Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Analizator podbudowy to przyjazny dla użytkownika przepływ pracy, który przeprowadza automatyczną analizę wielu wskaźników mikroskopii procesowej. Nie oznacza to zero ton oprogramowania open source Ice, a także korzystanie z funkcji maszyny. Co ważne, ten przepływ pracy jest przystępny cenowo, aby zapewnić wiedzę o produktach i analizę obrazów.

Obrazy wielokanałowe są ładowane w ramach przepływu pracy i wstępnie przetwarzane w celu poprawy stosunku sygnału do szumu oraz usunięcia obrazowania lub defektów. Następnie segmentacja obrazu izoluje obszary zainteresowania, znane również jako ROI, od tła. Dostępnych jest kilka metod segmentacji w zależności od poziomu grupowania i charakteru obiektów zainteresowania.

Obiekty podzielone na segmenty są zapisywane z określonym deskryptorem w określonym folderze. Siła i sygnały są następnie analizowane w wierszach i wielu cechach, takich jak lokalizacja, rozmiar, kształt w teksturach gęstości, ale liczba i rozmiar są eksportowane do automatycznie utworzonego arkusza kalkulacyjnego. Pobierz Icy ze strony internetowej Icy .

Następnie pobierz Substructure Analyzer Protocol z biblioteki protokołów ICY. Otwórz Icy i kliknij narzędzia w menu wstążki. Kliknij protokoły, aby otworzyć interfejs edytora protokołów.

Kliknij na obciążenie i otwórz analizator podkonstrukcji protokołu. Ładowanie protokołu może potrwać kilka sekund. Przepływ pracy składa się z 13 bloków ogólnych, z których każdy działa jako potok złożony z kilku pól wykonujących określone podzadania.

Każdy blok lub pudełko jest ponumerowane i ma określoną rangę w ramach przepływu pracy. Klikając na ten numer, przypisz najbliższą możliwą pozycję pierwszemu do wybranego bloku. Pozycje pozostałych bloków są reorganizowane.

Klikając ikonę w lewym górnym rogu, blok można zwinąć i rozwinąć. Można go również powiększyć, zwęzić lub usunąć. Każdy potok przepływu pracy jest poprawny, powstał dzięki sieci pudełek połączonych ze sobą innymi danymi wejściowymi i wyjściowymi.

Aby utworzyć połączenie, kliknij wyjście i utrzymaj, aż kursor będzie dotyczył jakichkolwiek danych wejściowych. Połączenia można usunąć, klikając tag wyjściowy. W razie potrzeby zmień nazwy plików tak, aby sekwencje, które mają zostać scalone, miały ten sam prefiks names, po którym następuje odrębny separator.

Na przykład sekwencje poszczególnych kanałów z obrazu A noszą nazwy obrazu A podkreślenie czerwone, obraz A podkreślenie niebieskie i tak dalej. W tym samym folderze utwórz nowy folder dla każdego kanału, który chcesz scalić. Na przykład, aby scalić kanały czerwony, zielony i niebieski, utwórz trzy foldery i zapisz w nich odpowiadające im sekwencje.

Użyj tylko kanałów scalania bloków, usuń pozostałe bloki i zapisz protokół jako kanały scalania. Dostęp do skrzynek w celu ustawienia parametrów. W polu numer kanału x wybierz kanał do wyodrębnienia.

W klasycznych obrazach RGB zero oznacza kolor czerwony, jeden jest zielony, a dwa są niebieskie. W polu folder numer kanału x, ukośnik odwrotny nazwa folderu zawierającego obrazy kanału x. W pudełku oddziel kanał o numerze x.

Separator używany dla nazwy obrazu. W polu, mapa kolorów kanał o numerze x, wskaż liczbą, której kolumny modelu użyć do wizualizacji odpowiedniego kanału w Icy. W polu format scalonych obrazów wpisz rozszerzenie, aby zapisać scalone obrazy.

W lewym górnym rogu bloku scalania kanałów kliknij link bezpośrednio po prawej stronie folderu. W wyświetlonym oknie dialogowym otwórz dwukrotnie folder zawierający sekwencje pierwszego kanału, który został zdefiniowany w folderze box kanał numer jeden. Następnie kliknij otwórz, uruchom protokół.

Scalone obrazy są zapisywane w scalonym folderze w tym samym katalogu, co foldery poszczególnych kanałów. Segmentacja obiektów jest najtrudniejszym etapem w analizie obrazu. Jego wydajność decyduje o dokładności uzyskanych zadanych pomiarów.

Tak więc analizator struktury integruje zarówno proste, jak i bardziej złożone algorytmy, aby zaproponować różne alternatywy dostosowane do złożoności obrazu i potrzeb użytkownika. Jeśli obiekty nie stykają się ze sobą, inny użytkownik nie musi indywidualnie rozróżniać zgrupowanych obiektów za pomocą segmentacji bloku A.Gdy obiekty nie stykają się ze sobą, ale niektóre z nich znajdują się w bliskiej odległości, należy użyć segmentacji bloku B.Dla obiektów o wysokim poziomie skupienia i wypukłym kształcie, należy użyć segmentacji bloku C.Jeśli obiekty mają wysoki poziom grupowania i nieregularne kształty, użyj segmentacji blokowej D.Użyj segmentacji blokowej w cytoplazmie klastrowej, aby podzielić cytoplazmę dotykającą się indywidualnie, używając segmentowanych jąder jako markerów. Blok adaptacyjny do segmentacji obiektów pierwotnych może być przetwarzany niezależnie, dzięki czemu kilka bloków może być używanych w tym samym przebiegu do porównania ich wydajności dla określonej konstrukcji nośnej lub do segmentacji różnych typów podkonstrukcji.

Dla zobrazowania segmentacji wybrano segmentację blokową B, która będzie pasować do większej liczby zagadnień. Aby korzystać z tego bloga. Najpierw połącz go z wybranym folderem.

Następnie wywołuje sygnał kanału ustawia kanał obiektu na segment. Na przykład, aby odpowiadać B, w polu HK oznacza, ustaw parametr klas intensywności oraz przybliżone minimalne i maksymalne rozmiary obiektów do wykrycia w pikselach. W przypadku klas intensywności wartość dwa spowoduje sklasyfikowanie pikseli w dwóch klasach: tle i pierwszym planie.

W ten sposób dostosowuje się, gdy kontrast między obiektami a tłem jest wysoki. Jeśli obiekty pierwszego planu mają swoje początki, intensywność lub kontrast z tłem jest niski, zwiększ liczbę klas. Aktywne kontury w polu optymalizują wykrywanie granic obiektów.

Podczas tego procesu zostanie utworzony folder do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty. W polu tekstowym nazwij ten folder, na przykład segmentowanie jąder. Aby ustawić format zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty, wypełnij format pola obrazów obiektów podzielonych na segmenty, uruchom protokół.

Folder zostanie utworzony w folderze zawierającym scalone obrazy. Opracowano różne bloki, aby dostosować się do liczby praw oraz kanałów i przedziałów komórek, które mają być analizowane w obiektach podzielonych na segmenty. W poniższym przykładzie do analizy wybierz blokową analizę fluorescencyjną P. Dwa kanały w tej samej komorze i połącz go z wybranym folderem.

Blok segmentacji powinien zostać przetworzony przed tą analizą, ustawić parametry folderu skrzynki odbiorczej, obrazy ROI, wpisać nazwę folderu zawierającego obrazy segmentowanych obiektów poprzedzone odwrotnym ukośnikiem. Format skrzynki odbiorczej obrazów obiektów podzielonych na segmenty, wpisz format używany do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty. Usuń obramowania skrzynki odbiorczej, aby usunąć oba obiekty.

W przeciwnym razie, w tej chwili, aby korzystać z tej funkcji, wymagana jest instalacja bardziej kompletnej kolekcji obrazowania J. W skrzynkach kanałuj sygnał punktowy, ustaw kanał, w którym mają być wykrywane spoty. W klasycznych obrazach RTP zero jest czerwone, jeden jest zielony, a dwa jest niebieski.

W polu nazwa zlokalizowanej cząsteczki wpisz nazwę cząsteczki lokalizującej się w plamach. Liczba pól, na które należy odpowiedzieć, zależy od liczby cząsteczek. W polach długości fal na blok detektora ustaw parametry wykrywania punktów dla każdego kanału z osobna.

Aby przetworzyć różne bloki w pomieszczeniu, zachowaj połączenia wybranych bloków z folderem wyboru bloku. Upewnij się, że ich ranga znajduje się poniżej dobrego przetwarzania przepływu pracy. Przed uruchomieniem przepływu pracy zaleca się również usunięcie nieużywanych bloków i zapisanie nowego protokołu pod inną nazwą.

Kliknij uruchom, aby uruchomić przepływ pracy. Po otwarciu oczu pojawiają się książki. Kliknij dwukrotnie folder zawierający obrazy pielęgniarki, a następnie kliknij Otwórz, przepływ pracy zostanie uruchomiony automatycznie.

Jeśli przetwarzanie zostanie zakończone, w prawym dolnym rogu pojawi się komunikat, który został pomyślnie wykonany, wszystkie bloki zostaną oznaczone zielonym znakiem. Jeśli nie, blok i wewnętrzne pole przedstawiające znak strzałki będą wskazywać prawidłowe elementy. Co ważne, kilka wyświetlaczy pozwala na wizualizację wyników pośrednich podczas każdego przebiegu w celu kontroli przetwarzania.

Szybkość, elastyczność i funkcjonalność tego przepływu pracy będą ograniczone do różnych przykładów. W tym pierwszym przykładzie analizujemy translokację jądrową NF kappa B. Po symulacji ze wzrostem stężeń TNF alfa. Jądra i cytoplazmę wyznaczono za pomocą segmentacji bloków C i E.

Rozkwit sygnału NF kappa B analizowano za pomocą bloku globalnej analizy translokacji. Ponad 40 000 komórek na 96 obrazach zostało przeanalizowanych w ciągu 26 minut. Uzyskane dane wykorzystano do wyznaczenia tej krzywej odpowiedzi na dawkę, pokazującej indukcję translokacji jądrowej NF Kappa B przez TNF alfa.

Przepływ pracy może być również używany do wykrywania rozmiaru pliku i wyodrębniania określonych informacji o ich funkcjach. W tym przypadku właściwości w poszczególnych komórkach zostały wykryte poprzez lokalizację EDC dla białka. Jądra w cytoplazmie wyznaczono za pomocą bloków segmentacji A i E.

EDC4 analizowano za pomocą bloków analizy fluorescencyjnej C.In tym przykładzie w obu analizowanych komórkach wykryto cytoplazmatyczny znak EDC4. Rozmiar w pikselach każdej pełnej strony jest podany w arkuszu kalkulacyjnym. W tym przykładzie wykorzystaliśmy wszechstronność przepływu pracy do badania węglowodanów i dłuższej kinetyki stresu oksydacyjnego.

Znak siły jądrowej cewki są głównymi składnikami strukturalnymi węglowodanów Ich liczbę i wielkość analizowano w zależności od wielkości, stanu naprężeń, ocenianych za pomocą pęknięć dwuniciowych zlokalizowanych za pomocą 53BP1. Jądra zostały wyznaczone za pomocą proxy segmentacji, siły jądrowej oraz sygnałów koilliny i 53BP1, były jednocześnie analizowane za pomocą analizy fluorescencyjnej Block B. Korzystając z danych z 2300 pojedynczych komórek, udowodniliśmy znaczny wzrost liczby miejsc Greenfield po indukcji stresu związany ze spadkiem ich rozmiaru. Dane te silnie sugerują, że stres oksydacyjny zmienia moc zarodkowania węglowodanów przy użyciu jądrowego rozkładu plazmy na liczbę mniejszych jądrów jądrowych na miejsce, aby uzasadnić zmianę ekspresji cewki, może zmienić jej lokalizację i zmienić zarodkowanie ciał krzywej.

Egzogenne białko fuzyjne cewki GFP uległo nadekspresji. Cechy naszych ciał analizowano pod kątem poziomu nadekspresji cewki GFP. Jądra wyznaczono za pomocą bloku segmentacyjnego A. Sygnały fluorescencyjne cewki i cewki GFP analizowano jednocześnie za pomocą bloku analizy fluorescencji B. Poziom nadekspresji cewki GFP znalazł odzwierciedlenie w gęstości znaczeniowej sygnału GFP w poszczególnych jądrach.

Dane wygenerowane przez analizator podstruktury pokazują, że cewka GFP w nadekspresji istotnie zwiększa wielkość i liczbę węglowodanów. Ponieważ stres oksydacyjny zwiększa liczbę węglowodanów, ale zmniejsza ich wielkość. Dane te mogą odzwierciedlać, że wpływ stresu oksydacyjnego na strukturę węglowodanów jest najprawdopodobniej wywołany zmianą ich składu, a nie wpływem na pewną ilość cewki.

Tak więc analizator struktury jest wysoce modułowym przepływem pracy do analizy obrazu biologicznego. Można go dostosować do kilku kontekstów, od prostego łączenia kanałów po kwantyfikację wielu pięter i sygnałów w tysiącach komórek. Integruje również proste i złożone algorytmy segmentacji w zależności od złożoności obrazu i automatyzuje ekstrakcję cech sygnału fluorescencyjnego.