Name: Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę generowania rekombinowanych wirusów ospy bez śladów mutacji, wykorzystującą selekcję zakresu gospodarza i fluorescencyjne markery. Technika ta umożliwia szybką modyfikację genetyczną w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health (AI114851) dla SR.

1. Generowanie wektora rekombinacji
<ol>
	<li>Zaprojektuj podkłady do generowania kasety wyboru. Zaprojektuj każdy pojedynczy amplikon z nakładającymi się sekwencjami z sąsiednimi amplikonami i wektorem, aby ułatwić izotermiczne składanie enzymatyczne cząsteczek DNA, zwane również składaniem Gibsona, korzystając z dowolnego z kilku narzędzi do projektowania starterów online. 
	UWAGA: Protokół ten można również wykonać przy użyciu tradycyjnych metod klonowania opartych na endonukleazie restrykcyjnej. W takim przypadku należy zaprojektować podkłady z odpowiednimi miejscami ograniczeniami, a nie z nakładającymi się sekwencjami.</li>
	<li>Korzystając ze starterów zaprojektowanych w kroku 1.1, PCR amplifikuje następujące pierwiastki w kolejności od 5' do 3' (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1): ~500 nukleotydów regionu genomowego VACV 5' E3L (ramię 5'), EGFP lub gen będący przedmiotem zainteresowania, ~150 nukleotydów z regionu genomowego VACV bezpośrednio 3' E3L (krótkie ramię 3'), syntetyczny wczesny/późny promotor pokswirusa<klasa sup = "xref">25, gen fuzyjny mCherry-E3L i ~500 nukleotydów z regionu genomowego VACV 3' E3L, w tym krótkie ramię 3' (długie ramię 3').
	<ol>
		<li>W probówce do PCR dodać odczynniki w następującej kolejności dla każdego amplikonu: 17 μl wody wolnej od DNazy, 1,2 μl każdego startera (stężenie początkowe = 10 μM, stężenie końcowe = 0,5 μM), 5 μL 5x buforu reakcyjnego PCR, matryca DNA (10 ng dla amplifikonów amplifikowanych z plazmidów: EGFP i promotor E/L-kaseta mCherry-E3L; 100 ng dla amplikonów amplifikowanych z genomowego DNA wirusa: ramiona 5' i 3') oraz 0,5 μl polimerazy DNA. Dostosuj objętość dodanej wody, aby uzyskać końcową objętość reakcji 50 μL. 
		UWAGA: Stężenie matrycowego DNA powinno być określone empirycznie, ale zazwyczaj zaczynamy od 10 ng / reakcję.</li>
		<li>Umieść probówkę (probówki) w termocyklerze i rozpuść DNA w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie użyj 25 rund trzyetapowego protokołu PCR: 98 °C przez 5 s, 55 °C przez 10 s i 72 °C przez 1 min. 
		UWAGA: Określ temperaturę topnienia na podstawie sugerowanej przez producenta Tm dla każdego zestawu podkładów. Określ odpowiedni czas przedłużenia na podstawie długości każdego amplikonu (1 minuta/kb).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizuj produkty wzmacniające na 1% żelu agarozowym. Dodać 10 μl każdego produktu DNA i 2 μl buforu ładującego do każdego dołka i uruchomić z napięciem 8 V/cm przez 1 godzinę.</li>
	<li>Żel oczyść każdy amplikon za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA i protokołu producenta. Eluować amplikony z kolumny, dodając 50 μl wody wolnej od DNaz i natychmiast odwirowując.</li>
	<li>Linearyzuj wektor klonowania pUC19 za pomocą trawienia endonukleazy EcoRI. Do probówki dodać 1 μg pUC19, wodę do objętości 17 μl, 2 l buforu reakcyjnego i 1 μl (20 jednostek) EcoRI. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Wizualizuj produkty amplifikacji na 1% żelu agarozowym przy napięciu 8 V/cm przez 1 godzinę. Wytnij pasmo z żelu i oczyść produkt za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA, jak opisano w kroku 1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiąż wszystkie pojedyncze, oczyszczone żelem amplikony i zlinearyzowany wektor za pomocą zestawu do mieszania głównego.
	<ol>
		<li>Do probówki PCR dodaj 0,2 pmol zlinearyzowanego pUC19 i każdy amplikon (ramię 5', EGFP, krótkie ramię 3', promotor E/L-kaseta mCherry-E3L, ramię 3'). Dodać wodę wolną od DNaz do końcowej objętości 10 μl, a następnie dodać 10 μl głównej mieszanki zespołu DNA. Próbki inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć chemicznie kompetentną E. coli za pomocą 2 μl zmontowanego produktu z kroku 1.6, jak opisano wcześniej26,27. Umieścić 100 μl przekształconych komórek na płytkach z agarozy LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz dobrze wyizolowane kolonie i przenieś pojedyncze kolonie do probówek zawierających bulion Luria ze 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidy z hodowli nocnej za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu. Sprawdź stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru. Dopuszczalny jest stosunek A260/A280 między 1,8 a 2,0.</li>
	<li>Prześlij plazmidy do sekwencjonowania Sangera, aby określić, czy żądany produkt do klonowania jest prawidłowy. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Generowanie rekombinowanego wirusa
<ol>
	<li>Zainfekować zlewającą się monowarstwę odpowiednich komórek wirusem, który ma być rekombinowany przy wielokrotności infekcji 1,0 (MOI = 1,0) na 6-dołkowej płytce. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. Następnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżym DMEM. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: W przypadku wirusów zdolnych do replikacji, takich jak wirus krowianki, który nie ma K3L22, odpowiednia jest linia komórkowa, taka jak europejska linia komórkowa nerki królika RK13 (ATCC #CCL-37) lub BSC-40. Jednak w przypadku wirusów z niedoborem replikacji, takich jak wirus opisany w tym artykule, w którym brakuje zarówno antagonistów PKR, E3L, jak i K3L, wymagana jest komplementarna linia komórkowa wyrażająca te dwa geny w komórkach trans lub PKR knock-down lub knock-out.</li>
	<li>Transfekcję zakażonych komórek za pomocą 500 ng wektora wygenerowanego i zwalidowanego w kroku 1.10 przy użyciu dostępnego na rynku odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 h. 
	UWAGA: W przypadku stosowania wirusa krowianki pozbawionego zarówno E3L, jak i K3L, selektywna presja za pośrednictwem PKR będzie napędzać selekcję zrekombinowanych wirusów i utrzymywać ekspresję białka fuzyjnego mCherry-E3L w tych komórkach. W razie potrzeby powinno być również możliwe amplifikowanie PCR tylko wkładki do transfekcji zamiast całego plazmidu.</li>
	<li>48 godzin po infekcji zbierz zainfekowaną monowarstwę. W niektórych przypadkach komórki można pobrać przez pipetowanie, ale jeśli nadal są ściśle przylegające, należy je pobrać za pomocą skrobaka do komórek. Zamroź i rozmroź komórki trzy razy, a następnie poddaj sonikacji lizaty przez 15 s przy 50% amplitudzie. Przechowywać ten lizat w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Szeregowo 10-krotnie rozcieńczyć lizat zebrany w kroku 2.3 od 10-1 do 10-6, dodając 120 μl lizatu do 1080 μl DMEM (10-1), a następnie dodając 120 μl tego rozcieńczenia do 1080 μl DMEM (10-2) i powtarzając ten proces jeszcze cztery razy. Dodać 1 ml każdego rozcieńczenia do pojedynczej, zlewającej się studzienki z linii komórkowej właściwej dla PKR, w tym przypadku komórek RK13.
	<ol>
		<li>Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę. Następnie odessać pożywkę i zastąpić ją świeżym DMEM Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 do 48 godzin po zakażeniu zidentyfikuj rekombinowane wirusy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Blaszki z rekombinowanych wirusów wykazują ekspresję czerwonej fluorescencji w wyniku integracji genu fuzyjnego mCherry-E3L (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Jeśli początkowo zastosowano wirusa pozbawionego inhibitorów PKR, wszystkie blaszki będą zawierały rekombinowanego wirusa.</li>
	<li>Płytka nazębna trzykrotnie oczyszcza rekombinowane wirusy na komórkach RK13. Po ostatniej rundzie oczyszczania płytki nazębnej wszystkie blaszki powinny wykazywać czerwoną fluorescencję.</li>
	<li>Zainfekuj konfluentną 6-dołkową płytkę komórek RK13 eksprymujących inhibitory VACV PKR E3L i K3L (komórki RK13+E3L+K3L<klasa sup="xref">28) wirusem fluorescencji oczyszczonym z blaszki miażdżycowej z kroku 2.6. Celuj w około 50-100 płytek na studzienkę. 
	UWAGA: Komórki te dostarczają antagonistów VACV PKR w trans i łagodzą presję selekcyjną za pośrednictwem PKR w celu utrzymania genu fuzyjnego mCherry-E3L, promując w ten sposób "bezbliznowate" wytwarzanie rekombinowanego wirusa.</li>
	<li>Zidentyfikuj zapadnięte wirusy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu mikroskopu EVOS2 i kostki filtra GFP (wzbudzenie: 470/22, emisja: 525/50) i kostki filtra RFP (wzbudzenie: 531/40, emisja: 593/40). 
	UWAGA: Częstość, przy której dochodzi do utraty genu fuzyjnego mCherry-E3L, wynosi około 2,5% (Tabela 2). Jeśli EGFP nie zostanie włączony jako gen markerowy, blaszki ze zmutowanych wirusów, które utraciły gen fuzyjny mCherry-E3L, będą bezbarwne.</li>
	<li>Płytka nazębna trzykrotnie oczyszcza płytki tylko zielone (VC-R4) lub bezbarwne (E3L) na komórkach RK13 + E3L + K3L. Upewnij się, że żadne blaszki nie fluoryzują na czerwono.</li>
	<li>Potwierdź utratę mCherry-E3L i obecność oczekiwanej mutacji za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera. 
	UWAGA: Jeśli gen lub mutacja będąca przedmiotem zainteresowania nie ma działania hamującego PKR, rekombinowane wirusy muszą być hodowane na komórkach RK13 + E3L + K3L lub równoważnej linii komórkowej z inhibitą PKR lub niedoborem PKR (<silna klasa = "xfig" >Figura 3).</li>
</ol>

<ol><li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li>
<li>Pastoret, P. P., Brochier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+use+of+a+vaccinia-rabies+recombinant+oral+vaccine+for+the+control+of+wildlife+rabies%3B+a+link+between+Jenner+and+Pasteur%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur.</a> Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).</li>
<li>Chan, W. M., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Poxviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+virology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Poxviruses.</a> Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-mediated+expression+of+human+erythropoietin+in+tumors+enhances+virotherapy+and+alleviates+cancer-related+anemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice.</a> Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).</li>
<li>Frentzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-VEGF+single-chain+antibody+GLAF-1+encoded+by+oncolytic+vaccinia+virus+significantly+enhances+antitumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).</li>
<li>Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxviruses+as+vaccine+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Poxviruses as vaccine vectors.</a> Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).</li>
<li>COLLIER, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+stable+smallpox+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The development of a stable smallpox vaccine.</a> The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).</li>
<li>Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+vaccinia+virus+thymidine+kinase+gene+by+marker+rescue+and+by+cell-free+translation+of+selected+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus%3A+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).</li>
<li>Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+vaccinia+virus%3A+demonstration+of+marker+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Host+Range+Selection+for+Genetic+Engineering+of+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara.</a> BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).</li>
<li>Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Isolation+of+Recombinant+MVA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccinia+Virus+and+Poxvirology%22%5BJournal%5D)">Construction and Isolation of Recombinant MVA.</a> Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+PKR+and+RNA+adenosine+deaminase+ADAR1%3A+New+roles+for+old+players+as+modulators+of+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+the+protein+kinase+PKR+to+RNAs+with+secondary+structure+defects%3A+Role+of+the+tandem+A+-+G+mismatch+and+noncontigous+helixes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes.</a> Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).</li>
<li>Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Binding+of+the+Phosphorylated+Subunit+of+Initiation+Factor+2+%28eIF2%29+to+the+Regulatory+Subunits+of+Guanine+Nucleotide+Exchange+Factor+eIF2B+Is+Required+for+Inhibition+of+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).</li>
<li>Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+eIF2%CE%B1+kinases%3A+Adapting+translational+control+to+diverse+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+of+the+Protein+Synthesis+Machinery+and+Its+Regulation%22%5BJournal%5D)">Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses.</a> Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).</li>
<li>Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+host+range+genes+in+poxvirus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A survey of host range genes in poxvirus genomes.</a> Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).</li>
<li>Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3L+gene+of+vaccinia+virus+encodes+an+inhibitor+of+the+interferon-induced%2C+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).</li>
<li>Romano, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+PKR+by+vaccinia+virus+E3%3A+role+of+complex+formation+and+the+E3+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain.</a> Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).</li>
<li>Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus-encoded+eIF-2+alpha+homolog+abrogates+the+antiviral+effect+of+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon.</a> Virology. 183 (1), 419-422 (1991).</li>
<li>Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+inhibition+of+antiviral+protein+kinase+R+by+capripoxviruses+and+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).</li>
<li>Rothenburg, S., Brennan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-Specific+Host-Virus+Interactions%3A+Implications+for+Viral+Host+Range+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence.</a> Trends in Microbiology. , (2019).</li>
<li>Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact%2C+synthetic%2C+vaccinia+virus+early%2Flate+promoter+for+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression.</a> BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+Transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution+%28recombinant+DNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA).</a> Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).</li>
<li>Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxoma+Virus+Protein+M029+Is+a+Dual+Function+Immunomodulator+that+Inhibits+PKR+and+Also+Conscripts+RHA%2FDHX9+to+Promote+Expanded+Host+Tropism+and+Viral+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication.</a> PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465(2013).</li>
<li>Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+genetic+recombination+among+cotransfected+plasmid+DNAs+in+poxvirus-infected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells.</a> Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).</li>
<li>Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+viral+products+of+recombination+in+vaccinia+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+host-range+selection+using+Chinese+hamster+ovary+cells+to+generate+marker-free+recombinant+viral+vectors+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus.</a> BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy wariant strategii selekcji markerów przejściowych 32 w celu wygenerowania rekombinowanych wirusów krowianki bez zatrzymywania obcego DNA w końcowym rekombinowanym wirusie. Nasza strategia wykorzystuje selektywne ciśnienie za pośrednictwem białka przeciwwirusowego gospodarza PKR, a nie inne formy selektywnego nacisku, takie jak antybiotyki. Zastosowanie genów przeciwwirusowych gospodarza eliminuje możliwość chemicznie wywołanych zmian fenotypowych w komórkach lub zwiększ...

Wirus krowianki (VACV) odegrał kluczową rolę w pierwszym udanym wyeliminowaniu ludzkiego patogenu, wirusa ospy wietrznej (VARV), z natury. Od czasu eksterminacji wirusa ospy wietrznej wirusy poksowe, w tym VACV, nadal są użytecznymi wirusami terapeutycznymi zarówno w medycynie ludzkiej, jak i zwierzęcej. Na przykład szczepionka przeciwko wirusowi wścieklizny oparta na wirusie wścieklizny oparta na wirusie VACV okazała się bardzo skuteczna w zapobieganiu przenoszeniu wścieklizny leśnej w Europie1 i Stanach Zjednoczonych2. Ostatnio rekombinowane pokswirusy wykazujące ekspresję różnych cząsteczek przeciwnowotworowych (np. przeciwciał jednołańcuchowych lub ludzkiej erytropoetyny) odniosły obiecujący sukces jako leki onkolityczne3,4,5. VACV jest szczególnie atrakcyjny jako wektor, ponieważ łatwo ulega manipulacjom genetycznym, posiada szeroki zakres żywicieli i jest stabilny w różnych warunkach, co pozwala na łatwy transport i żywotność szczepionki w terenie6,7. Chociaż opracowano wiele technik generowania rekombinowanego wirusa VACV do eksperymentów laboratoryjnych i generowania szczepionek, obecne strategie generowania tych wirusów mają znaczące ograniczenia.
Ze względu na użyteczność VACV, opracowano wiele strategii generowania rekombinowanych wirusów. Pierwsza strategia wykorzystuje rekombinację homologiczną w celu wprowadzenia kasety zawierającej transgen i selektywny gen markerowy, taki jak gen oporności na antybiotyki. Kaseta jest otoczona przez dwa ~500 nukleotydów (nt) lub większe ramiona kierujące gen do określonego miejsca w genomie wirusa, które jest następnie stabilnie integrowane przez podwójne zdarzenia krzyżowania8,9,10. Strategia ta jest szybka i skuteczna; Powoduje to jednak powstanie dodatkowego materiału genetycznego w postaci genu markerowego, który może wywołać nieoczekiwane efekty. Co więcej, istnieje praktyczny górny limit liczby transgenów, który można wprowadzić, ograniczony liczbą dostępnych unikalnych markerów do wyboru. Strategie przejściowej selekcji dominującej (TDS) rozwiązały ten problem, ułatwiając generowanie "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów11. Korzystając z tej strategii, plazmid zawierający zmutowany gen VACV i selektywny gen markerowy jest integrowany z genomem wirusa, ale bez dodatkowego flankującego DNA VACV. Takie podejście skutkuje przejściową integracją całego plazmidu i duplikacją genu VACV w wyniku integracji przez pojedyncze zdarzenie krzyżowania. Ten produkt pośredni jest stabilny tak długo, jak długo jest utrzymywany pod presją selekcyjną, co pozwala na wzbogacenie tego konstruktu. Po usunięciu selekcji duplikacja VACV umożliwia drugie zdarzenie krzyżowania, które skutkuje usunięciem plazmidu, a następnie utworzeniem wirusa typu dzikiego (wt) lub rekombinowanego w stosunku około 50:50. Podczas gdy TDS generuje rekombinowane wirusy bez konieczności stabilnego wprowadzania obcego DNA, wiele klonów wirusów musi być przebadanych pod kątem oczekiwanej mutacji poprzez analizę sekwencjonowania, co jest potencjalnie czasochłonnym i kosztownym krokiem.
Tutaj prezentujemy podejście do generowania rekombinowanych wirusów poxwirusa, łączące najlepsze aspekty każdego z tych podejść, podobne do podejścia, które zostało opisane dla replikacji niekompetentnej zmodyfikowanej krowianki Ankara12,13,14. Strategia ta łączy selekcję wizualną i wybór zakresu gospodarza w celu szybkiego generowania rekombinowanych wirusów przez podwójne krzyżowanie, a następnie eliminacji wybieralnego genu markerowego przez rekombinację homologiczną. Takie podejście pozwala na szybkie generowanie mutantów, w których pośredniczy rekombinacja homologiczna, z "bezbliznowatym" charakterem podejść TDS, przy jednoczesnym braku konieczności przeprowadzania kolejnego etapu badań przesiewowych w celu odróżnienia wirusów typu dzikiego i zmutowanych. Nasza metoda wykorzystuje również selekcję zakresu gospodarzy zamiast selekcji antybiotyków, eliminując ryzyko chemicznie wywołanych zmian fenotypowych w linii komórkowej. W tym podejściu zdecydowaliśmy się na użycie przeciwwirusowej kinazy białkowej gospodarza R (PKR) jako czynnika selektywnego do generowania rekombinowanego VACV. PKR jest wyrażony jako nieaktywny monomer w większości typów komórek15. Po związaniu dwuniciowego RNA (dsRNA) w N-końcowych domenach wiążących dsRNA, PKR dimeryzuje i ulega autofosforylacji16. Ta aktywna forma PKR fosforyluje podjednostkę alfa eukariotycznego czynnika inicjacji 2 (eIF2), ostatecznie hamując dostarczanie inicjującego metionylo-tRNA do rybosomu, zapobiegając w ten sposób translacji wewnątrzkomórkowej i szeroko hamując replikację wielu rodzin wirusów17,18.
W odpowiedzi na szeroką i silną aktywność przeciwwirusową PKR, wiele wirusów wypracowało co najmniej jedną strategię, aby zapobiec aktywacji PKR. Większość pokswirusów wykazuje ekspresję dwóch antagonistów PKR, kodowanych przez geny E3L i K3L w VACV, które antagonizują PKR poprzez dwa odrębne mechanizmy19. E3 zapobiega homodimeryzacji PKR poprzez wiązanie dwuniciowego RNA20,21, podczas gdy K3 działa jako inhibitor pseudosubstratu, wiążąc się bezpośrednio z aktywowanym PKR, a tym samym hamując interakcję z jego substratem eIF2α22. Co ważne, ci dwaj antagoniści PKR niekoniecznie hamują PKR u wszystkich gatunków. Na przykład homolog K3 wirusa ospy owczej silnie hamował PKR u owiec, podczas gdy homolog E3 ospy owczej nie wykazywał znacznego hamowania PKR23,24. W tym badaniu przedstawiono metodę wykorzystania selektywnego ciśnienia za pośrednictwem PKR w połączeniu z selekcją fluorescencyjną w celu wytworzenia rekombinowanego VACV delecjonu dla E3L i K3L (VC-R4), który nie może replikować się w kompetentnych komórkach PKR pochodzących z różnych gatunków. Ten rekombinowany wirus stanowi doskonałe tło dla szybkiego generowania rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję genów pod kontrolą natywnego promotora E3L.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>Polimeraza o wysokiej wierności stosowana w PCR</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>Bakteryjny środek selektywny</td></tr><tr><td>Jednorazowe skrobaki do komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>Skrobak do komórek</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 System obrazowania komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP Cube</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube, RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP Cube</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bulion</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Pożywka bakteryjna</td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>do ekstrakcji żelu DNA MonarchNEB</td><td>T1020L</td><td>Zestaw do oczyszczania żelu służący do oczyszczania amplikonów i wektorów linearyzowanych</td></tr><tr><td>Zestaw Monarch Plasmid Miniprep</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>Zestaw Miniprep przeznaczony do oczyszczania plazmidów</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Spektrofotometr służący do pomiaru stężenia RNA i DNA</td></tr><tr><td>NEBuilder Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Izotermiczny zestaw montażowy enzymatyczny służący do generowania wektora rekombinacji</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator Qsonica</td><td></td><td>Q500-110</td><td>Sonikator do lizatów</td></tr><tr><td>wirusa Komórki RK13</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>Komórki nerki królika</td></tr><tr><td>VWR Multiwell Płytki do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Płytki do hodowli komórkowych</td></tr></tbody></table>

szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Wirus krowianki (VACV) odegrał kluczową rolę w wyeliminowaniu wirusa ospy wietrznej (VARV), czynnika wywołującego ospę prawdziwą, z natury. Od czasu pierwszego zastosowania jako szczepionka, VACV został opracowany jako wektor szczepionek terapeutycznych oraz jako wirus onkolityczny. Aplikacje te wykorzystują łatwy do manipulowania genom VACV i szeroki zakres gospodarzy jako wyjątkową platformę do generowania rekombinowanych wirusów o różnorodnych zastosowaniach terapeutycznych. Opracowano kilka metod generowania rekombinowanego VACV, w tym metody selekcji markerów i przejściowej selekcji dominującej. W tym miejscu przedstawiamy udoskonalenie metody wyboru zakresu żywicieli w połączeniu z wizualną identyfikacją rekombinowanych wirusów. Nasza metoda wykorzystuje selektywne ciśnienie generowane przez przeciwwirusową kinazę białkową R gospodarza (PKR) sprzężoną z fluorescencyjnym genem fuzyjnym eksprymującym E3L znakowany mCherry, jednego z dwóch antagonistów VACV PKR. Kaseta, w tym gen będący przedmiotem zainteresowania i fuzja mCherry-E3L, jest otoczona sekwencjami pochodzącymi z genomu VACV. Pomiędzy genem będącym przedmiotem zainteresowania a mCherry-E3L znajduje się mniejszy region, który jest identyczny z pierwszymi ~150 nukleotydami ramienia 3', aby promować rekombinację homologiczną i utratę genu mCherry-E3L po selekcji. Wykazaliśmy, że metoda ta pozwala na wydajne, bezproblemowe wytwarzanie rVACV w różnych typach komórek bez konieczności wyboru leków lub szeroko zakrojonych badań przesiewowych pod kątem zmutowanych wirusów.

Do wygenerowania wirusa VACV pozbawionego obu antagonistów PKR, E3L i K3L, wykorzystaliśmy procedurę przedstawioną na Rysunku 1, zastępując E3L białkiem EGFP w wirusie z uprzednio usuniętym genem K3L (vP872). Rysunek 2 przedstawia czerwone fluorescencyjne plaques w komórkach RK13 kompetentnych pod kątem PKR, co wskazuje na wirusową ekspresję mCherry-E3L, a także ekspresję EGFP w komórkach RK13+E3L+K3L, co potwierdza utratę E3L i zapadnięcie (collapse) markera se...

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Nasza metoda wykorzystuje selekcję zakresu gospodarzy oraz markery fluorescencyjne do wydajnego i bezszwowego generowania rekombinowanego wirusa vaccinia w różnych typach komórek. Technika ta łączy szybkość rekombinacji homologicznej z bezbliznowym charakterem przejściowej selekcji dominantowej. Dodatkowo stosujemy selekcję zakresu gospodarzy, aby wyeliminować możliwość wystąpienia zmian indukowanych chemicznie. Metoda ta może być również wykorzystywana do modyfikacji wirusa vaccinia lub innych poxwirusów w celu ekspresji obcych genów, na przykład do wytwarzania szczepionek. W przypadku przeprowadzania tego protokołu wyłącznie z wykorzystaniem selekcji fluorescencyjnej należy upewnić się, że przesiewana jest wystarczająca liczba wirusów, aby wykryć stosunkowo rzadkie rekombinanty w warunkach braku presji selekcyjnej PKR. Metoda ta opiera się na nabywaniu i utracie markerów fluorescencyjnych w celu skutecznej selekcji wirusów, które pozyskały kasety rekombinacyjne, oraz wykrywania wirusów, które uległy bezbliznowej rekombinacji.Aby wygenerować wektor rekombinacyjny, należy najpierw dodać do jednej probówki PCR na każdy amplikon 17 µL wody wolnej od DNaz, 1,2 µL każdego z primerów, 5 µL 5x buforu do reakcji PCR, matrycę DNA oraz 0,5 µL polimerazy DNA. Następnie należy dodać odpowiednią ilość wody wolnej od DNaz, aby osiągnąć objętość końcową 50 µL w każdej probówce, a następnie umieścić probówki w termocyklerze.Denaturuj DNA w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie przeprowadź 25 cykli trójetapowego protokołu PCR zgodnie z instrukcją. Aby zwizualizować produkty amplifikacji na 1% żelu agarozy, nanieś do każdego oczka 10 µL każdego produktu DNA oraz 2 µL buforu do nakładania próbek. Prowadź elektroforezę przez jedną godzinę przy napięciu 8 V/cm.Po zakończeniu elektroforezy należy oczyścić każdy amplikon z żelu, stosując zestaw do ekstrakcji DNA z żelu zgodnie z protokołem producenta. Amplikony należy eluować z kolumny za pomocą 50 µl wody wolnej od DNaz, a następnie niezwłocznie odwirować. Aby zlinearyzować wektor klonujący, do probówki należy najpierw dodać 1 µg wektora, 17 µl wody wolnej od DNaz, 2 µl buforu reakcyjnego oraz 1 µl EcoRI i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Po zakończeniu inkubacji do każdego wyizolowanego amplikonu należy dodać 0,2 picomoli zlinearyzowanego wektora, 10 mikrolitrów wody wolnej od DNazy oraz 10 mikrolitrów master mixu do składania DNA. Próbki inkubowano w temperaturze 50 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji przeprowadzono transformację chemicznie kompetentnych komórek E.coli przy użyciu dwóch mikrolitrów produktu składania zgodnie ze standardowymi protokołami.Wysiej 100 µL transformowanych komórek na płytki z agaroza LB uzupełnioną o 100 µg/mL ampicyliny. Po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C wybierz dobrze odizolowane kolonie w celu inokulacji w bulionie Luria uzupełnionym o 100 µg/mL ampicyliny, inkubując je przez noc w temperaturze 37 °C przy 225 obr./min.Następnego ranka należy wykorzystać zestaw do minipreparatyki plazmidów w celu wyizolowania plazmidów, a następnie sprawdzić stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.W celu generowania rekombinowanego wirusa, zakaź konfluentną monowarstwę odpowiednich komórek w płytce sześciodołkowej wirusem przeznaczonym do rekombinacji przy wielokrotności zakażenia wynoszącej jeden. Zainkubuj zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji zastąp nadsącz w każdym dołku świeżą pożywką DMEM, a następnie, używając dostępnego komercyjnie odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta, dodaj do każdego dołka 3 µg wybranego wektora rekombinacyjnego. Umieść płytkę w inkubatorze na kolejne 48 godzin, a następnie przenieś komórki z każdego warunku transfekcji do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania zgromadzonych komórek, a następnie poddaj otrzymane lizaty sonikacji przez 15 sekund przy amplitudzie 50%. Następnie wykonaj 10-krotne rozcieńczenia seryjne zsonikowanego lizatu w świeżej pożywce DMEM, od stężeń od 10¹ do 10⁶, i dodaj 1 ml każdego rozcieńczenia do oddzielnych konfluentnych dołków z linią komórkową kompetentną dla kinazy białkowej R. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę, po czym zastąp nadsącze świeżą pożywką i ponownie umieść komórki w inkubatorze.Po 24 do 48 godzin zidentyfikuj wirusy rekombinowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Plaque powstałe z wirusów rekombinowanych wykazują czerwoną fluorescencję dzięki integracji genu fuzyjnego mCherry-E3L. Przeprowadź trzykrotną puryfikację plackową wirusów rekombinowanych na komórkach RK13 typu dzikiego. Po trzech rundach puryfikacji plackowej zainfekuj komórki RK13+E3L+K3L seryjnymi rozcieńczeniami lizatu plackowego. Zidentyfikuj wirusy zapadnięte (collapsed viruses) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając odpowiedniego systemu obrazowania wyposażonego w kostki filtracyjne GFP i RFP. Następnie trzykrotnie przeprowadź puryfikację plackową zielonych placków VC-R4 lub bezbarwnych placków E3L na komórkach RK13+E3L+K3L. Upewnij się, że żadne placki nie wykazują czerwonej fluorescencji. Zainfekuj komórki co najmniej 100 jednostkami tworzącymi plaki, aby zwiększyć szanse na zidentyfikowanie bezbarwnej plaki. W rzadkich przypadkach może być wymaganych kilka rund infekcji.Czerwone fluorescencyjne plakietki w kompetentnych pod względem kinazy białkowej-R komórkach RK13 wskazują na wirusową ekspresję mCherry-E3L. Z kolei plakietki bezbarwne lub plakietki wykazujące jedynie ekspresję eGFP w komórkach RK13+E3L+K3L potwierdzają utratę markera selekcyjnego mCherry-E3L.Rekombinowany wirus VC-R4, któremu brakuje obu antagonistów kinazy białkowej R, nie może replikować się w kompetentnych pod względem kinazy białkowej R komórkach RK13, podczas gdy wirus macierzysty vP872, który wykazuje ekspresję E3L, jest zdolny do replikacji. Aby potwierdzić, że brak zdolności do replikacji w komórkach RK13 wynikał wyłącznie z utraty E3L, w wirusie VC-R4 zastąpiono eGFP białkiem E3L, aby wygenerować odpowiedni wirus przy użyciu tego samego protokołu selekcji.Co ciekawe, podczas tworzenia tego wirusa, przed selekcją w komórkach RK13+E3L+K3L, które są zazwyczaj wymagane do wyłonienia rekombinantów bez blizn, zidentyfikowano bezbarwne plaques zgodne z utratą markera selekcyjnego mCherry-E3L, co prawdopodobnie wynikało z rozległej identyczności sekwencji między kasetą rekombinacyjną mCherry-E3L a genem E3L wstawianym do VC-R4. Średnio 12,6% wirionów potomnych uległo rekombinacji z transfektowanym plazmidem, co jest zbliżone do wcześniej raportowanych częstotliwości.Tutaj przedstawiono częstotliwość występowania bezbarwnych plam w stosunku do całkowitej liczby plam w komórkach RK13+E3L+K3L, co pokazuje, że tempo zapadania się i utrata markera selekcyjnego mCherry-E3L wystąpiły z częstotliwością około 1,8%.W pierwszym etapie zastosowanie komórek kompetentnych względem PKR zapewnia, że wszystkie plaki będą zawierać wirusa rekombinowanego. W drugim etapie użycie komórek z niedoborem PKR umożliwia wykrycie wirusa rekombinowanego z zapadniętym locus mCherry-E3L.Podejście to pozwala na szybkie generowanie wirusów zawierających geny egzogenne, na przykład w celu produkcji szczepionek lub ekspresji różnych wirusowych antagonistów PKR, co ułatwia analizę specyficznych dla gatunku interakcji z PKR pochodzącym od różnych gospodarzy.

rapid-seamless-generation-recombinant-poxviruses-using-host-range

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych wirusów ospy za pomocą zakresu żywiciela i selekcji wizualnej

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Poznaj metodę generowania rekombinowanych wirusów ospy bez śladów mutacji, wykorzystującą selekcję zakresu gospodarza i fluorescencyjne markery. Technika ta umożliwia szybką modyfikację genetyczną w różnych typach komórek.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Przeglądaj więcej filmów