Name: Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Poznaj metodę pomiaru interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w komórkach HEK-293T. Technika fluorescencyjna umożliwia szybką analizę adhezji białkowej w neurobiologii i innych dziedzinach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Mental Health (R00MH103531 i R01MH116901 do J.A.), grant na szkolenie przeddoktoranckie z National Institute of General Medicine (T32GM007635 do S.R.) oraz Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 do S.R.). Dziękujemy dr Kevinowi Woolfreyowi za pomoc przy mikroskopie, dr K. Ulrichowi Bayerowi za użycie mikroskopu epifluorescencyjnego oraz Thomasowi Südhofowi (Uniwersytet Stanforda) za plazmid LRRTM2.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę komórkową HEK z DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) uzupełnioną o 4,5 g/L glukozy, L-glutaminę i pirogronian sodu oraz 10% FBS. Sterylny filtr.</li>
	<li>Z góry określ odpowiednie ligandy i receptory do testu agregacji. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto Neurexin3α SS4+/- i jednego z jego znanych ligandów, LRRTM2. Ligandy i receptory będące przedmiotem zainteresowania ulegały ekspresji z cDNA w pcDNA3.1. Zestaw Gibsona został użyty do wstawienia Neurexin3α do pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTCTCTCCACTC/ 
	GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Przygotuj HEK293T komórek.
	<ol>
		<li>Wyhoduj HEK293T komórek do zbiegu w jednej kolbie T-75.</li>
		<li>Po zlaniu użyj 2 ml trypsyny i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 minuty. Dodaj 6 ml pożywki HEK do kolby w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieś wszystkie 8 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Osad w dawce 500 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w pożywce komórkowej HEK, w sumie 8 ml.</li>
		<li>Policz komórki i dodaj 735 000 komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Dostosuj końcową objętość do 2 ml dla każdej studzienki za pomocą pożywki komórkowej HEK.</li>
		<li>Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom rosnąć przez noc lub do momentu, gdy osiągną 50-60% zlewności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek HEK293T metodą fosforanu wapnia13.
	<ol>
		<li>Transfekcja well-1 z 3 μg białka będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- i 1 μg mCherry).</li>
		<li>Transfekcja well-2 jak w kroku 1.4.1, ale ze zmutowanym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfekcja well-3 z 3 μg ligandu będącego przedmiotem zainteresowania i kotransfekcja z 1 μg innego białka fluorescencyjnego (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 i 1 μg GFP).</li>
		<li>Przepuszczalne basenie 4 i 5 służące jako kontrole negatywne: basenik 4 z 1 μg GFP i basenik 5 z 1 μg mCherry.</li>
		<li>Przygotuj kolejną płytkę (jak w kroku 1.4.1-1.4.4), jeśli wymaga to dodatkowych warunków lub kontroli (Neurexin3αWT/A687T SS4+). 
		UWAGA: Skuteczność transfekcji jest analizowana 24 godziny po transfekcji pod mikroskopem epifluorescencyjnym i określana ilościowo jako liczba komórek wyrażających białko fluorescencyjne, którym zostały transfekowane. Bardziej uproszczone podejście obejmowałoby transfekcję komórek HEK z wektorem bicystronicznym kodującym białko fluorescencyjne i ligand będący przedmiotem zainteresowania i jest wysoce zalecane przed kotransfekcją. W przypadku tego badania alfa neureksyny mają ~4,3 kb i zaobserwowano niską intensywność fluorescencji przy użyciu systemu bicystronicznego wymagającego kotransfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>48 godzin po transfekcji zbierz komórki do agregacji.
	<ol>
		<li>Umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml 10 mM EDTA w PBS do każdej studzienki, aby delikatnie dysocjować interakcje międzykomórkowe i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Trypsyna nie jest zalecana w kroku 1.5.2 ze względu na potencjalne proteolityczne rozszczepienie cząsteczek adhezyjnych w badaniu. Dodatkowo, po dodaniu EDTA, protokół może nie zostać zatrzymany do czasu zakończenia, ponieważ komórki będą teraz wystawione na działanie warunków otoczenia.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki, i zbierz każdą studzienkę do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować stożkowe probówki o sile 500 x g i temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas granulowania komórek przygotuj 6 probówek inkubacyjnych, oznaczając górną część każdej probówki mikrowirówki każdym warunkiem. 
	UWAGA: Każda permutacja warunków GFP i mCherry powinna być stosowana w celu uwzględnienia wszystkich warunków eksperymentalnych i właściwych kontroli. Na przykład: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Wykonaj dodatkowe rurki, aby dostosować się do dalszych warunków i kontroli.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki HEK z 10 mM CaCl2 i 10 mM MgCl2 ogrzanymi do 37 °C. 
	UWAGA: Dodanie CaCl2 i MgCl2 umożliwia cząsteczkom adhezyjnym ponowne nawiązanie wiązania i jest wymagane tylko wtedy, gdy partnerzy interakcji transkomórkowej, o których mowa, wymagają kationów dwuwartościowych do adhezji.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policzyć komórki w każdej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i podzielić 200 000 komórek każdego stanu do odpowiedniej probówki z kroku 1.6.1, aby uzyskać mieszaninę 1:1 w całkowitej objętości 500 μl. 
	UWAGA: Liczenie i rozdzielanie ilości powinno zająć tylko 5 minut na warunek.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze pokojowej w powolnym rotatorze probówkowym.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zoptymalizuj parametry akwizycji mikroskopu dla określonych próbek. W tym przykładzie obrazy zostały wykonane pod mikroskopem szerokokątnym. Użyj obiektywu powietrznego 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm), aby uzyskać wystarczająco duże pole do analizy.</li>
	<li>Oceń agregację wyjściową natychmiast po zmieszaniu dwóch warunków komórek HEK w kroku 1.8. To są teraz obrazy "czasu zero".
	<ol>
		<li>Pobrać pipetę 40 μl każdej mieszaniny próbki na naładowane szkiełko mikroskopowe i obrazować pod wpływem fluorescencji w kanałach 488 i 561.</li>
		<li>Uzyskaj trzy różne pola widzenia na jednej płaszczyźnie ostrości na kroplę próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj końcowe obrazy po 60 minutach jako obraz "czas 60".
	<ol>
		<li>Aby uzyskać obraz mieszaniny w czasie 60 po 60 minutach inkubacji, należy pobrać kolejną próbkę o objętości 40 μl z każdego stanu z obracających się probówek i pipetować każdą próbkę na naładowane szkiełko. Obraz jak w kroku 2.2.2. 
		UWAGA: Agregacja komórek powinna być sprawdzana co 15 minut, aż do momentu nasycenia. Czas agregacji będzie zależał od badanych białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza ImageJ/Fidżi
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo zakres agregacji przy użyciu Fiji/ImageJ, zapisz pliki analizy.
	<ol>
		<li>Zapisz dostarczone dodatkowe pliki kodowania w folderze makr imageJ na komputerze.</li>
		<li>Zainstaluj dostarczone makro agregacji (Wtyczki, Makra, Zainstaluj i wybierz plik "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ progi.
	<ol>
		<li>Załaduj plik .tif "czasu zero" do imageJ i podziel kanały (Obraz | Kolor | Podziel kanały). 
		UWAGA: Obraz "czasu zero" służy do określenia progu i najmniejszego rozmiaru puncta dla całego eksperymentu.</li>
		<li>Maskowanie każdego kanału (Wtyczki | Makra | AggregationAssay_MakeMask). Pojawi się okno Utwórz maskę z obrazu. Zaznacz pola wyboru Określ próg dla obrazu i Określ parametry klastra na podstawie histogramu, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Określ próg obrazu za pomocą suwaka, zapisz liczbę po prawej stronie suwaka i kliknij OK.</li>
		<li>Pojawi się histogram rozmiaru klastra. Wybierz z histogramu rozmiar klastra, który pasuje do eksperymentu, wpisz tę liczbę w polu Minimalny rozmiar klastra: i kliknij przycisk OK. Klastry poniżej tego rozmiaru nie będą analizowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom analizę.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz "czasu 60" warunku 1 w obrazie J i podziel kanały jak w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Zamaskuj każdy kanał (wtyczki, makra AggregationAssay_MakeMask). Użyj tego samego progu i rozmiaru, które zostały określone w krokach 3.2.3 i 3.2.4. Usuń zaznaczenie pól wyboru Określ próg dla obrazu i Określ parametry klastra na podstawie histogramu, a następnie ręcznie wpisz rozmiar i progi w odpowiednich polach, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Obliczanie indeksu agregacji (Wtyczki | Makra | AggregationAssay_CalculateOverlap). Wybierz zamaskowane kanały do porównania i katalog, w którym zostaną zapisane wynikowe pliki.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.3.1–3.3.3 dla każdego obrazu "czas 60" w każdym stanie. 
