AMEBaS: Automatyczna ekstrakcja linii środkowej i odejmowanie tła poklatkowych fluorescencji ratiometrycznej spolaryzowanych pojedynczych komórek
23 czerwca 2023
Obecne metody analizy dynamiki wewnątrzkomórkowej spolaryzowanych pojedynczych komórek są często ręczne i brakuje im standaryzacji. Niniejszy manuskrypt wprowadza nowatorski potok analizy obrazu do automatyzacji ekstrakcji linii środkowej pojedynczych spolaryzowanych komórek i ilościowego określania zachowań czasoprzestrzennych na podstawie upływu czasu w przyjaznym dla użytkownika interfejsie online.
Metoda ta określa ilościowo dynamikę czasoprzestrzenną spolaryzowanych komórek wzdłuż ich linii środkowej, wyrażających fluorescencyjny reporter lub barwnik dla określonej jednostki będącej przedmiotem zainteresowania, takiej jak aktyna, jony lub dynamika pęcherzyków. Wersja automatyzacji eliminuje uprzedzenia i umożliwia skalowalność, szczególnie w przypadku zadań, które są wykonywane cyfrowo ręcznie i mogą stać się czasochłonne i subiektywne. Aby rozpocząć, otwórz Jupyter Notebook i przeczytaj pliki poklatkowe, uzyskując dostęp do strony głównej interaktywnego notatnika Google CoLab lub pobierając i otwierając AMEBaS_local IP YNB z GitHub.
Aby przygotować konfigurację katalogu dla danych wejściowych i wyjściowych przy użyciu wersji lokalnej, umieść fluorescencyjny film poklatkowy jako plik TIF lub DV w folderze o nazwie data znajdującym się w folderze głównym programu. Utwórz folder wyjściowy, aby odebrać wygenerowane dane, a następnie uruchom blok kodu konfiguracji. Jeśli korzystasz z notatnika w Google CoLab, wykonaj blok kodu konfiguracji, aby automatycznie wygenerować dane i foldery wyjściowe, a następnie uruchom blok kodu wejściowego pliku, aby odczytać dane poklatkowe, klikając przycisk odtwarzania.
Jeśli korzystasz z Google CoLab, prześlij plik poklatkowy do folderu danych, klikając przycisk wyboru pliku. Następnie wybierz opcję generowania dodatkowych danych wyjściowych dla każdego kroku, ustawiając parametr verbose na true lub false. Aby wykryć główną komórkę i segment w tle, uruchom blok kodu segmentacji pojedynczej komórki, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie oddzielić interesującą komórkę od tła.
Dostosuj wartość sigma w zmiennej sigma, aby precyzyjnie dostroić gładkość maski segmentacji. Wartość domyślna to 2,0. Teraz ustaw oszacowanie zmiennej na false w celu przechowywania progu oszacowanego bezpośrednio na podstawie danych ISO lub true w celu wygładzenia go w sąsiednich ramkach przy użyciu lokalnej regresji wielomianowej.
Dostosuj zmienną n_points, aby dostroić funkcję z wartością domyślną 40. Aby prześledzić linię środkową wzdłuż przedłużenia komórki, uruchom blok kodu śledzenia linii środkowej komórki, klikając przycisk odtwarzania, aby szkieletować komórkę za pomocą metody Lee i przedłużyć końcówkę ostatniego szkieletu za pomocą ekstrapolacji liniowej. Następnie wybierz opcję śledzenia dla linii środkowej, dostosowując argument complete_skeletonization tak, aby śledził ostatnią klatkę lub raz na klatkę.
Dostosuj zmienną interpolation_fraction, aby ustawić ułamek punktów w szkielecie do interpolacji podczas ekstrapolacji. Wartość domyślna to 0,25. Następnie zmodyfikuj zmienną extrapolation_length, aby określić długość ekstrapolacji linii środkowej.
Wartość domyślna to minus jeden, co powoduje wydłużenie szkieletu do najbliższej krawędzi. Teraz uruchom pierwszy blok kodu wizualizacji danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować kimografy dla obu kanałów. Wybierz rozmiar jądra Gaussa do wygładzenia, dostosowując kymograph_kernel zmiennej.
Aby prawidłowo wyświetlić intensywności niewydłużonych szkieletów, potrzebna jest niestandardowa mapa kolorów dla ich kimogramów z limitem. Dostosuj zmienną shift_fraction, aby wybrać ułamek procentowy intensywności, który zostanie wyznaczony jako kolor tła,. Następnie uruchom drugi blok kodu wizualizacji danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować wskaźnik metryczny, kinograf i film poklatkowy.
Dostosuj zmienną switch_ratio, aby zmienić kolejność kanałów używanych jako licznik i mianownik podczas obliczeń współczynnika, przy czym wartość domyślna to false. Sprawdź, czy upływ czasu proporcji wymaga dodatkowego wygładzenia za pomocą filtra mediany, dostosowując smooth_ratio zmienną. Domyślnie jest to wartość false.
Następnie wybierz usunięcie lub pozostawienie wartości odstających wynikających ze słabego sygnału w kanale mianownika, dostosowując zmienną reject_outliers. Wartości odstające są oznaczane jako wartości 1,5-krotnie większe od przedziału międzykwartylowego powyżej trzeciego kwartyla. Na koniec wybierz, czy dane wyjściowe metryki tła i współczynnika mają zostać wyeksportowane, dostosowując background_ratio zmiennej.
Wartość domyślna to false, aby zastąpić tło zerami. AMEBaS testowany na zestawach danych, takich jak łagiewki pyłkowe wyrażające reporter wapnia cameleon, łagiewki pyłkowe wyrażające wskaźnik pH florin, włośniki wyrażające reporter wapnia NESYC 3.6 działały pomyślnie pomimo różnic w kierunku wzrostu, technikach obrazowania, reporterach fluorescencyjnych i typach komórek. Pamiętaj, aby wykonać zestaw bloków, aby móc zainstalować wymagane pakiety.
Ponadto ważne jest, aby dostosować wartości sigma specjalnie do swoich obrazów, aby uzyskać dokładniejsze wyniki. Uzyskane w ten sposób kimografy można następnie wykorzystać do analizy czasoprzestrzennej dynamiki zainteresowania rozwiązaniem. Dodatkowo możesz go obliczyć, znajdując metodę znajdowania, wzrost i szeregi czasowe, aby przeanalizować właściwe rozwiązanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy rękopis przedstawia nową linię przetwarzania obrazów przeznaczoną do automatyzacji ekstrakcji linii środkowych spolaryzowanych pojedynczych komórek i ilościowego określania ich zachowania przestrzenno-czasowego. Przyjazny dla użytkownika interfejs online poprawia analizę danych time-lapse, eliminując ograniczenia metod manualnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Dynamika komórkowa
- Analiza obrazów
- Zdjęcia fluorescencyjne
Tło
- Obecne metody analizy spolaryzowanych komórek są często manualne.
- Analiza manualna może wprowadzać zaburzenia i jest czasochłonna.
- Automatyzacja analizy obrazów może poprawić skalowalność i standaryzację.
- Niniejsze badanie koncentruje się na nowym podejściu do usprawnienia tego procesu.
Cel badania
- Automatyzacja ekstrakcji linii środkowych w spolaryzowanych komórkach.
- Ilościowe określenie dynamiki przestrzenno-czasowej na podstawie zdjęć time-lapse.
- Dostarczenie przyjaznego dla użytkownika interfejsu dla badaczy.
Stosowane metody
- Wykorzystanie Jupyter Notebook do analizy danych.
- Dostęp do plików time-lapse poprzez Google CoLab lub lokalne ustawienie.
- Przygotowanie katalogów wejściowych i wyjściowych do zarządzania danymi.
- Wykonanie kodów blokowych do konfiguracji i wprowadzania plików do przetwarzania danych.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie ilościowo określa dynamikę spolaryzowanych komórek.
- Automatyzacja zmniejsza subiektywne zaburzenia w analizie.
- Skalowanie umożliwia efektywne przetwarzanie większych zbiorów danych.
- Wyniki można wizualizować i interpretować przez interfejs.
Wnioski
- Proponowana linia przetwarzania poprawia analizę dynamiki spolaryzowanych komórek.
- Oferuje standaryzowany podchód do analizy obrazów.
- Ta metoda może znacznie poprawić efektywność badań w dziedzinie biologii komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated midline extraction and background subtraction for ratiometric fluorescence time-lapse imaging addresses a critical bottleneck in quantifying spatiotemporal dynamics of polarized single cells. By eliminating manual tracing and arbitrary background correction, AMEBaS enhances predictive confidence and reproducibility in early discovery and target validation workflows. This capability supports robust, scalable analysis of intracellular signaling and morphological dynamics relevant to cell polarity and disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased quantification of intracellular dynamics along the cell midline for hypothesis-driven studies.
- Reduces operator bias and subjectivity in spatial analysis of cell polarity markers.
- Supports mechanistic de-risking by providing standardized, quantitative outputs for pathway interrogation.
- Facilitates portfolio triage by enabling comparative analysis across cell types and experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible kymographs and ratiometric profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes background subtraction and midline tracing, improving assay reproducibility and scalability.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of compound effects on polarized cell dynamics.
- Supports platform reuse across diverse fluorescent reporters and imaging modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with disease-relevant models of cell polarity and migration.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical validation of cellular phenotypes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative cellular readouts.
- Supports translational biomarker development by quantifying dynamic cellular processes.
Pipeline & Workflow Integration
AMEBaS integrates into the discovery-to-preclinical continuum by automating quantitative imaging analysis for polarized single cells, supporting workflows from early hypothesis testing to lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Automates hypothesis testing and pathway clarification by extracting unbiased spatiotemporal profiles.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative kymographs and ratiometric outputs for assay development.
- Analytics: Provides standardized measurements and statistical outputs for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model validation for disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable computational pipeline adaptable to multiple cell types and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell polarity studies.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative imaging analysis across teams and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, unbiased data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting cell polarity mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and computational analysis for optimal parameter adjustment.
- Needs access to Jupyter Notebook or Google CoLab environments and compatible imaging file formats.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data management practices.
- Adaptable to various cell types, fluorescent reporters, and imaging modalities with parameter tuning.
- Dependent on image quality and appropriate segmentation for accurate midline extraction and quantification.
