Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Mechanizmy agregacji białek były do tej pory badane głównie in vitro. Dzięki naszemu protokołowi możemy przeprowadzić podobne badania ilościowe na organizmie modelowym C.elegans. Główną zaletą naszej metody jest bezstronna kwantyfikacja liczb inkluzji.

Dopasowując te wysokiej jakości dane do modeli matematycznych, możemy uzyskać wgląd w mechanizm agregacji. Agregacja białek występuje w wielu chorobach, w tym w chorobie Alzheimera i Huntingtona. Zrozumienie molekularnego mechanizmu agregacji białek in vivo ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii.

Zacznij od umieszczenia 10 dorosłych nicieni na 6-centymetrowej płytce NGM z nasionami za pomocą platynowego kilofa, aby wykonać zsynchronizowane składanie jaj. Pozostaw dorosłe osobniki do złożenia jaj na około dwie godziny w temperaturze 20 C przed wyjęciem ich z talerza. Umieścić płytki z jajami w inkubatorze w temperaturze 20 °C. Monitorować rozwój zwierząt aż do osiągnięcia przez nie dorosłości, około trzeciego dnia po złożeniu jaj.

Przygotować płytkę 384-dołkową, wypełniając wymaganą liczbę studzienek 100 litrami buforu M9 uzupełnionego 25 mM azydkiem sodu jako środkiem znieczulającym. Napełnij jedną studzienkę na szczep, który ma być zobrazowany. Dla każdego szczepu przenieś 20 zwierząt do jednej studzienki za pomocą platynowego kilofa.

Przykryj płytkę pokrywką, aby zapobiec parowaniu, i zobrazuj płytkę w ciągu godziny po przygotowaniu. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie. Kliknij przycisk Odtwórz obok opcji Rozładuj płytki studzienkowe i umieść płytkę 384-dołkową w mikroskopie.

W obszarze Lista działań i Akwizycja fluorescencji 3D kliknij przycisk Test i wybierz studzienkę zawierającą robaki. Ustaw opcję Przetwarzanie obrazu na Brak. I kliknij przycisk Odtwórz, aby określić optymalną odległość przesunięcia, przy której robaki są prawidłowo wyśrodkowane.

Ustaw odległość narastania na 50 m, odległość opadania na 50 m i interwał krojenia na 2 m, aby uchwycić całą grubość zwierząt w stosie z. Ustaw Przetwarzanie obrazu z powrotem na maksimum. Wybierz studzienki, które mają być obrazowane w obszarze Ustawienia skanowania płytki studziennej.

A następnie wybierz Kafelek i Zdobądź całą studnię. Zapisz ustawienie pomiaru. I kliknij Rozpocznij pomiar, aby rozpocząć eksperyment.

Otwórz program CellProfiler i przeciągnij potok do okna Upuść plik potoku w tym miejscu. Kliknij przycisk Tak, aby załadować projekt. Następnie przeciągnij zszyte obrazy do okna Upuść pliki i folder tutaj.

Kliknij moduł wprowadzania metadanych. Dostosuj wyrażenie regularne, aby wyodrębnić z nazwy pliku zgodnie z nazwami zszytych obrazów. Kliknij moduł wejściowy NamesAndTypes i dostosuj Wybierz kryteria reguły, aby dopasować kanały w nazwach plików.

Następnie kliknij Ustawienia wyjściowe, aby wybrać folder, w którym chcesz zapisać dane wyjściowe z CellProfiler. Kliknij przycisk Uruchom tryb testowy, aby sprawdzić ustawienia potoku przy użyciu pierwszego zestawu danych obrazowania. Kliknij pozycję Krok, aby przejść przez potok, moduł po module.

Aby dostosować kontury robaków, kliknij Pokaż pomoc w module EditObjectsManual, aby wyświetlić instrukcje. Popraw kontury. A następnie kliknij Gotowe, aby kontynuować uruchamianie potoku.

Kliknij Wyjdź z trybu testowego i przeanalizuj obrazy. Otwórz folder wyjściowy, aby wyświetlić pliki wyjściowe. I otwórz obrazy z oryginalną nazwą pliku, a następnie konturami, aby sprawdzić, czy robaki i inkluzje zostały prawidłowo nałożone.

Aby rozpocząć korzystanie z AmyloFit, nazwij projekt i kliknij Utwórz projekt. Kliknij Otwórz, aby go otworzyć. I utwórz sesję, nadając jej nazwę i klikając Utwórz i załaduj sesję.

Kliknij Dodaj dane i prześlij plik zawierający średnią liczbę inkluzji na zwierzę, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi formatu danych pokazanymi w lewym panelu. Następnie kliknij Załaduj nowe dane. Ustaw liczbę punktów do uśrednienia dla przesunięcia punktu zerowego na 0, a liczbę punktów do uśrednienia dla plateau na 0, aby pominąć kroki przetwarzania wstępnego, które nie są wymagane w przypadku danych liczby włączeń.

Następnie kliknij Prześlij. Powtórz ten krok dla każdego stężenia białka. Wybierz opcję Niestandardowe w panelu Model.

Wprowadź równanie niezależnego zarodkowania w polu Równanie. I kliknij Załaduj model. W przypadku Ncells ustaw typ parametru na Stała globalna i ustaw wartość na 95, co odpowiada liczbie komórek mięśniowych ściany ciała.

Ustaw typy parametrów na Globalne dopasowanie dla Kcell i n. I do stałej dla m. Wprowadź wartości m dla różnych odkształceń w lewym panelu.

Pozostaw liczbę przeskoków basenu bez zmian i kliknij przycisk Dopasuj w panelu Dopasowanie. Na koniec wyodrębnij dopasowanie, klikając Pobierz dane i dopasuj. Liczby inkluzji były monitorowane w czterech szczepach C.elegans wyrażających różne stężenia koenzymu Q40.

Niezależny model zarodkowania dobrze opisuje kinetykę agregacji. Dopasowanie dało rząd reakcji 2,1 i szybkość zarodkowania 0,38 cząsteczki dziennie na komórkę przy stężeniu białka wewnątrzkomórkowego 1 mM. Dwa niezależne kontrpróby biologiczne w poprzednim badaniu wykazały ściśle równoważne wartości kolejności reakcji i szybkości zarodkowania.

Jedną rzeczą, o której należy pamiętać, jest to, że potrzebujesz wysokiej jakości zestawów danych dla wielu stężeń białka, aby uzyskać wiarygodne dopasowania. Metoda ta może być wykorzystana do znalezienia sposobów zakłócania agregacji białek w żywym organizmie, takich jak nokautacje genetyczne lub leczenie małymi cząsteczkami.