		UWAGA: Indeks agregacji definiuje się jako całkowity obszar nakładania się podzielony przez sumę dwóch obszarów kanału pomniejszoną o obszar nakładania pomnożony przez 100 (Wskaźnik agregacji = obszar nakładania się/[obszar kanału 1 + obszar kanału 2 – obszar nakładania się] x 100). Ta normalizacja jest operacją "LUB" między dwoma zamaskowanymi kanałami reprezentującymi łączną liczbę pikseli w każdej masce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza interakcji białko-białko, które zachodzą w trans podczas adhezji komórek, może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw podstawowych procesów komórkowych, w tym powstawania, funkcjonowania i utrzymywania synaps podczas dojrzewania i przebudowy. Implikacje interakcji międzykomórkowych wykraczają poza neurobiologię i odgrywają szerszą rolę w transdukcji sygnału, migracji komórek i rozwoju tkanek14. Aberracje w adhezji komórek mogą zakłócać procesy komórk...

Interakcje synaptyczne ułatwione przez cząsteczki adhezyjne synaps są podstawą rozwoju, organizacji, specyfikacji, utrzymania i funkcjonowania synaps oraz generowania sieci neuronowych. Identyfikacja tych transsynaptycznych cząsteczek adhezyjnych komórek szybko rośnie; Dlatego niezwykle ważne jest zidentyfikowanie partnerów wiążących i zrozumienie, w jaki sposób te nowe cząsteczki adhezyjne oddziałują ze sobą. Ponadto sekwencjonowanie genomu zidentyfikowało mutacje w wielu z tych cząsteczek adhezyjnych, które są powszechnie powiązane z wieloma zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami1. Mutacje w genach kodujących cząsteczki adhezyjne komórek synaptycznych mogą niekorzystnie zmieniać interakcje trans i mogą przyczyniać się do patofizjologicznych zmian w tworzeniu i/lub utrzymaniu synaps.
Istnieje wiele testów do ilościowej oceny interakcji białko-białko, takich jak kalorymetria izotermiczna, dichroizm kołowy, powierzchniowy rezonans plazmonowy2 i chociaż mają charakter ilościowy, mają kilka ograniczeń. Po pierwsze, wymagają rekombinowanego białka, co czasami wymaga długich i żmudnych etapów oczyszczania. Po drugie, wymagają wyrafinowanego specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. Po trzecie, mogą przeceniać zakres wiązania, ponieważ pozwalają na interakcje zarówno cis, jak i trans między białkami, które są naturalnie przywiązane do błony in vivo. Tutaj proponujemy prosty i stosunkowo szybki test, który testuje wyłącznie interakcje trans.
Aby obejść wiele komplikacji związanych z testami na oczyszczone białka, zoptymalizowaliśmy test interakcji białek na bazie komórek, który podsumowuje interakcje trans w zredukowanym heterologicznym systemie komórkowym. Ten test był wcześniej używany w różnych formach do badania interakcji międzykomórkowych. W tym podejściu cząsteczki adhezyjne komórek kandydujących są transfekowane do komórek HEK293T. W warunkach fizjologicznych komórki HEK293T nie wykazują samoagregacji, co czyni je wzorcowymi modelami dla tego testu. Jednak gdy poszczególne populacje komórek HEK eksprymujących receptor i ligand są połączone, wiązanie receptora i liganda wymusza agregację komórek HEK. Ta agregacja jest zapośredniczona wyłącznie przez interakcje trans i jest zwykle obserwowana w ciągu dziesiątek minut. W tej metodzie nie są wymagane żadne etapy oczyszczania białek, a skuteczność metody opiera się na paradygmacie, w którym populacje komórek HEK wyrażających pokrewne cząsteczki adhezyjne są łączone, a następnie obrazowane dopiero kilkadziesiąt minut później. Ponadto metoda ta jest stosunkowo niedroga, ponieważ nie są wymagane ani przeciwciała, ani kosztowny sprzęt. Jedynym sprzętem wymaganym do pozyskiwania danych jest standardowy mikroskop fluorescencyjny. Dodatkową zaletą tego testu opartego na komórkach jest możliwość szybkiego badania przesiewowego wpływu mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans. Można to osiągnąć poprzez transfekcję komórek HEK z cDNA zmutowanych wariantów białka będącego przedmiotem zainteresowania.
W tym protokole prezentujemy przykład, w którym badamy, czy mutacja missense w Neurexin3α (Neurexin3αA687T), zidentyfikowana u pacjenta, u którego zdiagnozowano głęboką niepełnosprawność intelektualną i epilepsję, zmienia interakcje w trans z bogatym w leucynę powtarzalnym białkiem transbłonowym 2 (LRRTM2). Neurexin3α należy do ewolucyjnie konserwatywnej rodziny presynaptycznych cząsteczek adhezyjnych komórek i chociaż ostatnie prace zidentyfikowały wiele ról w synapse3,4,5,6,7, nasze synaptyczne zrozumienie tej cząsteczki i wszystkich członków rodziny neureksyny pozostaje niepełne. LRRTM2 jest pobudzającym białkiem adhezyjnym komórek postsynaptycznych, które uczestniczy w tworzeniu i utrzymywaniu synaps8,9,10. Co ważne, LRRTM2 oddziałuje wyłącznie z izoformami neureksyny, które nie mają alternatywnego eksonu 4 miejsca splicingu (SS4-), ale nie z izoformami neureksyny zawierającymi alternatywny ekson miejsca splicingu 4 (SS4+). Ludzka mutacja typu missense (A687T) zidentyfikowana w Neurexin3α znajduje się w niezbadanym regionie zewnątrzkomórkowym, który jest ewolucyjnie konserwatywny i jest konserwatywny między wszystkimi alfa neureksinami7. Po ustaleniu interakcji między tymi dwiema cząsteczkami8,9,11, zadaliśmy pytanie: czy zdolność wiązania Neurexin3α SS4- z LRRTM2 jest zmieniona przez mutację punktową A687T? Test ten ujawnił, że mutacja punktowa A687T nieoczekiwanie zwiększyła agregację Neurexin3α do LRRTM2, co sugeruje, że region zewnątrzkomórkowy, w którym znajduje się mutacja punktowa, odgrywa rolę w pośredniczeniu w interakcjach transsynaptycznych.

<table><tbody><tr><td>Jednorazowe mikroprobówki 1,5 ml z zatrzaskami</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Inkubacja mieszanej populacji komórek HEK</td></tr><tr><td>1000 ml Rapid&mdash; Filtr przepływowy, membrana 0,2 um aPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterylizacja pożywek HEK</td></tr><tr><td>15 mL probówek wirówkowych SpectraTube</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Zbieranie komórek HEK</td></tr><tr><td>6-dołkowe sterylne płytki do hodowli tkanek</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>hodowla komórek HEK</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Transfekcja fosforanu wapnia, ponowne zawieszenie komórek HEK</td></tr><tr><td>Wirówka - Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Produkty laboratoryjne</td><td>75004377</td><td>Zbieranie komórek HEK</td></tr><tr><td>Inkubator</td> <td>komórek CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Inkubacja komórek HEK podczas wzrostu</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Utrzymanie komórek HEK</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Pasażowanie/zbieranie komórek HEK</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Zbieranie komórek HEK</td></tr><tr><td>Falcon Wentylowane kolby hodowlane, obszar wzrostu 75cm2</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Hodowla komórek HEK</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>Utrzymanie</td></tr> <tr>komórek HEK<td>HEK293T komórek</td> System <td>modelowy</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Analiza obrazu</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>Zawiesina komórek HEK</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Transfekcja fosforanu wapnia</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% (1X) Roztwór</td><td>GE Healthcare Life Nauki</td><td>SH30042.01</td><td>Pasażowanie komórek HEK</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td> rurkowy <td>Inkubacja mieszanej populacji komórek HEK</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe UltraClear. Biały matowy, dodatnio naładowany</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr></tbody></table>

pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Interakcje białek na interfejsach komórkowych dyktują wiele wyników biologicznych, począwszy od rozwoju tkanek i progresji raka, a skończywszy na tworzeniu i utrzymywaniu synaps. Wiele z tych podstawowych interakcji zachodzi w trans i są zwykle indukowane przez heterofilne lub homofilne interakcje między komórkami wyrażającymi pary wiążące zakotwiczone w błonie. Wyjaśnienie, w jaki sposób mutacje związane z chorobą zakłócają te podstawowe interakcje białek, może dostarczyć informacji na temat niezliczonych dziedzin biologii komórki. Wiele testów interakcji białko-białko zazwyczaj nie rozróżnia interakcji cis i trans, co potencjalnie prowadzi do przeszacowania zakresu wiązania zachodzącego in vivo i wymaga pracochłonnego oczyszczania białka i/lub specjalistycznego sprzętu monitorującego. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany prosty protokół, który pozwala na obserwację i kwantyfikację tylko interakcji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Test agregacji komórek HEK polega na zmieszaniu dwóch niezależnych populacji komórek HEK, z których każda wykazuje ekspresję pokrewnych ligandów związanych z błoną. Po krótkim okresie inkubacji próbki są obrazowane, a otrzymane agregaty są oznaczane ilościowo.

Mutacja A687T zwiększa wiązanie Neureksyny3α SS4 do LRRTM27 
Aby zbadać, w jaki sposób interakcje międzykomórkowe dwóch znanych białek synaptycznych są wpływane przez wprowadzenie mutacji punktowej znalezionej u pacjenta z niepełnosprawnością intelektualną i epilepsją, zastosowano powyższy test agregacji komórek HEK (Rycina 1). Komórki transfektowano zgodnie z sekcją 1 i przygotowano do obrazowania zgodnie z sekcjami 1 i 2 protokołu. Wykonano obrazowanie komóre...

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Test oparty na komórkach pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji adhezji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Chociaż badane tutaj interakcje białkowe są istotne dla neurobiologii, metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym adhezja białek zachodzi międzykomórkowo. 48 godzin po transfekcji komórek HEK-293T należy pobrać komórki z płytki sześciodołkowej w celu agregacji.Najpierw umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Następnie, aby delikatnie oddzielić komórki, dodaj jeden mililitr 10 milimolowego EDTA do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki i zbierz każdą studzienkę do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Odwirować probówki o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas gdy komórki granulują, przygotuj sześć probówek inkubacyjnych, oznaczając górne części probówek do mikrowirówek warunkami eksperymentalnymi. Należy użyć każdej permutacji GFP i mCherry.Usunąć supernatant z 15-mililitrowych stożkowych probówek i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej stożkowej probówce. Następnie podwielokrotnić 200 000 komórek z każdego stanu do odpowiedniej probówki inkubacyjnej, aby uzyskać mieszaninę jeden do jednego w całkowitej objętości 500 mikrolitrów.Po dokonaniu oceny agregacji linii podstawowej opisanej w następnym rozdziale, należy umieścić probówki inkubacyjne w powolnym rotatorze probówek w temperaturze pokojowej. Aby ocenić agregację, na początku badania i ponownie po 60 minutach, należy odpipetować 40 mikrolitrów z probówki inkubacyjnej na naładowane szkiełko mikroskopowe. Akwizycja wyjściowa powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe po dodaniu komórek do probówki mikrowirówkowej.Wyobraź sobie slajd pod wpływem fluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Dla każdego slajdu uchwyć obrazy trzech różnych pól widzenia w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Komórki HEK-293T transfekowano białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, zmutowanym białkiem lub ligandem będącym przedmiotem zainteresowania i współtransfekowano białkiem fluorescencyjnym.Populacje komórek wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania zmieszano z populacjami komórek wyrażającymi interesujący ligand i oceniono pod kątem agregacji po 60 minutach. W nakładkach obrazów przechwyconych w kanałach zielonym i czerwonym agregacja jest wyświetlana jako żółta kropka. Warunki, w których komórki nie wykazywały ekspresji żadnych ligandów synaptycznych, wykazywały minimalną agregację.Wykazano również minimalną agregację, gdy tylko jedna z dwóch populacji wykazywała ekspresję ligandów synaptycznych. Nie wykazano agregacji, gdy dwie populacje komórek wyrażały niezgodne cząsteczki adhezyjne. Warunki z kompatybilnymi cząsteczkami adhezyjnymi wykazywały znaczną agregację po 60-minutowej inkubacji.Co zaskakujące, zmutowane białko wykazywało znacznie większą agregację niż jego odpowiednik typu dzikiego, co sugeruje, że mutacja punktowa zwiększa zdolności wiązania białek. Mutacje w wielu cząsteczkach adhezyjnych są powszechnie związane z zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami. Dzięki tej technice można badać wpływ mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

W tym filmie demonstrujemy technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w komórce do badania interakcji białko-ligand między nieznakowanymi białkami o nadekspresji a małymi cząsteczkami. Udana interakcja ligand-białko jest potwierdzona wizualnie przez pojawienie się dodatkowego zestawu pików w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania, który stopniowo zastępuje pierwotne piki.

Ilościowa spektroskopia NMR wodoru w komórce do monitorowania interakcji białko-ligand

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Poznaj metodę pomiaru interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w komórkach HEK-293T. Technika fluorescencyjna umożliwia szybką analizę adhezji białkowej w neurobiologii i innych dziedzinach.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Przeglądaj więcej filmów