AMEBaS: Automatyczna ekstrakcja linii środkowej i odejmowanie tła poklatkowych fluorescencji ratiometrycznej spolaryzowanych pojedynczych komórek

Metoda ta określa ilościowo dynamikę czasoprzestrzenną spolaryzowanych komórek wzdłuż ich linii środkowej, wyrażających fluorescencyjny reporter lub barwnik dla określonej jednostki będącej przedmiotem zainteresowania, takiej jak aktyna, jony lub dynamika pęcherzyków. Wersja automatyzacji eliminuje uprzedzenia i umożliwia skalowalność, szczególnie w przypadku zadań, które są wykonywane cyfrowo ręcznie i mogą stać się czasochłonne i subiektywne. Aby rozpocząć, otwórz Jupyter Notebook i przeczytaj pliki poklatkowe, uzyskując dostęp do strony głównej interaktywnego notatnika Google CoLab lub pobierając i otwierając AMEBaS_local IP YNB z GitHub.

Aby przygotować konfigurację katalogu dla danych wejściowych i wyjściowych przy użyciu wersji lokalnej, umieść fluorescencyjny film poklatkowy jako plik TIF lub DV w folderze o nazwie data znajdującym się w folderze głównym programu. Utwórz folder wyjściowy, aby odebrać wygenerowane dane, a następnie uruchom blok kodu konfiguracji. Jeśli korzystasz z notatnika w Google CoLab, wykonaj blok kodu konfiguracji, aby automatycznie wygenerować dane i foldery wyjściowe, a następnie uruchom blok kodu wejściowego pliku, aby odczytać dane poklatkowe, klikając przycisk odtwarzania.

Jeśli korzystasz z Google CoLab, prześlij plik poklatkowy do folderu danych, klikając przycisk wyboru pliku. Następnie wybierz opcję generowania dodatkowych danych wyjściowych dla każdego kroku, ustawiając parametr verbose na true lub false. Aby wykryć główną komórkę i segment w tle, uruchom blok kodu segmentacji pojedynczej komórki, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie oddzielić interesującą komórkę od tła.

Dostosuj wartość sigma w zmiennej sigma, aby precyzyjnie dostroić gładkość maski segmentacji. Wartość domyślna to 2,0. Teraz ustaw oszacowanie zmiennej na false w celu przechowywania progu oszacowanego bezpośrednio na podstawie danych ISO lub true w celu wygładzenia go w sąsiednich ramkach przy użyciu lokalnej regresji wielomianowej.

Dostosuj zmienną n_points, aby dostroić funkcję z wartością domyślną 40. Aby prześledzić linię środkową wzdłuż przedłużenia komórki, uruchom blok kodu śledzenia linii środkowej komórki, klikając przycisk odtwarzania, aby szkieletować komórkę za pomocą metody Lee i przedłużyć końcówkę ostatniego szkieletu za pomocą ekstrapolacji liniowej. Następnie wybierz opcję śledzenia dla linii środkowej, dostosowując argument complete_skeletonization tak, aby śledził ostatnią klatkę lub raz na klatkę.

Dostosuj zmienną interpolation_fraction, aby ustawić ułamek punktów w szkielecie do interpolacji podczas ekstrapolacji. Wartość domyślna to 0,25. Następnie zmodyfikuj zmienną extrapolation_length, aby określić długość ekstrapolacji linii środkowej.

Wartość domyślna to minus jeden, co powoduje wydłużenie szkieletu do najbliższej krawędzi. Teraz uruchom pierwszy blok kodu wizualizacji danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować kimografy dla obu kanałów. Wybierz rozmiar jądra Gaussa do wygładzenia, dostosowując kymograph_kernel zmiennej.

Aby prawidłowo wyświetlić intensywności niewydłużonych szkieletów, potrzebna jest niestandardowa mapa kolorów dla ich kimogramów z limitem. Dostosuj zmienną shift_fraction, aby wybrać ułamek procentowy intensywności, który zostanie wyznaczony jako kolor tła,. Następnie uruchom drugi blok kodu wizualizacji danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować wskaźnik metryczny, kinograf i film poklatkowy.

Dostosuj zmienną switch_ratio, aby zmienić kolejność kanałów używanych jako licznik i mianownik podczas obliczeń współczynnika, przy czym wartość domyślna to false. Sprawdź, czy upływ czasu proporcji wymaga dodatkowego wygładzenia za pomocą filtra mediany, dostosowując smooth_ratio zmienną. Domyślnie jest to wartość false.

Następnie wybierz usunięcie lub pozostawienie wartości odstających wynikających ze słabego sygnału w kanale mianownika, dostosowując zmienną reject_outliers. Wartości odstające są oznaczane jako wartości 1,5-krotnie większe od przedziału międzykwartylowego powyżej trzeciego kwartyla. Na koniec wybierz, czy dane wyjściowe metryki tła i współczynnika mają zostać wyeksportowane, dostosowując background_ratio zmiennej.

Wartość domyślna to false, aby zastąpić tło zerami. AMEBaS testowany na zestawach danych, takich jak łagiewki pyłkowe wyrażające reporter wapnia cameleon, łagiewki pyłkowe wyrażające wskaźnik pH florin, włośniki wyrażające reporter wapnia NESYC 3.6 działały pomyślnie pomimo różnic w kierunku wzrostu, technikach obrazowania, reporterach fluorescencyjnych i typach komórek. Pamiętaj, aby wykonać zestaw bloków, aby móc zainstalować wymagane pakiety.

Ponadto ważne jest, aby dostosować wartości sigma specjalnie do swoich obrazów, aby uzyskać dokładniejsze wyniki. Uzyskane w ten sposób kimografy można następnie wykorzystać do analizy czasoprzestrzennej dynamiki zainteresowania rozwiązaniem. Dodatkowo możesz go obliczyć, znajdując metodę znajdowania, wzrost i szeregi czasowe, aby przeanalizować właściwe rozwiązanie.