Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Test oparty na komórkach pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji adhezji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Chociaż badane tutaj interakcje białkowe są istotne dla neurobiologii, metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym adhezja białek zachodzi międzykomórkowo. 48 godzin po transfekcji komórek HEK-293T należy pobrać komórki z płytki sześciodołkowej w celu agregacji.

Najpierw umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Następnie, aby delikatnie oddzielić komórki, dodaj jeden mililitr 10 milimolowego EDTA do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki i zbierz każdą studzienkę do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować probówki o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas gdy komórki granulują, przygotuj sześć probówek inkubacyjnych, oznaczając górne części probówek do mikrowirówek warunkami eksperymentalnymi. Należy użyć każdej permutacji GFP i mCherry.

Usunąć supernatant z 15-mililitrowych stożkowych probówek i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej stożkowej probówce. Następnie podwielokrotnić 200 000 komórek z każdego stanu do odpowiedniej probówki inkubacyjnej, aby uzyskać mieszaninę jeden do jednego w całkowitej objętości 500 mikrolitrów.

Po dokonaniu oceny agregacji linii podstawowej opisanej w następnym rozdziale, należy umieścić probówki inkubacyjne w powolnym rotatorze probówek w temperaturze pokojowej. Aby ocenić agregację, na początku badania i ponownie po 60 minutach, należy odpipetować 40 mikrolitrów z probówki inkubacyjnej na naładowane szkiełko mikroskopowe. Akwizycja wyjściowa powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe po dodaniu komórek do probówki mikrowirówkowej.

Wyobraź sobie slajd pod wpływem fluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Dla każdego slajdu uchwyć obrazy trzech różnych pól widzenia w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Komórki HEK-293T transfekowano białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, zmutowanym białkiem lub ligandem będącym przedmiotem zainteresowania i współtransfekowano białkiem fluorescencyjnym.

Populacje komórek wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania zmieszano z populacjami komórek wyrażającymi interesujący ligand i oceniono pod kątem agregacji po 60 minutach. W nakładkach obrazów przechwyconych w kanałach zielonym i czerwonym agregacja jest wyświetlana jako żółta kropka. Warunki, w których komórki nie wykazywały ekspresji żadnych ligandów synaptycznych, wykazywały minimalną agregację.

Wykazano również minimalną agregację, gdy tylko jedna z dwóch populacji wykazywała ekspresję ligandów synaptycznych. Nie wykazano agregacji, gdy dwie populacje komórek wyrażały niezgodne cząsteczki adhezyjne. Warunki z kompatybilnymi cząsteczkami adhezyjnymi wykazywały znaczną agregację po 60-minutowej inkubacji.

Co zaskakujące, zmutowane białko wykazywało znacznie większą agregację niż jego odpowiednik typu dzikiego, co sugeruje, że mutacja punktowa zwiększa zdolności wiązania białek. Mutacje w wielu cząsteczkach adhezyjnych są powszechnie związane z zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami. Dzięki tej technice można badać wpływ mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans.