji przed wybielaniem. Po fotoaktywacji fotoaktywowana aktyna GFP szybko dyfunduje z obszaru cytozolowego.Frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny przemieszcza się do przodu, tworząc szybki wybuch fluorescencji w lamellipodiach. Włączenie fluorescencji jest znacznie niższe w blaszkach odległych od obszaru fotoaktywowanego, ponieważ frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny zostaje rozcieńczona nieaktywowanymi monomerami podczas ich podróży przez cytozol. Ponieważ fotoaktywowana aktyna GFP z czasem dyfunduje z obszaru fotoaktywowanego, jest stale zastępowana przez niefotoaktywowaną aktynę niefluorescencyjną.W konsekwencji obserwuje się stopniowy spadek intensywności fluorescencji tego obszaru. Z biegiem czasu blaszki w pobliżu obszaru aktywacji cytozolu szybko włączają aktynę fluorescencyjną. Następujący spadek fluorescencji jest po prostu spowodowany depolimeryzacją aktyny i dyfuzją monomerów z dala od blaszki.Tak więc, gdy eksperymenty są przeprowadzane na jednym systemie mikroskopowym, połączenie mikroiniekcji i technik FRAP lub fotoaktywacji można realistycznie przeprowadzić w ciągu kilku minut, w zależności od charakteru badanych białek. Zawsze pamiętaj, aby być szczęśliwym przed, w trakcie i po mikromanipulacji lub po ekspozycji na światło lasera. W przypadku FRAP i fotoaktywacji szczególnie ważne jest, aby wybrany region zachowywał swoją integralność strukturalną przez cały czas trwania filmu.Procedura mikroiniekcji może być uzupełniona miejscowym stosowaniem leków przenikających błonę plazmatyczną lub inhibitorów cytoszkieletu w celu przeciwdziałania natychmiastowym konsekwencjom danego leczenia na poziomie subkomórkowym. Techniki mikromanipulacji utorowały drogę do zbadania właściwości dyfuzji i dynamiki subkomórkowej składników i kompleksów cytoszkieletu oraz do zrozumienia szlaków regulujących morfogenezę komórek z drugiej ręki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić i monitorować dynamikę czasoprzestrzenną białek cytozolowych, białek włączonych do aktu wewnątrz cytoszkieletu lub znajdujących się w różnych organellach subkomórkowych, ostatecznie odkrywając kinetykę regulacji komórek.

micromanipulation-techniques-allowing-analysis-morphogenetic-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

W tym protokole opisujemy wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji oraz użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego do repozycji chromosomów w tych komórkach.

Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

Ten protokół zapewnia opartą na Fidżi, przyjazną dla użytkownika metodologię wraz z prostymi instrukcjami wyjaśniającymi, jak niezawodnie analizować zachowanie aktomiozyny w pojedynczych komórkach i zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Do korzystania z samouczka nie są wymagane żadne umiejętności programowania; wszystkie kroki są wykonywane w sposób półinteraktywny przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika Fiji i powiązanych wtyczek.

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Poznaj techniki mikromanipulacji i mikroskopii świetlnej, takie jak FRAP i fotoaktywacja, do badania dynamiki białek cytoszkieletu w żywych komórkach. Metody te umożliwiają śledzenie ruchliwości białek i ich wpływu na zachowanie komórek.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Przeglądaj więcej filmów