Name: Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Poznaj przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do automatycznej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Wykorzystuje otwarte oprogramowanie Icy i umożliwia szybką segmentację oraz pomiar wielu parametrów komórkowych bez zaawansowanej wiedzy z zakresu analizy obrazów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.H. był wspierany przez stypendium dla absolwentów z Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. był wspierany przez stypendium dla absolwentów z Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), podczas gdy Q.T. był wspierany przez grant publiczny nadzorowany przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) w ramach drugiego programu "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (odniesienie: ANR-15-RHU4570004). Prace te zostały sfinansowane przez CNRS i Université de Lorraine (UMR 7365).

<ol><li>Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolved+fluorescence+microscopy%3A+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig%2C+Stefan+Hell%2C+and+William+E.+Moerner%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li>
<li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imagining+the+future+of+bioimage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li>
<li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47(2004).</li>
<li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+on+image+segmentation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+Computer+Science%22%5BJournal%5D)">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li>
<li>Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018).</li>
<li>Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014).</li>
<li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li>
<li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+Cell+Senescence%2C+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127(2016).</li>
<li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li>
<li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2%CE%B2+%28SFRS10%29+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390(2016).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100(2006).</li>
<li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+3.0%3A+Next-generation+image+processing+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępnych jest coraz więcej bezpłatnych narzędzi programowych do analizy obrazów komórek fluorescencyjnych. Użytkownicy muszą prawidłowo wybrać odpowiednie oprogramowanie w zależności od złożoności problemu, wiedzy na temat przetwarzania obrazu oraz czasu, jaki chcą poświęcić na analizę. Icy, CellProfiler lub ImageJ/Fiji to potężne narzędzia łączące w sobie zarówno użyteczność, jak i funkcjonalność3. Icy to samodzielne narzędzie, które prezentuje przejrzysty graficzny interfejs użytkownika (GUI),...

Mikroskopia świetlna, a dokładniej mikroskopia fluorescencyjna, są solidnymi i wszechstronnymi technikami powszechnie stosowanymi w naukach biologicznych. Dają one dostęp do precyzyjnej lokalizacji różnych biomolekuł, takich jak białka lub RNA, poprzez ich specyficzne znakowanie fluorescencyjne. Ostatnia dekada charakteryzowała się szybkim postępem w technologiach mikroskopii i obrazowania, czego dowodem jest Nagroda Nobla w dziedzinie chemii w 2014 r., przyznana Ericowi Betzigowi, Stefanowi W. Hellowi i Williamowi E. Moernerowi za rozwój superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej (SRFM)1. SFRM omija granicę dyfrakcji tradycyjnej mikroskopii optycznej, aby przenieść ją do nanowymiaru. Udoskonalenie technik, takich jak obrazowanie na żywo lub wysokoprzepustowe badania przesiewowe, również zwiększa ilość i złożoność danych do przetwarzania dla każdego eksperymentu. W większości przypadków naukowcy mają do czynienia z wysoce heterogenicznymi populacjami komórek i chcą analizować fenotypy na poziomie pojedynczej komórki.
Początkowo analizy, takie jak liczenie ognisk, były wykonywane na oko, co jest preferowane przez niektórych badaczy, ponieważ zapewnia pełną wizualną kontrolę nad procesem liczenia. Jednak ręczna analiza takich danych jest zbyt czasochłonna, prowadzi do zmienności między obserwatorami i nie daje dostępu do bardziej złożonych funkcji, dlatego podejścia wspomagane komputerowo stają się powszechnie stosowane i prawie nieuniknione2. Metody informatyczne bioobrazowe znacznie zwiększają efektywność analizy danych i są wolne od nieuniknionego subiektywizmu operatora i potencjalnej stronniczości ręcznej analizy liczenia. Zwiększony popyt w tej dziedzinie oraz poprawa mocy komputerów doprowadziły do rozwoju dużej liczby platform do analizy obrazu. Niektóre z nich są ogólnodostępne i dają dostęp do różnych narzędzi do wykonywania analiz za pomocą komputerów osobistych. Niedawno ustalono klasyfikację narzędzi otwartego dostępu3 i przedstawia Icy4 jako potężne oprogramowanie łączące użyteczność i funkcjonalność. Co więcej, Icy ma tę zaletę, że komunikuje się z ImageJ.
Dla użytkowników bez doświadczenia w analizie obrazów, głównymi przeszkodami są wybór odpowiedniego narzędzia zgodnie z problematycznymi i poprawnie dostrojonymi parametrami, które często nie są dobrze zrozumiałe. Co więcej, czas konfiguracji jest często długi. Icy proponuje przyjazny dla użytkownika interfejs typu "wskaż i kliknij" o nazwie "Protokoły" do rozwijania przepływu pracy poprzez połączenie niektórych wtyczek znajdujących się w wyczerpującym zbiorze4. Elastyczna modułowa konstrukcja i interfejs typu "wskaż i kliknij" sprawiają, że konfiguracja analizy jest możliwa dla osób niebędących programistami. Tutaj przedstawiamy przepływ pracy o nazwie Substructure Analyzer, opracowany w interfejsie Icy, którego funkcją jest analiza sygnałów fluorescencyjnych w określonych przedziałach komórkowych i pomiar różnych cech, takich jak jasność, liczba ognisk, rozmiar ognisk i rozkład przestrzenny. Ten przepływ pracy dotyczy kilku problemów, takich jak kwantyfikacja translokacji sygnału, analiza transfekowanych komórek wyrażających fluorescencyjny reporter lub analiza ognisk z różnych podstruktur komórkowych w poszczególnych komórkach. Umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu obrazów, a wyniki wyjściowe są eksportowane do arkusza rozdzielanego tabulatorami, który można otworzyć w powszechnie używanych programach do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
Potok analizatora podstruktury jest przedstawiony w Rysunek 1. Po pierwsze, wszystkie obrazy zawarte w określonym folderze są wstępnie przetwarzane, aby poprawić ich stosunek sygnału do szumu. Ten krok zwiększa wydajność kolejnych kroków i skraca czas działania. Następnie identyfikowane i segmentowane są obszary zainteresowania (ROI), odpowiadające obszarom obrazu, w których powinien zostać wykryty sygnał fluorescencyjny. Na koniec sygnał fluorescencyjny jest analizowany, a wyniki są eksportowane do arkusza rozdzielanego tabulatorami.
Segmentacja obiektów (wykrywanie granic) jest najtrudniejszym krokiem w analizie obrazu, a jej skuteczność decyduje o dokładności wynikowych pomiarów komórek. Pierwszymi obiektami zidentyfikowanymi na obrazie (zwanymi obiektami pierwotnymi) są często jądra z obrazów barwionych DNA (barwienie DAPI lub Hoechsta), chociaż obiektami pierwotnymi mogą być również całe komórki, koraliki, plamki, guzy lub jakiekolwiek barwione obiekty. W większości obrazów biologicznych komórki lub jądra stykają się ze sobą lub nakładają się na siebie, co powoduje awarię prostych i szybkich algorytmów. Do tej pory żaden uniwersalny algorytm nie jest w stanie przeprowadzić idealnej segmentacji wszystkich obiektów, głównie dlatego, że ich cechy (rozmiar, kształt lub tekstura) modulują efektywność segmentacji5. Narzędzia do segmentacji powszechnie dystrybuowane z oprogramowaniem do mikroskopii (takie jak MetaMorph Imaging Software firmy Molecular Devices6 lub oprogramowanie NIS-Elements Advances Research firmy Nikon7) są na ogół oparte na standardowych technikach, takich jak dopasowywanie korelacji, progowanie lub operacje morfologiczne. Chociaż te nadmiernie uogólnione metody są skuteczne w podstawowych systemach, szybko pojawiają ograniczenia, gdy są używane w trudniejszych i bardziej szczegółowych kontekstach. Rzeczywiście, segmentacja jest bardzo wrażliwa na parametry eksperymentalne, takie jak typ komórki, gęstość komórek lub biomarkery, i często wymaga wielokrotnej korekty dla dużego zestawu danych. Przepływ pracy Substructure Analyzer integruje zarówno proste, jak i bardziej wyrafinowane algorytmy, aby zaproponować różne alternatywy dostosowane do złożoności obrazu i potrzeb użytkownika. W szczególności proponuje algorytm zlewiska oparty na znacznikach8 dla silnie zgrupowanych obiektów. Skuteczność tej metody segmentacji opiera się na doborze indywidualnych znaczników na każdym obiekcie. Znaczniki te są w większości przypadków wybierane ręcznie, aby uzyskać prawidłowe parametry dla pełnej segmentacji, co jest bardzo czasochłonne, gdy użytkownicy mają do czynienia z dużą liczbą obiektów. Substructure Analyzer proponuje automatyczne wykrywanie tych markerów, zapewniając wysoce wydajny proces segmentacji. Segmentacja jest w większości przypadków granicznym etapem analizy obrazu i może znacznie modyfikować czas przetwarzania w zależności od rozdzielczości obrazu, liczby obiektów na obrazie i poziomu grupowania obiektów. Typowe potoki wymagają od kilku sekund do 5 minut na obraz na standardowym komputerze stacjonarnym. Analiza bardziej złożonych obrazów może wymagać mocniejszego komputera i podstawowej wiedzy z zakresu analizy obrazu.
Elastyczność i funkcjonalność tego przepływu pracy są zilustrowane różnymi przykładami w reprezentatywnych wynikach. Korzyści płynące z tego przepływu pracy są w szczególności widoczne w badaniu podstruktur jądrowych w warunkach stresu oksydacyjnego (OS). OS odpowiada nierównowadze homeostazy redoks na korzyść utleniaczy i jest związane z wysokimi poziomami reaktywnych form tlenu (ROS). Ponieważ ROS działają jako cząsteczki sygnałowe, zmiany w ich stężeniu i lokalizacji subkomórkowej wpływają pozytywnie lub negatywnie na niezliczone szlaki i sieci, które regulują funkcje fizjologiczne, w tym transdukcję sygnału, mechanizmy naprawy, ekspresję genów, śmierć komórki i proliferację9,10. OS jest więc bezpośrednio zaangażowany w różne patologie (choroby neurodegeneracyjne i sercowo-naczyniowe, nowotwory, cukrzyca itp.), ale także w starzenie się komórek. Dlatego rozszyfrowanie wpływu OS na organizację i funkcję komórki ludzkiej stanowi kluczowy krok w zrozumieniu roli OS w powstawaniu i rozwoju patologii u ludzi. Ustalono, że OS reguluje ekspresję genów poprzez modulację transkrypcji za pomocą kilku czynników transkrypcyjnych (p53, Nrf2, FOXO3A)11, ale także poprzez wpływ na regulację kilku procesów ko- i potranskrypcyjnych, takich jak alternatywny splicing (AS) pre-RNAs12,13,14. Alternatywne splicowanie pierwotnych i niekodujących transkryptów jest podstawowym mechanizmem, który zwiększa zdolność kodowania genomów poprzez wytwarzanie izoform transkryptów. AS jest wykonywany przez ogromny kompleks rybonukleoproteinowy zwany spliceosomem, zawierający prawie 300 białek i 5 małych jądrowych RNA bogatych w U (UsnRNAs)15. Składanie spliceosomów i AS są ściśle kontrolowane w komórkach, a niektóre etapy dojrzewania spliceosomu zachodzą w pozbawionych błony przedziałach jądrowych zwanych ciałami Cajala. Te podstruktury jądrowe charakteryzują się dynamicznym charakterem ich struktury i składem, które są prowadzone głównie przez wielowartościowe oddziaływania ich RNA i składników białkowych z białkiem cewki. Analiza tysięcy komórek za pomocą przepływu pracy Substructure Analyzer pozwoliła na scharakteryzowanie nigdy nie opisanego wpływu OS na ciała Cajala. Rzeczywiście, uzyskane dane sugerują, że OS modyfikuje zarodkowanie ciał Cajala, indukując nukleoplazmatyczną redystrybucję białka cewki do licznych mniejszych ognisk jądrowych. Taka zmiana struktury ciał Cajala może wpływać na dojrzewanie spliceosomu i uczestniczyć w modulacji AS przez OS.

