Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym
22 maja 2020
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Test oparty na komórkach pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji adhezji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Chociaż badane tutaj interakcje białkowe są istotne dla neurobiologii, metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym adhezja białek zachodzi międzykomórkowo. 48 godzin po transfekcji komórek HEK-293T należy pobrać komórki z płytki sześciodołkowej w celu agregacji.
Najpierw umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Następnie, aby delikatnie oddzielić komórki, dodaj jeden mililitr 10 milimolowego EDTA do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki i zbierz każdą studzienkę do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.
Odwirować probówki o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas gdy komórki granulują, przygotuj sześć probówek inkubacyjnych, oznaczając górne części probówek do mikrowirówek warunkami eksperymentalnymi. Należy użyć każdej permutacji GFP i mCherry.
Usunąć supernatant z 15-mililitrowych stożkowych probówek i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej stożkowej probówce. Następnie podwielokrotnić 200 000 komórek z każdego stanu do odpowiedniej probówki inkubacyjnej, aby uzyskać mieszaninę jeden do jednego w całkowitej objętości 500 mikrolitrów.
Po dokonaniu oceny agregacji linii podstawowej opisanej w następnym rozdziale, należy umieścić probówki inkubacyjne w powolnym rotatorze probówek w temperaturze pokojowej. Aby ocenić agregację, na początku badania i ponownie po 60 minutach, należy odpipetować 40 mikrolitrów z probówki inkubacyjnej na naładowane szkiełko mikroskopowe. Akwizycja wyjściowa powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe po dodaniu komórek do probówki mikrowirówkowej.
Wyobraź sobie slajd pod wpływem fluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Dla każdego slajdu uchwyć obrazy trzech różnych pól widzenia w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Komórki HEK-293T transfekowano białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, zmutowanym białkiem lub ligandem będącym przedmiotem zainteresowania i współtransfekowano białkiem fluorescencyjnym.
Populacje komórek wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania zmieszano z populacjami komórek wyrażającymi interesujący ligand i oceniono pod kątem agregacji po 60 minutach. W nakładkach obrazów przechwyconych w kanałach zielonym i czerwonym agregacja jest wyświetlana jako żółta kropka. Warunki, w których komórki nie wykazywały ekspresji żadnych ligandów synaptycznych, wykazywały minimalną agregację.
Wykazano również minimalną agregację, gdy tylko jedna z dwóch populacji wykazywała ekspresję ligandów synaptycznych. Nie wykazano agregacji, gdy dwie populacje komórek wyrażały niezgodne cząsteczki adhezyjne. Warunki z kompatybilnymi cząsteczkami adhezyjnymi wykazywały znaczną agregację po 60-minutowej inkubacji.
Co zaskakujące, zmutowane białko wykazywało znacznie większą agregację niż jego odpowiednik typu dzikiego, co sugeruje, że mutacja punktowa zwiększa zdolności wiązania białek. Mutacje w wielu cząsteczkach adhezyjnych są powszechnie związane z zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami. Dzięki tej technice można badać wpływ mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans, z wykorzystaniem podejścia fluorescencyjnej mikroskopi w komórkach HEK-293T. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie interakcji adhezji białek istotnych dla neurobiologii i potencjalnie innych obszarów badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Adhezja komórkowa
- Interakcje białkowe
Tło
- Interakcje ligand-receptor są krytyczne dla komunikacji komórkowej.
- Zrozumienie tych interakcji pomaga wyjaśnić mechanizmy zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych.
- Tradycyjne metody mogą wymagać rozległego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu.
- Niniejsze badanie proponuje efektywniejsze podejście z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopi.
Cel badania
- Rozwój szybkiego i efektywnego protokołu do badania adhezji białek w badaniu komórkowym.
- Ocenienie, jak mutacje punktowe w białkach wpływają na interakcje w trans.
- Zastosowanie tej metody w szerokim zakresie badań nad adhezą białek poza neurobiologią.
Stosowane metody
- Fluorescencyjna mikroskopia została zastosowana do obrazowania interakcji komórkowych.
- Komórki HEK-293T zostały użyte jako model biologiczny, koncentrując się na transfekcjonowanych białkach i ligandach.
- Ocena agregacji komórek miała miejsce po 60 minutach po transfekcji.
- Liczenie komórek przeprowadzono za pomocą hemocytometru, po czym komórki były resuspendowane i mieszane w celu obrazowania.
Główne wyniki
- Agregacja komórek wyrażających zgodne cząsteczki adhezji była znacząco wzmocniona po 60 minutach.
- Mutacje białek wykazywały większą agregację w porównaniu z ich odpowiednikami dzikiego typu, co wskazuje na lepsze zdolności wiązania.
- Minimalna agregacja była obserwowana, gdy ani jedna, ani tylko jedna populacja nie wyrażała ligandów synaptycznych.
Konkluzje
- Niniejsze badanie demonstruje usprawniony metodę oceny interakcji adhezji międzykomórkowych.
- Wyniki podkreślają potencjał tej techniki w badaniu wpływu mutacji na interakcje białkowe.
- Wnioski z tej metody są cenne dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw różnych zaburzeń neurorozwojowych i psychicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
