Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie
January 7th, 2019
Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białek białkowych, umożliwiając wykrycie nowych partnerów wiążących białka zewnątrzkomórkowe, zarówno przy wysokiej przepustowości, jak i wysokiej czułości. Główną zaletą tej metody jest to, że za pomocą zaledwie kilku mikrogramów białka można wygenerować setki preparatów za pomocą drukarki micro array. Do drukowania slajdów należy używać standardowego mikroukładu.
Ten instrument ma pojemność 57 slajdów na cykl, wykorzystuje głowicę drukującą mieszczącą 48 szpilek punktowych i może pomieścić do 8 000 punktów na szkiełko. Wygeneruj płytki robocze przy użyciu 384 płytek dołkowych po 10 mikrolitrów próbki na studzienkę z płytek podstawowych. Wykonaj ten krok ręcznie, przed rozpoczęciem drukowania slajdów za pomocą mikromacierzy.
Następnie natrzyj białka za pomocą szpilek punktowych typu quill na szkiełkach epoksydowo-silanowych przy wilgotności 60%, aby zapobiec odwodnieniu plamek białkowych. Albuminę surowicy bydlęcej znakowaną Cy3 można dostrzec w dwóch egzemplarzach między każdą próbką białka, aby uwidocznić układ do dopasowania maski. Po wydrukowaniu wyjmij szkiełka z mikromatrycy białkowej z wilgotnego środowiska.
Następnie użyj zamgławiacza ultradźwiękowego, aby wytworzyć delikatną mgiełkę roztworu blokującego, która osadza się na powierzchni szkiełka. Następnie zablokuj szkiełka na noc 5% mlekiem w PBST, aby aktywować powierzchnię. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w 50% glicerolu, aby zapobiec zamarzaniu.
Interakcje między białkami zewnątrzkomórkowymi często charakteryzują się niskim powinowactwem. Aby umożliwić wykrycie tych interakcji, poprzez zwiększenie awidności wiązania, opracowaliśmy podejście wielowartościowe oparte na wychwytywaniu badanego białka wyrażonego jako domeny zewnątrzkomórkowe znakowane FC na mikrokulkach pokrytych białkiem A. Zakręć nośnikiem IgG, który został oznaczony monoreaktywnym barwnikiem Cy5, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby obliczyć stosunek molowy białka pytającego i Cy5 IgG, podziel masę cząsteczkową białka pytającego przez masę cząsteczkową IgG i pomnóż przez 40 mikrogramów na mililitr, aby określić potrzebne stężenie Cy5 IgG. Po ustaleniu wszystkich proporcji utwórz kompleks białkowy z mikrokulkami, łącząc zapytanie oznaczone FC i Cy5 IgG z mikrokulkami białka A. Mieszać zawiesinę w PBS na rotatorze rurkowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
Aby rozpocząć przesiewanie, należy ogrzać przygotowane szkiełka w temperaturze pokojowej przed załadowaniem do stacji hybrydyzacyjnej. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe, najpierw przemyj mikromacierz PBST przez jedną minutę, aby usunąć resztki glicerolu. Załaduj 200 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr białka A do mleka PBS 5% i inkubuj przez 30 minut, aby zapobiec wiązaniu się mikrokulek nieskompleksowanego białka A z białkami znakowanymi FC, które mogą być obecne w mikromacierzy.
Po umyciu szkiełek PBST przez stację hybrydyzacyjną załadować 200 mikrolitrów kompleksu mikrokulek w obecności jednego miligrama na mililitr białka A i inkubować przez 30 minut. Po hybrydyzacji i umyciu szkiełek przez stację hybrydyzacyjną, przepłucz szkiełka wodą i umieść je w indywidualnych 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Wysuszyć probówki, wirując z prędkością 900 razy G przez pięć minut.
Na koniec zeskanuj szkiełka za pomocą skanera mikromatrycowego odpowiedniego do wykrywania fluorescencji Cy3 i Cy5 poprzez wzbudzanie odpowiednio przy 532 i 635 nanometrach. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz wydrukowanego slajdu. Plamki albuminy surowicy bydlęcej znakowane Cy3 są koloru zielonego.
Spoty zostały wydrukowane w dwóch egzemplarzach w ramach kontroli jakości procesu drukowania. Reprezentatywne wyniki białka sierocego, poddanego badaniom przesiewowym w celu identyfikacji partnerów wiążących przy użyciu technologii mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych, przedstawiono tutaj. Zduplikowane czerwone plamki są identyfikowane jako trafienie dla przesiewowego białka zapytania.
Ta opisana metoda jest bardzo wszechstronna i może być stosowana do drukowania szerokiej gamy bibliotek białek, niezależnie od tego, czy są to określone rodziny białek, czy duże kompilacje białek, takie jak nasze. Można ocenić każde białko będące przedmiotem zainteresowania. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się ze szkiełkami ostrożnie i upewnić się, że nie wysychają, aby zapobiec utracie aktywności wydrukowanych białek.
Po przeprowadzeniu badań przesiewowych interesującego białka zdecydowanie zaleca się dalszą walidację wszelkich zaobserwowanych trafień przy użyciu technologii ortogonalnych, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania interakcji białek zewnątrzkomórkowych u ludzi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do badania mikroarrayów białek pozakomórkowych w celu zidentyfikowania nowych interakcji receptor-liganda w wysokiej przepustowości. Opisuje również metodę zwiększenia wykrywania przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrocząsteczka.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Interakcje białko-białko
- Białka pozakomórkowe
- Wysoko przepustowe badania
Tło
- Rozumienie interakcji receptor-liganda jest kluczowe w biologii.
- Przejściowe interakcje białko-białko często są trudne do wykrycia.
- Mikroarraye zapewniają platformę do analizy wysoko przepustowości.
- Kompleksy białko-mikrocząsteczka mogą zwiększyć czułość wykrywania.
Cel badania
- Zidentyfikować nowe partnery wiązania dla białek pozakomórkowych.
- Poprawić czułość wykrywania przejściowych interakcji.
- Wykorzystać technologię mikroarrayów do efektywnego przesiewania.
Stosowane metody
- Wykorzystanie drukarek mikroarrayów do generowania ślizgów.
- Przygotowanie płyt roboczych z wykorzystaniem płyt 384-dołkowych.
- Ręczne przygotowanie próbek przed drukowaniem ślizgów.
- Drukowanie o dużej pojemności z wieloma ślizgami na jedno uruchomienie.
Główne wyniki
- Udane zidentyfikowanie nowych interakcji receptor-liganda.
- Wykazanie wysokiej czułości w wykrywaniu przejściowych interakcji.
- Efektywne wykorzystanie minimalnych ilości białka dla rozległego przesiewania.
- Generowanie setek ślizgów z zaledwie kilku mikrogramów białka.
Wnioski
- Protokół zwiększa zdolność do badania interakcji białkowych.
- Technologia mikroarrayów jest skuteczna dla analizy wysoko przepustowości.
- Ta metoda może znacząco posunąć naprzód badania nad biologią białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular protein microarray technology addresses a critical bottleneck in mapping low-affinity receptor-ligand interactions, which are central to target validation and therapeutic discovery. By enabling robust detection of transient extracellular protein interactions with minimal sample requirements, this approach enhances predictive confidence at the earliest stages of biopharma R&D. Its scalability and sensitivity support portfolio-wide interrogation of novel targets and de-risking of biological hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of novel extracellular binding partners for target validation.
- Supports biological de-risking by revealing previously undetectable low-affinity interactions.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein microarrays for downstream screening workflows.
- Standardizes detection of weak protein-protein interactions for reproducible assay development.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of extracellular protein libraries.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery findings with disease-relevant extracellular signaling pathways.
- Provides continuity from target identification to preclinical validation of interaction networks.
- De-risks translational progression by confirming functional extracellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This technology integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis-driven screening and mechanistic de-risking of extracellular targets.
- Discovery Biology: Enables high-sensitivity mapping of receptor-ligand networks for hypothesis testing.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts to support statistical evaluation of binding events.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming extracellular protein interactions relevant to disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable platform for repeated interrogation of diverse protein libraries across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows with minimal protein consumption and robust reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by clarifying extracellular interaction landscapes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, labeling, and microarray handling.
- Needs access to microarray printers, hybridization stations, and fluorescence scanners.
- Demands rigorous cross-team standardization for slide preparation and data analysis.
- Adaptable to various protein families and library sizes with careful protocol adherence.
- Dependent on orthogonal validation (e.g., surface plasmon resonance) for hit confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Extracellular Protein Microarray Printing
1:55
Preparation of Multivalent Bait Complexes
3:09
Extracellular Protein Microarray Screening
4:36
Results: Evaluation of Extracellular Protein Microarray Slide Printing and Screen of an Orphan Query Protein
5:11
Conclusion