<table><tbody><tr><td>16% roztwór formaldehydu (w/v) bez metanolu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozy anty-królik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 kozy anty-myszy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21425</td><td>fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34055</td><td>fluorescencyjne przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Wzorzec albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ml</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Duolink In Situ z</td><td>podłożem montażowym</td><td>DAPI Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040-5ML</td></tr><tr><td>Człowiek: Komórki HeLa S3</td><td>IGBMC, Strasburg, Francja</td><td></td><td>linia komórkowa użyta do przeprowadzenia eksperymentów</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru 30% (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ml</td><td>stosowany jako środek stresogenny</td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 2000</td><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty-coilin</td><td>abcam</td><td>ab11822</td><td>Przeciwciało swoiste dla cewki</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Nikon Optiphot-2</td><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medium o obniżonej surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>pożywka do transfekcji</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (10x)</td> <td>gibco</td><td>70011-036</td><td>do mycia komórek</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-53BP1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-16565</td><td>Przeciwciało specyficzne dla 53BP1</td></tr><tr><td>Królicze poliklonalne przeciwciało anty-EDC4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4200114</td><td>Przeciwciało specyficzne dla EDC4</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683</td><td>do przenikania komórek</td></tr></tbody></table>

substructure analyzer: przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Ostatnia dekada charakteryzowała się przełomami w technikach mikroskopii fluorescencyjnej, zilustrowanymi poprawą rozdzielczości przestrzennej, ale także w obrazowaniu żywych komórek i technikach mikroskopii wysokoprzepustowej. Prowadziło to do stałego wzrostu ilości i złożoności danych mikroskopowych dla pojedynczego eksperymentu. Ponieważ ręczna analiza danych mikroskopowych jest bardzo czasochłonna, subiektywna i uniemożliwia przeprowadzanie analiz ilościowych, automatyzacja analizy bioobrazu staje się prawie nieunikniona. Zbudowaliśmy proces informatyczny o nazwie Substructure Analyzer, aby w pełni zautomatyzować analizę sygnału w obrazach biologicznych z mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przepływ pracy został opracowany na przyjaznej dla użytkownika platformie open source Icy i jest uzupełniony o funkcje ImageJ. Obejmuje ona wstępne przetwarzanie obrazów w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, indywidualną segmentację komórek (wykrywanie granic komórek) oraz wykrywanie/kwantyfikację ciał komórkowych wzbogaconych w określone przedziały komórkowe. Główną zaletą tego przepływu pracy jest proponowanie złożonych funkcji obrazowania biologicznego użytkownikom bez doświadczenia w analizie obrazu za pośrednictwem przyjaznego dla użytkownika interfejsu. Co więcej, jest wysoce modułowy i dostosowany do kilku zagadnień, od charakterystyki translokacji jądrowej/cytoplazmatycznej po analizę porównawczą różnych ciał komórkowych w różnych podstrukturach komórkowych. Funkcjonalność tego przepływu pracy jest zilustrowana poprzez badanie ciał Cajala (zwiniętych) w warunkach stresu oksydacyjnego (OS). Dane z mikroskopii fluorescencyjnej pokazują, że ich integralność w komórkach ludzkich ulega zmianie kilka godzin po indukcji OS. Efekt ten charakteryzuje się zmniejszeniem zarodkowania cewki do charakterystycznych ciał Cajala, związanych z nukleoplazmatyczną redystrybucją cewki do zwiększonej liczby mniejszych ognisk. Centralna rola cewki w wymianie między składnikami CB a otaczającą ją nukleoplazmą sugeruje, że indukowana przez OS redystrybucja cewkiny może wpływać na skład i funkcjonalność ciał Cajala.

Wszystkie opisane analizy zostały wykonane na standardowym laptopie (64-bitowy procesor quad-core o częstotliwości 2,80 GHz z 16 GB pamięci operacyjnej (RAM)) z wykorzystaniem 64-bitowej wersji języka Java. Pamięć operacyjna jest istotnym parametrem, który należy wziąć pod uwagę w zależności od liczby i rozdzielczości analizowanych obrazów. Stosowanie 32-bitowej wersji Javy ogranicza pamięć do około 1300 MB, co może być niewystarczające przy analizie dużych zbiorów danych, podczas gdy wersja 64-bitowa pozwala na zwiększe...

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Analizator podbudowy to przyjazny dla użytkownika przepływ pracy, który przeprowadza automatyczną analizę wielu wskaźników mikroskopii procesowej. Nie oznacza to zero ton oprogramowania open source Ice, a także korzystanie z funkcji maszyny. Co ważne, ten przepływ pracy jest przystępny cenowo, aby zapewnić wiedzę o produktach i analizę obrazów.Obrazy wielokanałowe są ładowane w ramach przepływu pracy i wstępnie przetwarzane w celu poprawy stosunku sygnału do szumu oraz usunięcia obrazowania lub defektów. Następnie segmentacja obrazu izoluje obszary zainteresowania, znane również jako ROI, od tła. Dostępnych jest kilka metod segmentacji w zależności od poziomu grupowania i charakteru obiektów zainteresowania.Obiekty podzielone na segmenty są zapisywane z określonym deskryptorem w określonym folderze. Siła i sygnały są następnie analizowane w wierszach i wielu cechach, takich jak lokalizacja, rozmiar, kształt w teksturach gęstości, ale liczba i rozmiar są eksportowane do automatycznie utworzonego arkusza kalkulacyjnego. Pobierz Icy ze strony internetowej Icy .Następnie pobierz Substructure Analyzer Protocol z biblioteki protokołów ICY. Otwórz Icy i kliknij narzędzia w menu wstążki. Kliknij protokoły, aby otworzyć interfejs edytora protokołów.Kliknij na obciążenie i otwórz analizator podkonstrukcji protokołu. Ładowanie protokołu może potrwać kilka sekund. Przepływ pracy składa się z 13 bloków ogólnych, z których każdy działa jako potok złożony z kilku pól wykonujących określone podzadania.Każdy blok lub pudełko jest ponumerowane i ma określoną rangę w ramach przepływu pracy. Klikając na ten numer, przypisz najbliższą możliwą pozycję pierwszemu do wybranego bloku. Pozycje pozostałych bloków są reorganizowane.Klikając ikonę w lewym górnym rogu, blok można zwinąć i rozwinąć. Można go również powiększyć, zwęzić lub usunąć. Każdy potok przepływu pracy jest poprawny, powstał dzięki sieci pudełek połączonych ze sobą innymi danymi wejściowymi i wyjściowymi.Aby utworzyć połączenie, kliknij wyjście i utrzymaj, aż kursor będzie dotyczył jakichkolwiek danych wejściowych. Połączenia można usunąć, klikając tag wyjściowy. W razie potrzeby zmień nazwy plików tak, aby sekwencje, które mają zostać scalone, miały ten sam prefiks names, po którym następuje odrębny separator.Na przykład sekwencje poszczególnych kanałów z obrazu A noszą nazwy obrazu A podkreślenie czerwone, obraz A podkreślenie niebieskie i tak dalej. W tym samym folderze utwórz nowy folder dla każdego kanału, który chcesz scalić. Na przykład, aby scalić kanały czerwony, zielony i niebieski, utwórz trzy foldery i zapisz w nich odpowiadające im sekwencje.Użyj tylko kanałów scalania bloków, usuń pozostałe bloki i zapisz protokół jako kanały scalania. Dostęp do skrzynek w celu ustawienia parametrów. W polu numer kanału x wybierz kanał do wyodrębnienia.W klasycznych obrazach RGB zero oznacza kolor czerwony, jeden jest zielony, a dwa są niebieskie. W polu folder numer kanału x, ukośnik