Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Nasza metoda wykorzystuje wybór zakresu gospodarzy i markery fluorescencyjne do wydajnego i bezproblemowego generowania rekombinowanego wirusa krowianki w różnych typach komórek. Technika ta łączy w sobie szybkość rekombinacji homologicznej z bezbliznowatą naturą przejściowej selekcji dominującej. Ponadto oferujemy szeroki wybór asortymentu, aby wyeliminować możliwość wystąpienia zmian wywołanych chemicznie.

Metoda ta może być również stosowana do modyfikowania wirusa krowianki lub innych pokswirusów w celu ekspresji obcych genów, na przykład w celu wytworzenia szczepionek. Jeśli wykonujesz ten protokół tylko z selekcją fluorescencyjną, musisz upewnić się, że badasz wystarczającą liczbę wirusów, aby wykryć stosunkowo rzadkie rekombinanty bez selektywnej presji PKR. Metoda ta opiera się na pozyskiwaniu i utracie markerów fluorescencyjnych, aby skutecznie wyselekcjonować wirusy, które uzyskały kasety rekombinacyjne i wykryć wirusy, które uległy rekombinacji bez blizn

Aby wygenerować wektor rekombinacji, najpierw dodaj 17 mikrolitrów wody wolnej od DNazy, 1,2 mikrolitra każdego startera, pięć mikrolitrów 5x buforu reakcyjnego PCR, matrycowego DNA i 0,5 mikrolitra polimerazy DNA do jednej probówki PCR na amplikon. Dodaj dodatkową wodę wolną od DNaz, aby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 50 mikrolitrów. I umieść probówki w termocyklerze.

Rozpuść DNA w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 30 sekund przed użyciem 25 rund trzyetapowego protokołu PCR, jak wskazano. Aby uwidocznić produkty amplifikacji na 1% żelu agarozowym, dodaj 10 mikrolitrów każdego produktu DNA i 2 mikrolitry buforu ładującego do każdej studzienki. Uruchom żel na godzinę przy napięciu ośmiu woltów na centymetr.

Pod koniec cyklu użyj zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem producenta, aby oczyścić żel z każdego amplikonu. Eluować amplikony z kolumny za pomocą 50 mikrolitrów wody wolnej od DNazy i natychmiast odwirować. Aby zlinearyzować wektor klonowania, najpierw dodaj jeden mikrogram wektora, 17 mikrolitrów wody wolnej od DNaz, 2 mikrolitry buforu reakcyjnego i 1 mikrolitr EcoRI do probówki na godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji dodać 0,2 pikomoli zlinearyzowanego wektora, 10 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i 10 mikrolitrów głównej mieszanki zespołu DNA do każdego izolowanego amplikonu. Próbki inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Pod koniec inkubacji przekształć chemicznie kompetentną E.coli za pomocą dwóch mikrolitrów zmontowanego produktu zgodnie ze standardowymi protokołami.

Umieść 100 mikrolitrów przekształconych komórek na płytkach agarozy LB uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza wybierz dobrze izolowane kolonie do inokulacji w bulionie Luria uzupełnionym 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obrotach na minutę. Następnego ranka użyj zestawu miniprep plazmidu, aby wyizolować plazmidy.

I sprawdź stężenie i czystość DNA na spektrofotometrze. W celu wytworzenia rekombinowanego wirusa należy zainfekować zlewającą się monowarstwę odpowiednich komórek wirusem, który ma być rekombinowany przy wielokrotności infekcji jednej na sześciodołkową płytkę. I inkubuj zainfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę.

Pod koniec inkubacji zastąpić supernatant w każdym dołku świeżym DMEM i użyć dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Dodaj trzy mikrogramy interesującego nas wektora rekombinacji do każdego dołka. Umieścić płytkę w inkubatorze na dodatkowe 48 godzin.

Przed zebraniem komórek z każdego warunku transfekcji w pojedynczych probówkach o pojemności 1,5 mililitra. Następnie trzykrotnie zamroź i rozmroź zebrane komórki przed sonikacją powstałych lizatów przez 15 sekund przy amplitudzie 50%. Następnie, szeregowo 10-krotnie rozcieńczyć sonikowany lizat, zebrany od 10 do pierwszego do 10 do szóstego stężenia w świeżym DMEM i dodać jeden mililitr każdego rozcieńczenia do indywidualnych zbiegających się studzienek linii komórkowej kompetentnej kinazy białkowej R.

Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę przed zastąpieniem supernatantów świeżą pożywką i powrotem komórek do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 24 do 48 godzinach zidentyfikuj rekombinowane wirusy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Blaszki z rekombinowanych wirusów wykazują ekspresję czerwonej fluorescencji w wyniku integracji genu fuzyjnego mCherry-E3L.

Płytka nazębna trzykrotnie oczyszcza rekombinowane wirusy na dzikich komórkach RK13. Po trzech rundach oczyszczania płytki nazębnej zainfekuj komórki RK13 + E3L + K3L seryjnymi rozcieńczeniami lizatu płytki nazębnej. W celu identyfikacji zapadniętych wirusów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem odpowiedniego systemu obrazowania wyposażonego w kostki filtracyjne GFP i RFP.

Następnie płytka nazębna oczyszcza tylko zielone VC-R4 lub bezbarwne płytki E3L trzykrotnie na komórkach RK13 + E3L + K3L. Upewnij się, że żadne blaszki nie fluoryzują na czerwono. Zainfekuj komórki co najmniej 100 jednostkami tworzącymi płytkę nazębną, aby zwiększyć swoje szanse na zidentyfikowanie bezbarwnej płytki.

W rzadkich przypadkach może być konieczne przeprowadzenie wielu rund infekcji. Czerwone blaszki fluorescencyjne w komórkach RK13 kompetentnych kinazą białkową R wskazują na ekspresję wirusa mCherry-E3L. A bezbarwne blaszki lub blaszki wyrażające tylko eGFP w komórkach RK13 + E3L + K3L potwierdzają zapadnięcie się markera selekcyjnego mCherry-E3L.

Rekombinowany wirus VC-R4, który nie ma obu antagonistów kinazy białkowej R, nie może replikować się w komórkach RK13 kompetentnych dla kinazy białkowej R, podczas gdy pozorny wirus VP872, który wykazuje ekspresję E3L, jest kompetentny do replikacji. Aby potwierdzić, że ta niezdolność do replikacji w komórkach RK13 była spowodowana wyłącznie utratą E3L, wzmocniony GFP został zastąpiony E3L w wirusie VC-R4. Wygenerował odpowiedniego wirusa przy użyciu tego samego protokołu selekcji.

Co ciekawe, podczas wytwarzania tego wirusa, bezbarwne blaszki zgodne z zapadnięciem się markera selekcyjnego mCherry-E3L zostały zidentyfikowane przed selekcją w komórkach RK13 + E3L + K3L, które są ogólnie wymagane do selekcji rekombinantów bez blizn. Prawdopodobnie ze względu na rozszerzoną tożsamość sekwencji między kasetą rekombinacji mCherry-E3L a genem E3L wprowadzanym do VC-R4. Średnio 12,6% potomnych wirionów uległo rekombinacji z transfekowanym plazmidem, podobnie jak wcześniej zgłaszane częstości.

W tym miejscu pokazano częstość występowania bezbarwnych blaszek w stosunku do całkowitej liczby komórek RK13 + E3L + K3L, co pokazuje, że szybkość zapadania się i utrata markera selekcyjnego mCherry-E3L występowała z częstotliwością około 1,8%. W pierwszym etapie przy użyciu kompetentnych komórek PKR zapewnia, że wszystkie blaszki zawierają rekombinowanego wirusa. W drugim etapie zastosowanie komórek z niedoborem PKR umożliwia wykrycie rekombinowanego wirusa z zapadnięciem locus mCherry-E3L.

Takie podejście pozwala nam szybko generować wirusy zawierające geny egzogenne, na przykład do produkcji szczepionek, które oferują ekspresję różnych wirusowych antagonistów PKR. w celu ułatwienia analizy specyficznych dla gatunku interakcji z PKR od różnych gospodarzy.