Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans
17 grudnia 2021
Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.
Mechanizmy agregacji białek były do tej pory badane głównie in vitro. Dzięki naszemu protokołowi możemy przeprowadzić podobne badania ilościowe na organizmie modelowym C.elegans. Główną zaletą naszej metody jest bezstronna kwantyfikacja liczb inkluzji.
Dopasowując te wysokiej jakości dane do modeli matematycznych, możemy uzyskać wgląd w mechanizm agregacji. Agregacja białek występuje w wielu chorobach, w tym w chorobie Alzheimera i Huntingtona. Zrozumienie molekularnego mechanizmu agregacji białek in vivo ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii.
Zacznij od umieszczenia 10 dorosłych nicieni na 6-centymetrowej płytce NGM z nasionami za pomocą platynowego kilofa, aby wykonać zsynchronizowane składanie jaj. Pozostaw dorosłe osobniki do złożenia jaj na około dwie godziny w temperaturze 20 C przed wyjęciem ich z talerza. Umieścić płytki z jajami w inkubatorze w temperaturze 20 °C. Monitorować rozwój zwierząt aż do osiągnięcia przez nie dorosłości, około trzeciego dnia po złożeniu jaj.
Przygotować płytkę 384-dołkową, wypełniając wymaganą liczbę studzienek 100 litrami buforu M9 uzupełnionego 25 mM azydkiem sodu jako środkiem znieczulającym. Napełnij jedną studzienkę na szczep, który ma być zobrazowany. Dla każdego szczepu przenieś 20 zwierząt do jednej studzienki za pomocą platynowego kilofa.
Przykryj płytkę pokrywką, aby zapobiec parowaniu, i zobrazuj płytkę w ciągu godziny po przygotowaniu. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie. Kliknij przycisk Odtwórz obok opcji Rozładuj płytki studzienkowe i umieść płytkę 384-dołkową w mikroskopie.
W obszarze Lista działań i Akwizycja fluorescencji 3D kliknij przycisk Test i wybierz studzienkę zawierającą robaki. Ustaw opcję Przetwarzanie obrazu na Brak. I kliknij przycisk Odtwórz, aby określić optymalną odległość przesunięcia, przy której robaki są prawidłowo wyśrodkowane.
Ustaw odległość narastania na 50 m, odległość opadania na 50 m i interwał krojenia na 2 m, aby uchwycić całą grubość zwierząt w stosie z. Ustaw Przetwarzanie obrazu z powrotem na maksimum. Wybierz studzienki, które mają być obrazowane w obszarze Ustawienia skanowania płytki studziennej.
A następnie wybierz Kafelek i Zdobądź całą studnię. Zapisz ustawienie pomiaru. I kliknij Rozpocznij pomiar, aby rozpocząć eksperyment.
Otwórz program CellProfiler i przeciągnij potok do okna Upuść plik potoku w tym miejscu. Kliknij przycisk Tak, aby załadować projekt. Następnie przeciągnij zszyte obrazy do okna Upuść pliki i folder tutaj.
Kliknij moduł wprowadzania metadanych. Dostosuj wyrażenie regularne, aby wyodrębnić z nazwy pliku zgodnie z nazwami zszytych obrazów. Kliknij moduł wejściowy NamesAndTypes i dostosuj Wybierz kryteria reguły, aby dopasować kanały w nazwach plików.
Następnie kliknij Ustawienia wyjściowe, aby wybrać folder, w którym chcesz zapisać dane wyjściowe z CellProfiler. Kliknij przycisk Uruchom tryb testowy, aby sprawdzić ustawienia potoku przy użyciu pierwszego zestawu danych obrazowania. Kliknij pozycję Krok, aby przejść przez potok, moduł po module.
Aby dostosować kontury robaków, kliknij Pokaż pomoc w module EditObjectsManual, aby wyświetlić instrukcje. Popraw kontury. A następnie kliknij Gotowe, aby kontynuować uruchamianie potoku.
Kliknij Wyjdź z trybu testowego i przeanalizuj obrazy. Otwórz folder wyjściowy, aby wyświetlić pliki wyjściowe. I otwórz obrazy z oryginalną nazwą pliku, a następnie konturami, aby sprawdzić, czy robaki i inkluzje zostały prawidłowo nałożone.
Aby rozpocząć korzystanie z AmyloFit, nazwij projekt i kliknij Utwórz projekt. Kliknij Otwórz, aby go otworzyć. I utwórz sesję, nadając jej nazwę i klikając Utwórz i załaduj sesję.
Kliknij Dodaj dane i prześlij plik zawierający średnią liczbę inkluzji na zwierzę, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi formatu danych pokazanymi w lewym panelu. Następnie kliknij Załaduj nowe dane. Ustaw liczbę punktów do uśrednienia dla przesunięcia punktu zerowego na 0, a liczbę punktów do uśrednienia dla plateau na 0, aby pominąć kroki przetwarzania wstępnego, które nie są wymagane w przypadku danych liczby włączeń.
Następnie kliknij Prześlij. Powtórz ten krok dla każdego stężenia białka. Wybierz opcję Niestandardowe w panelu Model.
Wprowadź równanie niezależnego zarodkowania w polu Równanie. I kliknij Załaduj model. W przypadku Ncells ustaw typ parametru na Stała globalna i ustaw wartość na 95, co odpowiada liczbie komórek mięśniowych ściany ciała.
Ustaw typy parametrów na Globalne dopasowanie dla Kcell i n. I do stałej dla m. Wprowadź wartości m dla różnych odkształceń w lewym panelu.
Pozostaw liczbę przeskoków basenu bez zmian i kliknij przycisk Dopasuj w panelu Dopasowanie. Na koniec wyodrębnij dopasowanie, klikając Pobierz dane i dopasuj. Liczby inkluzji były monitorowane w czterech szczepach C.elegans wyrażających różne stężenia koenzymu Q40.
Niezależny model zarodkowania dobrze opisuje kinetykę agregacji. Dopasowanie dało rząd reakcji 2,1 i szybkość zarodkowania 0,38 cząsteczki dziennie na komórkę przy stężeniu białka wewnątrzkomórkowego 1 mM. Dwa niezależne kontrpróby biologiczne w poprzednim badaniu wykazały ściśle równoważne wartości kolejności reakcji i szybkości zarodkowania.
Jedną rzeczą, o której należy pamiętać, jest to, że potrzebujesz wysokiej jakości zestawów danych dla wielu stężeń białka, aby uzyskać wiarygodne dopasowania. Metoda ta może być wykorzystana do znalezienia sposobów zakłócania agregacji białek w żywym organizmie, takich jak nokautacje genetyczne lub leczenie małymi cząsteczkami.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę analizy kinetyki agregacji białek u nicienia Caenorhabditis elegans. Protokół pozwala na niezafekowany kwantyfikacje liczby inkluzji poprzez obrazowanie i modelowanie matematyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Agregacja białek
Tło
- Agregacja białek jest związana z różnymi chorobami, w tym Alzheimera i Huntingtona.
- Poprzednie badania koncentrowały się głównie na metodach in vitro.
- Zrozumienie mechanizmów in vivo jest kluczowe dla rozwoju terapii.
- Caenorhabditis elegans służy jako organizm modelowy w takich badaniach.
Cel badania
- Opracowanie metody badania agregacji białek w żywym organizmie.
- Dokładne kwantyfikowanie liczby inkluzji i uzyskiwanie wglądu w mechanizmy agregacji.
- Ułatwienie badania interwencji terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Wiek-zsynchronizowane C. elegans są obrazowane w różnych punktach czasowych.
- Liczenie inkluzji jest wykonywane za pomocą CellProfiler.
- Dane są dopasowywane do modeli matematycznych za pomocą AmyloFit.
- Warunki eksperymentalne obejmują specyficzne przygotowanie temperatury i buforu.
Główne wyniki
- Niezależny model nukleacji efektywnie opisuje kinetykę agregacji.
- Wyznaczono rząd reakcji 2.1 i szybkość nukleacji 0.38 cząsteczek dziennie na komórkę.
- Wysokiej jakości zbiory danych są niezbędne do uzyskania wiarygodnych dopasowań.
- Metoda może być zastosowana do badania genetycznych lub farmakologicznych interwencji.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia solidną ramę dla badania agregacji białek in vivo.
- Zdobyte wglądy mogą poinformować o strategiach terapeutycznych dla powiązanych chorób.
- Przyszłe badania mogą eksplorować dodatkowe stężenia białek i warunki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying protein aggregation kinetics in vivo addresses a critical gap in neurodegenerative disease research, where in vitro models often fail to capture cellular complexity. This method enables unbiased, time-resolved measurement of inclusion formation in a genetically tractable organism, supporting target validation and mechanistic de-risking. By linking quantitative imaging to mathematical modeling, it provides predictive confidence for evaluating proteostasis modifiers and therapeutic candidates in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying aggregation kinetics in living muscle cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through unbiased inclusion counting across genetic strains.
- Predictive Value: Fitting data to independent nucleation models clarifies mechanism and informs target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved inclusion counts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Integrates high-throughput imaging with automated image analysis for reproducible outputs.
- Scalability: Uses 384-well plate format to enable screening of genetic or pharmacological modulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human protein aggregation diseases like Huntington’s via polyQ expression in C. elegans.
- Mechanistic De-risking: Derives nucleation rate and reaction order to distinguish between aggregation mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies effects of interventions on aggregation kinetics to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where quantitative aggregation data informs target selection and compound screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleation-dependent aggregation using time-lapse inclusion data.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative readouts for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Employs mathematical fitting to extract kinetic parameters (Kcell, n) that enable condition comparison.
- Translational Research: Uses disease-relevant polyQ model to bridge in vivo findings to human pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for chronic proteinopathy studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking inclusion counts to biophysical models of aggregation.
- Operational Value: Standardizes quantification via automated pipelines, minimizing inter-observer variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic, not just endpoint, aggregation data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanism and modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, image analysis (CellProfiler), and kinetic modeling (AmyloFit).
- Dependent on instrumentation capable of 3D fluorescence z-stacking in multi-well formats.
- Necessitates standardization of worm handling, staining, and imaging timing across operators.
- Adaptation to other tissues or models may require adjustments to segmentation and signal thresholds.
- Relies on high-quality, multi-concentration datasets for reliable model fitting, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