odwrotny nazwa folderu zawierającego obrazy kanału x. W pudełku oddziel kanał o numerze x.Separator używany dla nazwy obrazu. W polu, mapa kolorów kanał o numerze x, wskaż liczbą, której kolumny modelu użyć do wizualizacji odpowiedniego kanału w Icy. W polu format scalonych obrazów wpisz rozszerzenie, aby zapisać scalone obrazy.W lewym górnym rogu bloku scalania kanałów kliknij link bezpośrednio po prawej stronie folderu. W wyświetlonym oknie dialogowym otwórz dwukrotnie folder zawierający sekwencje pierwszego kanału, który został zdefiniowany w folderze box kanał numer jeden. Następnie kliknij otwórz, uruchom protokół.Scalone obrazy są zapisywane w scalonym folderze w tym samym katalogu, co foldery poszczególnych kanałów. Segmentacja obiektów jest najtrudniejszym etapem w analizie obrazu. Jego wydajność decyduje o dokładności uzyskanych zadanych pomiarów.Tak więc analizator struktury integruje zarówno proste, jak i bardziej złożone algorytmy, aby zaproponować różne alternatywy dostosowane do złożoności obrazu i potrzeb użytkownika. Jeśli obiekty nie stykają się ze sobą, inny użytkownik nie musi indywidualnie rozróżniać zgrupowanych obiektów za pomocą segmentacji bloku A.Gdy obiekty nie stykają się ze sobą, ale niektóre z nich znajdują się w bliskiej odległości, należy użyć segmentacji bloku B.Dla obiektów o wysokim poziomie skupienia i wypukłym kształcie, należy użyć segmentacji bloku C.Jeśli obiekty mają wysoki poziom grupowania i nieregularne kształty, użyj segmentacji blokowej D.Użyj segmentacji blokowej w cytoplazmie klastrowej, aby podzielić cytoplazmę dotykającą się indywidualnie, używając segmentowanych jąder jako markerów. Blok adaptacyjny do segmentacji obiektów pierwotnych może być przetwarzany niezależnie, dzięki czemu kilka bloków może być używanych w tym samym przebiegu do porównania ich wydajności dla określonej konstrukcji nośnej lub do segmentacji różnych typów podkonstrukcji.Dla zobrazowania segmentacji wybrano segmentację blokową B, która będzie pasować do większej liczby zagadnień. Aby korzystać z tego bloga. Najpierw połącz go z wybranym folderem.Następnie wywołuje sygnał kanału ustawia kanał obiektu na segment. Na przykład, aby odpowiadać B, w polu HK oznacza, ustaw parametr klas intensywności oraz przybliżone minimalne i maksymalne rozmiary obiektów do wykrycia w pikselach. W przypadku klas intensywności wartość dwa spowoduje sklasyfikowanie pikseli w dwóch klasach: tle i pierwszym planie.W ten sposób dostosowuje się, gdy kontrast między obiektami a tłem jest wysoki. Jeśli obiekty pierwszego planu mają swoje początki, intensywność lub kontrast z tłem jest niski, zwiększ liczbę klas. Aktywne kontury w polu optymalizują wykrywanie granic obiektów.Podczas tego procesu zostanie utworzony folder do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty. W polu tekstowym nazwij ten folder, na przykład segmentowanie jąder. Aby ustawić format zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty, wypełnij format pola obrazów obiektów podzielonych na segmenty, uruchom protokół.Folder zostanie utworzony w folderze zawierającym scalone obrazy. Opracowano różne bloki, aby dostosować się do liczby praw oraz kanałów i przedziałów komórek, które mają być analizowane w obiektach podzielonych na segmenty. W poniższym przykładzie do analizy wybierz blokową analizę fluorescencyjną P. Dwa kanały w tej samej komorze i połącz go z wybranym folderem.Blok segmentacji powinien zostać przetworzony przed tą analizą, ustawić parametry folderu skrzynki odbiorczej, obrazy ROI, wpisać nazwę folderu zawierającego obrazy segmentowanych obiektów poprzedzone odwrotnym ukośnikiem. Format skrzynki odbiorczej obrazów obiektów podzielonych na segmenty, wpisz format używany do zapisywania obrazów obiektów podzielonych na segmenty. Usuń obramowania skrzynki odbiorczej, aby usunąć oba obiekty.W przeciwnym razie, w tej chwili, aby korzystać z tej funkcji, wymagana jest instalacja bardziej kompletnej kolekcji obrazowania J. W skrzynkach kanałuj sygnał punktowy, ustaw kanał, w którym mają być wykrywane spoty. W klasycznych obrazach RTP zero jest czerwone, jeden jest zielony, a dwa jest niebieski.W polu nazwa zlokalizowanej cząsteczki wpisz nazwę cząsteczki lokalizującej się w plamach. Liczba pól, na które należy odpowiedzieć, zależy od liczby cząsteczek. W polach długości fal na blok detektora ustaw parametry wykrywania punktów dla każdego kanału z osobna.Aby przetworzyć różne bloki w pomieszczeniu, zachowaj połączenia wybranych bloków z folderem wyboru bloku. Upewnij się, że ich ranga znajduje się poniżej dobrego przetwarzania przepływu pracy. Przed uruchomieniem przepływu pracy zaleca się również usunięcie nieużywanych bloków i zapisanie nowego protokołu pod inną nazwą.Kliknij uruchom, aby uruchomić przepływ pracy. Po otwarciu oczu pojawiają się książki. Kliknij dwukrotnie folder zawierający obrazy pielęgniarki, a następnie kliknij Otwórz, przepływ pracy zostanie uruchomiony automatycznie.Jeśli przetwarzanie zostanie zakończone, w prawym dolnym rogu pojawi się komunikat, który został pomyślnie wykonany, wszystkie bloki zostaną oznaczone zielonym znakiem. Jeśli nie, blok i wewnętrzne pole przedstawiające znak strzałki będą wskazywać prawidłowe elementy. Co ważne, kilka wyświetlaczy pozwala na wizualizację wyników pośrednich podczas każdego przebiegu w celu kontroli przetwarzania.Szybkość, elastyczność i funkcjonalność tego przepływu pracy będą ograniczone do różnych przykładów. W tym pierwszym przykładzie analizujemy translokację jądrową NF kappa B. Po symulacji ze wzrostem stężeń TNF alfa. Jądra i cytoplazmę wyznaczono za pomocą segmentacji bloków C i E.Rozkwit sygnału NF kappa B analizowano za pomocą bloku globalnej analizy translokacji. Ponad 40 000 komórek na 96 obrazach zostało przeanalizowanych w ciągu 26 minut. Uzyskane dane wykorzystano do wyznaczenia tej krzywej odpowiedzi na dawkę, pokazującej indukcję translokacji jądrowej NF Kappa B przez TNF alfa.Przepływ pracy może być również używany do wykrywania rozmiaru pliku i wyodrębniania określonych informacji o ich funkcjach. W tym przypadku właściwości w poszczególnych komórkach zostały wykryte poprzez lokalizację EDC dla białka. Jądra w cytoplazmie wyznaczono za pomocą bloków segmentacji A i E.EDC4 analizowano za pomocą bloków analizy fluorescencyjnej C.In tym przykładzie w obu analizowanych komórkach wykryto cytoplazmatyczny znak EDC4. Rozmiar w pikselach każdej pełnej strony jest podany w arkuszu kalkulacyjnym. W tym przykładzie wykorzystaliśmy wszechstronność przepływu pracy do badania węglowodanów i dłuższej kinetyki stresu oksydacyjnego.Znak siły jądrowej cewki są głównymi składnikami strukturalnymi węglowodanów Ich liczbę i wielkość analizowano w zależności od wielkości, stanu naprężeń, ocenianych za pomocą pęknięć dwuniciowych zlokalizowanych za pomocą 53BP1. Jądra zostały wyznaczone za pomocą proxy segmentacji, siły jądrowej oraz sygnałów koilliny i 53BP1, były jednocześnie analizowane za pomocą analizy fluorescencyjnej Block B. Korzystając z danych z 2300 pojedynczych komórek, udowodniliśmy znaczny wzrost liczby miejsc Greenfield po indukcji stresu związany ze spadkiem ich rozmiaru. Dane te silnie sugerują, że stres oksydacyjny zmienia moc zarodkowania węglowodanów przy użyciu jądrowego rozkładu plazmy na liczbę mniejszych jądrów jądrowych na miejsce, aby uzasadnić zmianę ekspresji cewki, może zmienić jej lokalizację i zmienić zarodkowanie ciał krzywej.Egzogenne białko fuzyjne cewki GFP uległo nadekspresji. Cechy naszych ciał analizowano pod kątem poziomu nadekspresji cewki GFP. Jądra wyznaczono za pomocą bloku segmentacyjnego A. Sygnały fluorescencyjne cewki i cewki GFP analizowano jednocześnie za pomocą bloku analizy fluorescencji B. Poziom nadekspresji cewki GFP znalazł odzwierciedlenie w gęstości znaczeniowej sygnału GFP w poszczególnych jądrach.Dane wygenerowane przez analizator podstruktury pokazują, że cewka GFP w nadekspresji istotnie zwiększa wielkość i liczbę węglowodanów. Ponieważ stres oksydacyjny zwiększa liczbę węglowodanów, ale zmniejsza ich wielkość. Dane te mogą odzwierciedlać, że wpływ stresu oksydacyjnego na strukturę węglowodanów jest najprawdopodobniej wywołany zmianą ich składu, a nie wpływem na pewną ilość cewki.Tak więc analizator struktury jest wysoce modułowym przepływem pracy do analizy obrazu biologicznego. Można go dostosować do kilku kontekstów, od prostego łączenia kanałów po kwantyfikację wielu pięter i sygnałów w tysiącach komórek. Integruje również proste i złożone algorytmy segmentacji w zależności od złożoności obrazu i automatyzuje ekstrakcję cech sygnału fluorescencyjnego.

substructure-analyzer-user-friendly-workflow-for-rapid-exploration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Opisano metodę wysokoprzepustowego screeningu służącą do identyfikacji nowych kompetentnych sygnałowo receptorów błonowych. Metoda ta nadaje się do automatyzacji na dużą skalę i pozwala na przewidywanie wiązania białek in vivo oraz subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Tutaj opisujemy protokół automatycznej segmentacji fluorescencyjnie znakowanych tkanek na szkiełkach przy użyciu systemu analizy o wysokiej zawartości (WHCAS) o szerokim polu. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach, które obejmują ilościowe oznaczanie markerów fluorescencyjnych w tkankach biologicznych, w tym w naukach biologicznych, inżynierii medycznej i naukach o zdrowiu.

Zautomatyzowane skanowanie i segmentacja szkiełek w tkankach znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu szerokokątnego systemu analizy o wysokiej zawartości

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Obecne metody analizy dynamiki wewnątrzkomórkowej spolaryzowanych pojedynczych komórek są często ręczne i brakuje im standaryzacji. Niniejszy manuskrypt wprowadza nowatorski potok analizy obrazu do automatyzacji ekstrakcji linii środkowej pojedynczych spolaryzowanych komórek i ilościowego określania zachowań czasoprzestrzennych na podstawie upływu czasu w przyjaznym dla użytkownika interfejsie online.

AMEBaS: Automatyczna ekstrakcja linii środkowej i odejmowanie tła poklatkowych fluorescencji ratiometrycznej spolaryzowanych pojedynczych komórek

Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.

Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Poznaj przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do automatycznej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Wykorzystuje otwarte oprogramowanie Icy i umożliwia szybką segmentację oraz pomiar wielu parametrów komórkowych bez zaawansowanej wiedzy z zakresu analizy obrazów.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów