Name: Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj technologię mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych partnerów wiążących dla białek zewnątrzkomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Philamerowi Calsesowi i Kobe Yuenowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni Randy'emu Yenowi za doskonałe doradztwo techniczne.

1. Generowanie biblioteki zewnątrzkomórkowych białek ludzkich
<ol>
	<li>Sporządź listę receptorów powierzchniowych komórek lub wydzielanych białek, które Cię interesują, aby zbudować bibliotekę mikromacierzy białek. Do badania można wybrać określone rodziny białek (na przykład nadrodzinę immunoglobulin) lub białka selektywnie wyrażane w określonych typach komórek.</li>
	<li>W przypadku receptorów na powierzchni komórki należy określić granice domeny zewnątrzkomórkowej (ECD), identyfikując peptyd sygnałowy i regiony transbłonowe za pomocą narzędzi programowych. Niektóre z odpowiednich narzędzi, dostępnych bezpłatnie online, znajdują się w Tabeli materiałów15,16,17,18.</li>
	<li>Zsyntetyzuj ECD dla genów będących przedmiotem zainteresowania i sklonuj do odpowiedniego wektora. Wydzielane białka lub ECD receptorów STM połączonych z wieloma powszechnymi znacznikami powinowactwa mogą być oczyszczone z kondycjonowanych pożywek komórek transfekowanych odpowiednim wektorem lub z systemów ekspresji komórek bakulowirusa-owada. 
	Uwaga: Systemy oparte na komórkach ssaków (takie jak komórki HEK/293 lub CHO) są zalecane w celu maksymalizacji prawdopodobieństwa prawidłowego fałdowania białek i dodania odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja.</li>
	<li>Oczyść białka za pomocą standardowych metod oczyszczania powinowactwa. Wcześniejsze próby opisywały zautomatyzowane lub półautomatyczne procedury odpowiednie do oczyszczania setek białek, które można skalować w celu wygenerowania zestawu interesujących białek9,19,20,21. 
	Uwaga: SDS-PAGE, chromatografia wykluczania wielkości (S) lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego (MALLS) są zalecane w celu oceny każdej agregacji niekowalencyjnej i kontroli ogólnej jakości preparatów białkowych.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, dostosuj białka do 200 lub 400 μg/ml i rozcieńcz zapasy 80% glicerolem do długotrwałego przechowywania w fiolkach kriogenicznych w temperaturze -20 °C. Reprezentują one zapasy główne i powinny być dostępne tylko wtedy, gdy jest to konieczne.</li>
	<li>Przenieść porcje każdego białka (100 μl) na płytki 96-dołkowe (płytki podstawowe), zamknąć folią klejącą i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania szkiełek do mikromatrycy. Talerze wyjściowe są generowane w celu zminimalizowania cykli zamrażania i rozmrażania oraz zapewnienia stabilności białka.</li>
</ol>
2. Drukowanie mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych
<ol>
	<li>Do drukowania slajdów należy używać standardowego mikromacierzu. Przyrząd wykorzystany w opisanym tutaj protokole ma wydajność 57 slajdów / przebieg i wykorzystuje głowicę drukującą mieszczącą 48 kołków punktowych. Kołki te generują plamki o średnicy ~100 μm oddzielone odległością między punktami ~350 μm i pobierają 0,25 μl na ładunek. W tej konfiguracji można pomieścić do 8 000 miejsc na prowadnicę.</li>
	<li>Wygeneruj płytki robocze (płytki 384-dołkowe, 10 μl próbki/studzienkę) z płytek wyjściowych. Wykonaj ten krok ręcznie przed drukowaniem slajdów za pomocą mikromacierzy. Następnie natrzyj białka za pomocą szpilek do plam typu pióro na szkiełkach epoksysydowych przy wilgotności 60% (aby zapobiec odwodnieniu plamek białkowych). 
	Uwaga: Albuminę surowicy bydlęcej znakowaną Cy3 (BSA) można dostrzec w duplikatach między każdą próbką białka (5 μg/ml w PBS/40% glicerolu) w celu wizualizacji układu do dopasowania maski (patrz punkt 4). Chociaż jest to zalecane, ten krok jest opcjonalny.</li>
	<li>Po wydrukowaniu wyjmij szkiełka białkowe z mikromacierzy z wilgotnego środowiska i zablokuj je na noc 5% mlekiem w PBST, aby dezaktywować powierzchnię. 
	Uwaga: Preferowanym podejściem jest użycie zamgławiacza ultradźwiękowego w celu wytworzenia drobnej mgiełki roztworu blokującego, która osadza się na powierzchni szkiełka.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C w 50% glicerolu, aby zapobiec zamarzaniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kompleksów przynęt wielowartościowych
Uwaga: Interakcje między białkami zewnątrzkomórkowymi często charakteryzują się niskim powinowactwem. Aby umożliwić wykrywanie tych interakcji poprzez zwiększenie awidności wiązania, opracowano podejście wielowartościowe oparte na wychwytywaniu białka zapytania, wyrażonego jako ECD znakowane Fc, na mikrogranulkach pokrytych białkiem A4.
<ol>
	<li>Oznaczyć nośnik IgG używany do wykrywania barwnikiem monoreaktywnym Cy5 i oddzielić wolny barwnik za pomocą kolumn odsalających. Określić stosunek barwnika do białka, mierząc absorbancję ultrafioletu przy 280 i 650 nm. 
	Uwaga: Zwykle stosuje się proporcje białka do barwnika od 2,0 do 4,0. Zaleca się wirowanie koniugatów Cy5 przy 100 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia potencjalnych rozpuszczalnych agregatów w wyniku procesu znakowania.</li>
	<li>Określ optymalny stosunek mikrogranulek do białka poprzez miareczkowanie białka A w stosunku do stałej ilości białka pytającego. Do badań przesiewowych wykorzystuje się minimalną objętość nasycenia kulek, w których nie pozostaje wolne białko znakowane Fc, mierzoną za pomocą testu konkurencyjnego określonego za pomocą interferometrii biowarstw.</li>
	<li>Utworzyć kompleksy mikrokule-białko przez inkubację zapytania znakowanego Fc i Cy5-IgG z mikrogranulkami białka A i mieszać na rotatorze probówkowym w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.</li>
	<li>Aby utworzyć te kompleksy, należy użyć białka zapytania o końcowym stężeniu 20 μg/ml. Aby obliczyć stosunek molowy białka pytającego i Cy5-IgG, podziel masę cząsteczkową białka pytającego przez masę cząsteczkową IgG (150 000 Da) i pomnóż przez 40 μg/ml, aby określić potrzebne stężenie Cy5-IgG.</li>
	<li>Uzupełnić próbki rozpuszczalnym białkiem A (1 mg/ml) bezpośrednio przed inkubacją za pomocą szkiełek do mikromacierzy (patrz sekcja 4.2 poniżej), aby zapobiec wiązaniu się jakichkolwiek wolnych kulek białka A z białkami fuzyjnymi Fc, które mogą być obecne na matrycy. 
	Uwaga: Końcowa objętość reakcji może się różnić w zależności od użytej stacji hybrydyzacji lub komory inkubacyjnej. Oprzyrządowanie opisane w Tabeli Materiałów pozwala na inkubację próbki przy użyciu stosunkowo małych objętości (~200 μL na szkiełko).</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe i przetwarzanie mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych.
Uwaga: Jest wielu producentów, którzy oferują platformy automatycznego przetwarzania. Jeśli stacja hybrydyzacji nie jest dostępna, następujące kroki można wykonać ręcznie, upewniając się, że objętość bufora jest wystarczająca, aby szkiełka były przez cały czas zanurzone.
<ol>
	<li>Ogrzej szkiełka w temperaturze pokojowej i spłucz PBS/0,1% Tween 20 (PBST) w celu usunięcia pozostałości glicerolu przed załadowaniem do stacji hybrydyzacji.</li>
	<li>Należy zastosować następujący protokół kontroli przesiewowej:
	<ol>
		<li>Myć PBST przez 1 min.</li>
		<li>Załaduj 200 μl 1 mg/ml białka A do PBS/5% mleka i inkubuj przez 30 minut, aby zapobiec wiązaniu się nieskompleksowanych mikrogranulek białka A z białkami znakowanymi Fc, które mogą być obecne w mikromacierzy.</li>
		<li>Umyć pięć razy PBST przez 1 min.</li>
		<li>Załadować 200 μl kompleksu zapytanie: mikrogranulki w obecności 1 mg/ml białka A i inkubować przez 30 minut.</li>
		<li>Myć PBST przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po hybrydyzacji przepłukać szkiełka wodą, umieścić w pojedynczych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i wysuszyć, wirując w temperaturze 900 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Na koniec zeskanuj szkiełka za pomocą skanera mikromatrycowego odpowiedniego do wykrycia fluorescencji Cy3 (jeśli wydrukowano BSA-Cy3) i Cy5 poprzez wzbudzenie odpowiednio przy 532 i 635 nm.</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych, korzystając z dołączonej analizy danych z mikromacierzy. Odpowiednia lista tablic (w postaci pliku .gal) jest ładowana do oprogramowania do ekstrakcji danych. Na tym etapie wykorzystaj miejsca Cy3-BSA, aby znaleźć bloki i skorzystać z opcji automatycznego dopasowania w oprogramowaniu, a następnie w razie potrzeby ręcznie wyrównaj funkcje. Zapisz pliki jako pliki .gpr do dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Zapisz dane jako pliki GPR i przetwarzaj je w R za pomocą pakietu limma, powszechnie używanego do analizy danych z mikromacierzy4,5.
	<ol>
		<li>W celu wstępnego przetwarzania wykonaj korekcję tła i normalizację wewnątrz slajdu. Ponieważ każde białko jest drukowane w zduplikowanych miejscach, połącz oba powtórzone pomiary, aby utworzyć jeden wynik dla tego białka w bibliotece.</li>
		<li>Oblicz wyniki dla każdego slajdu i przeanalizuj wyniki dla przecięcia się wysoko ocenionych kandydatów między slajdami.</li>
		<li>Użyj zduplikowanych mikromacierzy z oddzielnych nakładów, aby kontrolować zmienność slajdów i użyj wykresów przecięć reprezentujących dane z obu ekranów, aby wywołać końcowe trafienia.</li>
		<li>Na koniec wykonaj dodatkowy poziom filtrowania, aby wykluczyć rozwiązłe białka w macierzy. Takie niespecyficzne spoiwa są identyfikowane jako białka przekraczające określoną progową częstotliwość trafień zdefiniowaną przez użytkownika na niezależnych ekranach. 
		Uwaga: Ten protokół jest szczegółowo opisany w Tom et al. 20135. W naszym przypadku niespecyficzne wywołanie bindera opiera się na określeniu skumulowanego współczynnika trafień zdobyczy i stosuje się próg eliminacji oparty na danych wynoszący 5%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li>
<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li>
<li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li>
<li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li>
<li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li>
<li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Binds+to+Apolipoproteins%2C+Including+APOE+and+CLU%2FAPOJ%2C+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li>
<li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473(2016).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li>
<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li>
<li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/nar/article-abstract/35/suppl_2/W429/2920784">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li>
<li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOPCONS%3A+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9(2002).</li>
<li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+mammalian+protein+expression%2C+purification%2C+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li>
<li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secreted+protein+discovery+initiative+%28SPDI%29%2C+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins%3A+a+bioinformatics+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li>
</ol>

B.H., S.R-R i N.M-M. są pracownikami Genentech i posiadają udziały w grupie Genentech Inc./Roche.

Znaczna liczba receptorów sierocych pozostaje w ludzkim genomie, a nowi partnerzy oddziałujący nadal pojawiają się dla białek zewnątrzkomórkowych z wcześniej scharakteryzowanymi ligandami. Zdefiniowanie interakcji receptor-ligand w organizmach ludzkich i modelowych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów, które dyktują komunikację komórkową podczas homeostazy, a także dysregulacji prowadzącej do choroby, a tym samym do informowania o nowych lub ulepszonych opcjach terapeutycznych. Niemniej jednak wykrywanie zewnątrzkom...

Omawiana tutaj metoda opisuje drukowanie zbioru białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikrotablicy, a następnie metodę przesiewową celu zainteresowania w stosunku do tej biblioteki. Zidentyfikowaliśmy multimeryzację białek jako kluczowy krok w wykrywaniu interakcji charakteryzujących się niskim powinowactwem do wiązania. Aby usprawnić wykrywanie tych interakcji, opisujemy protokół oparty na multimeryzacji interesującego nas białka zapytania za pomocą mikrogranulek.
Wydzielane i wyrażane na powierzchni komórki białka (zbiorczo określane jako białka zewnątrzkomórkowe) wraz z ich współdziałającymi partnerami są kluczowymi regulatorami komunikacji komórkowej, sygnalizacji i interakcji z mikrośrodowiskiem. Są zatem niezbędne w regulacji wielu procesów fizjologicznych i patologicznych. Około jedna czwarta ludzkiego genomu (≈5 000 białek) koduje białka zewnątrzkomórkowe, które, biorąc pod uwagę ich znaczenie i dostępność dla systematycznie dostarczanych leków, stanowią kluczowe cele dla rozwoju leków1. W związku z tym białka zewnątrzkomórkowe stanowią ponad 70% docelowych białek o znanym działaniu farmakologicznym dla leków dopuszczonych do obrotu, znanych jako "proteom lekowy". Pomimo ich znaczenia i obfitości, sieci zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko (ePPI) pozostają niezwykle niedostatecznie reprezentowane w dostępnych bazach danych. Wynika to zasadniczo ze złożonej biochemicznej natury białek zewnątrzkomórkowych, która uniemożliwia ich scharakteryzowanie przy użyciu większości dostępnych technologii2. Po pierwsze, białka błonowe są trudne do rozpuszczania, co często wiąże się z trudnymi warunkami prania i detergentami; Po drugie, białka zewnątrzkomórkowe często nie mają odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, które są nieobecne, gdy białka te ulegają ekspresji w powszechnie stosowanych układach heterologicznych. Wreszcie, interakcje między receptorami, takie jak koreceptory ulegające ekspresji na komórkach odpornościowych, są często przejściowe i charakteryzują się bardzo niskim powinowactwem (KD w zakresie od ~1 μM do >100 μM). Ogólnie rzecz biorąc, charakter tych białek i ich partnerów wiążących sprawia, że większość powszechnie stosowanych technologii, takich jak oczyszczanie powinowactwa/spektrometria mas (AP/MS) lub drożdże dwuhybrydowe, nie nadaje się do wykrywania interakcji w przestrzeni zewnątrzkomórkowej2,3.
Aby przezwyciężyć te techniczne wyzwania i przyspieszyć odkrywanie nowych interakcji dla białek zewnątrzkomórkowych, opracowaliśmy mikromacierz białek zewnątrzkomórkowych o wysokim zasięgu4,5. Mikromacierze mają tę zaletę, że generują powierzchnie o dużej gęstości z niewielkimi ilościami próbki i są generalnie podatne na badania o wysokiej przepustowości. Badania oparte na mikromacierzach białkowych dostarczyły wcześniej istotnych informacji na temat interakcji białkowych dla kilku organizmów modelowych, choć głównie koncentrują się na interakcjach cytozolowych lub na określonych rodzinach białek6,7,8. W przeciwieństwie do tego, wykonano ograniczone prace w celu zbadania interakcji białek zewnątrzkomórkowych przy użyciu tej technologii. Opracowaliśmy metodę mikromacierzy białkowych, aby umożliwić badania ePPI, budując obszerną i wysoce zróżnicowaną bibliotekę oczyszczonych wydzielanych białek i pojedynczych receptorów transbłonowych (STM) wyrażonych jako rekombinowane domeny zewnątrzkomórkowe (ECD) połączone ze wspólnymi znacznikami w celu oczyszczania powinowactwa4. Sukces badań przesiewowych mikromacierzy białkowych zależy w dużej mierze od stworzenia wysokiej jakości biblioteki białek. Do ekspresji zarówno białka bibliotecznego, jak i białkowego zapytania, komórki ssaków lub komórek owadów zostały preferencyjnie wybrane jako heterologiczne systemy ekspresji, aby zapewnić prawidłowe dodanie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja lub wiązania dwusiarczkowe. SDS-PAGE, chromatografia wykluczania wielkości i wielokątowe rozpraszanie światła laserowego są technikami powszechnie stosowanymi do oceny jakości białek rekombinowanych. Biblioteka białek jest następnie nanoszona na szkiełka epoksydosilowe i przechowywana w temperaturze -20 °C do długotrwałego użytkowania. Stężenia białka powyżej 0,4 mg/ml są zalecane dla protokołu opisanego poniżej. W związku z tym białka o niskiej ekspresji mogą wymagać etapu koncentracji przed drukowaniem i przechowywaniem próbki. Niemniej jednak główną zaletą tej techniki jest niewielka wymagana ilość białka (50 μg białka wystarcza do wykonania >2000 badań przesiewowych), przy minimalnym zużyciu białka zapytania (20-25 μg na badanie przesiewowe). Korzystając z opisanego tutaj protokołu i sprzętu oraz pod warunkiem, że dostępne są biblioteki, wyniki dla poszczególnych białek zapytania mogą być generowane w ciągu jednego dnia roboczego.
Głównym wyzwaniem w wykrywaniu interakcji białek w środowisku zewnątrzkomórkowym jest ich charakterystycznie słaby lub przejściowy charakter, który uniemożliwia identyfikację za pomocą najczęściej stosowanych metodologii. Zwiększenie awidności wiązania znacznie poprawia czułość wykrywania słabych oddziaływań białkowych9,10,11. Opierając się na tej zasadzie, opracowaliśmy metodę multimeryzacji białek zapytania (wyrażonej jako fuzja Fc) za pomocą kulek powlekanych białkiem A4,5. Aby uniknąć potencjalnej inaktywacji białka pytającego przez losowe znakowanie, zamiast tego oznaczamy nieistotną ludzką immunoglobulinę G za pomocą Cy5 i dodajemy ją wraz z białkiem pytającym do kulek białka A, eliminując w ten sposób wszelkie artefakty spowodowane bezpośrednim sprzężeniem barwnika z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę powinowactwo mikromolowe kilku par koreceptorów, wielowartościowe kompleksy znacznie zwiększają stosunek sygnału do szumu w porównaniu z białkami zapytania o fuzję Fc przesiewanymi jako białka rozpuszczalne4.
Podsumowując, celem tego protokołu jest opisanie przygotowania preparatów mikromacierzy zawierających istniejącą wcześniej bibliotekę białek zewnątrzkomórkowych do identyfikacji interakcji receptor-ligand. Dokonujemy przeglądu kroków drukowania slajdów, a następnie protokołu badania przesiewowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w stosunku do biblioteki białek zewnątrzkomórkowych. Ponadto opisano metodę wzmocnionego wykrywania ePPI w oparciu o mikrogranulki w celu uzyskania zwiększonej awidności badanego białka. Opisana tutaj technologia mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych stanowi szybkie, solidne i skuteczne podejście do badań przesiewowych i wykrywania nowych ePPI o niskim współczynniku wyników fałszywie dodatnich oraz przy wykorzystaniu wyłącznie mikrogramowych ilości badanego białka zapytania. Technologia ta przyczyniła się do wielu badań, które dostarczyły istotnych informacji na temat nieznanych wcześniej funkcji komórkowych i szlaków sygnałowych dla różnych receptorów12,13, w tym immunoregulatorów wirusa14, i może być wykorzystana do de-sierotylizacji dowolnego interesującego białka zewnątrzkomórkowego.

<table><tbody><tr><td>Ultra Pure MB Grade glicerol</td><td>USB Corporation</td><td>56-81-5</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>blokujący SeptoMark do przechowywania białek&nbsp;</td><td>Zeptosens</td><td>BB1, 90-40</td><td>Szkiełka mikromacierzy buforowej blokującej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Roche</td><td>03-117-957-001</td><td>Suwak do zakładania maski (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Polipropylenowe płytki wielodołkowe</td><td>Greiner Bio One</td><td>82050-678</td><td>Magazynowanie białka</td></tr><tr><td>Polipropylenowe płytki wielodołkowe</td><td>Arrayit</td><td>MMP384</td><td>Drukowanie slajdów</td></tr><tr><td>NanoPrint LM60, lub podobny kontakt mikromacierz</td><td>Arrayit</td><td>NanoPrint LM60 lub podobny mikromacierz kontaktowa</td><td>Druk slajdów</td></tr><tr><td>Mikroszpilki</td> punktowe <td>Arrayit</td><td>Micro szpilki do punktowania</td><td>Drukowanie slajdów</td></tr><tr><td>Stacja blokująca ZeptoFOG</td><td>Zeptosens</td><td>Stacja blokująca ZeptoFOG, 1210</td><td>Prowadnice blokowe po wydrukowaniu</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031</td><td>Roztwór</td></tr> <tr><td>blokującySzkiełko szklane pokryte żywicą epoksysydową</td><td>Nextrion Slide E</td><td>1064016</td><td>Szkiełka Microarray</td></tr><tr><td>Zestaw uchwytów na szkło i stojaków na szkiełka</td><td>Wheaton</td><td>900303</td><td>Przechowywanie szkiełek</td></tr><tr><td>Barwnik monoreaktywny Cy5</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>Etykietowanie albuminy</td></tr><tr><td>Barwnik monoreaktywny Cy5</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td>Znakowanie ludzkiej IgG Kolumna</td></tr><tr><td>odsalająca Pro-spin</td><td>Princeton Separacje</td><td>CS-800</td><td>Usuń wolny barwnik</td></tr><tr><td>Samoprzylepna uszczelka z folii aluminiowej</td><td>AlumaSeal</td><td>F-384-100</td><td>Uszczelka talerzy</td></tr><tr><td>magazynowych Fiolki kriogeniczne z polipropylenu</td><td>Fiolki Corning</td><td>430658</td><td>Master do przechowywania biblioteki białek</td></tr><tr><td>Mikrogranulki białka A</td><td>Miltenyi</td><td>120-000-396</td><td>Zapytanie o multimeryzację białka</td></tr><tr><td>Ludzka IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>& nbsp; 009-000-003</td><td>Nieistotne IgG do znakowania</td></tr><tr><td>białka A</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P7837</td><td>Blokowanie szkiełek mikromacierzy</td></tr><tr><td>Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna</td><td>Miltenyi</td><td>Stacja hybrydyzacyjna, a-Hyb lub podobna</td><td>Automatyczne przetwarzanie mikromacierzy (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Skaner GenePix 4000B lub podobne</td><td>urządzenia molekularne Skaner</td><td>GenePix 4000B lub podobny</td><td>Skanowanie slajdów</td></tr><tr><td>GenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych</td><td>Urządzenia</td> <td>molekularneGenePix Pro lub równoważne oprogramowanie do ekstrakcji danych</td><td>Przetwarzanie danych</td></tr><tr><td>Signal P4.1</td><td>DTU Bioinformatyka,</td><td>oprogramowanie online</td> Duńskiego Uniwersytetu <td>Technicznego Narzędzie predykcyjne do określania obecności i lokalizacji miejsc rozszczepienia peptydów sygnałowych</td></tr><tr><td>Serwer TMHMM 2.0</td><td>DTU Bioinformatyka, oprogramowanie online Duńskiego Uniwersytetu Technicznego</td><td></td><td>Przewidywanie helis transbłonowych w białkach</td></tr><tr><td>Phobius</td><td>Oprogramowanie online Centrum Bioinformatyki w Sztokholmie</td><td></td><td>Połączone topologia transbłonowa i predyktor peptydów sygnałowych</td></tr><tr><td>TOPCONS</td><td>Oprogramowanie online</td><td>Uniwersytetu Sztokholmskiego</td><td>Przewidywanie topologii błony i peptydów sygnałowych</td></tr></tbody></table>

technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Czynniki wydzielane, receptory na uwięzi błonowej i ich partnerzy oddziałujący są głównymi regulatorami komunikacji komórkowej i inicjacji kaskad sygnałowych podczas homeostazy i choroby, i jako takie stanowią główne cele terapeutyczne. Pomimo ich istotności, te sieci interakcji są nadal znacznie niedostatecznie reprezentowane w obecnych bazach danych; Dlatego większość białek zewnątrzkomórkowych nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Rozbieżność ta wynika przede wszystkim z wyzwań związanych z badaniem białek zewnątrzkomórkowych, w tym ekspresji białek funkcjonalnych oraz słabych, niskich powinowacyzmów białkowych często tworzonych między receptorami na powierzchni komórki. Celem tej metody jest opisanie drukowania biblioteki białek zewnątrzkomórkowych w formacie mikromacierzy do badań przesiewowych interakcji białko-białko. Aby umożliwić wykrycie słabych oddziaływań, opisano metodę opartą na multimeryzacji badanego białka pytającego. W połączeniu z tym podejściem do multimeryzacji opartym na mikrokulkach w celu zwiększenia wielowartościowości, mikromacierz białkowa umożliwia niezawodne wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko przy wysokiej przepustowości. Metoda ta oferuje szybkie i nisko zużywające próbkę podejście do identyfikacji nowych interakcji mających zastosowanie do dowolnego białka zewnątrzkomórkowego. Opisano protokół drukowania i badań przesiewowych mikromacierzy białkowych. Technologia ta będzie przydatna dla badaczy poszukujących solidnej metody odkrywania interakcji białkowych w przestrzeni zewnątrzkomórkowej.

Schemat przepływu pracy dla technologii mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych przedstawiono na Rysunku 1. Po przygotowaniu szkiełek z mikromacierzami zawierającymi bibliotekę białek zewnątrzkomórkowych, przesiewanie białka docelowego oraz analiza danych mogą zostać ukończone w ciągu jednego dnia. Wiele fizjologicznie istotnych oddziaływań między receptorami osadzonymi w błonie charakteryzuje się bardzo słabym powinowactwem (KD w zakresie mikromo...

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białek białkowych, umożliwiając wykrycie nowych partnerów wiążących białka zewnątrzkomórkowe, zarówno przy wysokiej przepustowości, jak i wysokiej czułości. Główną zaletą tej metody jest to, że za pomocą zaledwie kilku mikrogramów białka można wygenerować setki preparatów za pomocą drukarki micro array. Do drukowania slajdów należy używać standardowego mikroukładu.Ten instrument ma pojemność 57 slajdów na cykl, wykorzystuje głowicę drukującą mieszczącą 48 szpilek punktowych i może pomieścić do 8 000 punktów na szkiełko. Wygeneruj płytki robocze przy użyciu 384 płytek dołkowych po 10 mikrolitrów próbki na studzienkę z płytek podstawowych. Wykonaj ten krok ręcznie, przed rozpoczęciem drukowania slajdów za pomocą mikromacierzy.Następnie natrzyj białka za pomocą szpilek punktowych typu quill na szkiełkach epoksydowo-silanowych przy wilgotności 60%, aby zapobiec odwodnieniu plamek białkowych. Albuminę surowicy bydlęcej znakowaną Cy3 można dostrzec w dwóch egzemplarzach między każdą próbką białka, aby uwidocznić układ do dopasowania maski. Po wydrukowaniu wyjmij szkiełka z mikromatrycy białkowej z wilgotnego środowiska.Następnie użyj zamgławiacza ultradźwiękowego, aby wytworzyć delikatną mgiełkę roztworu blokującego, która osadza się na powierzchni szkiełka. Następnie zablokuj szkiełka na noc 5% mlekiem w PBST, aby aktywować powierzchnię. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w 50% glicerolu, aby zapobiec zamarzaniu.Interakcje między białkami zewnątrzkomórkowymi często charakteryzują się niskim powinowactwem. Aby umożliwić wykrycie tych interakcji, poprzez zwiększenie awidności wiązania, opracowaliśmy podejście wielowartościowe oparte na wychwytywaniu badanego białka wyrażonego jako domeny zewnątrzkomórkowe znakowane FC na mikrokulkach pokrytych białkiem A. Zakręć nośnikiem IgG, który został oznaczony monoreaktywnym barwnikiem Cy5, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby obliczyć stosunek molowy białka pytającego i Cy5 IgG, podziel masę cząsteczkową białka pytającego przez masę cząsteczkową IgG i pomnóż przez 40 mikrogramów na mililitr, aby określić potrzebne stężenie Cy5 IgG. Po ustaleniu wszystkich proporcji utwórz kompleks białkowy z mikrokulkami, łącząc zapytanie oznaczone FC i Cy5 IgG z mikrokulkami białka A. Mieszać zawiesinę w PBS na rotatorze rurkowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.Aby rozpocząć przesiewanie, należy ogrzać przygotowane szkiełka w temperaturze pokojowej przed załadowaniem do stacji hybrydyzacyjnej. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe, najpierw przemyj mikromacierz PBST przez jedną minutę, aby usunąć resztki glicerolu. Załaduj 200 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr białka A do mleka PBS 5% i inkubuj przez 30 minut, aby zapobiec wiązaniu się mikrokulek nieskompleksowanego białka A z białkami znakowanymi FC, które mogą być obecne w mikromacierzy.Po umyciu szkiełek PBST przez stację hybrydyzacyjną załadować 200 mikrolitrów kompleksu mikrokulek w obecności jednego miligrama na mililitr białka A i inkubować przez 30 minut. Po hybrydyzacji i umyciu szkiełek przez stację hybrydyzacyjną, przepłucz szkiełka wodą i umieść je w indywidualnych 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Wysuszyć probówki, wirując z prędkością 900 razy G przez pięć minut.Na koniec zeskanuj szkiełka za pomocą skanera mikromatrycowego odpowiedniego do wykrywania fluorescencji Cy3 i Cy5 poprzez wzbudzanie odpowiednio przy 532 i 635 nanometrach. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz wydrukowanego slajdu. Plamki albuminy surowicy bydlęcej znakowane Cy3 są koloru zielonego.Spoty zostały wydrukowane w dwóch egzemplarzach w ramach kontroli jakości procesu drukowania. Reprezentatywne wyniki białka sierocego, poddanego badaniom przesiewowym w celu identyfikacji partnerów wiążących przy użyciu technologii mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych, przedstawiono tutaj. Zduplikowane czerwone plamki są identyfikowane jako trafienie dla przesiewowego białka zapytania.Ta opisana metoda jest bardzo wszechstronna i może być stosowana do drukowania szerokiej gamy bibliotek białek, niezależnie od tego, czy są to określone rodziny białek, czy duże kompilacje białek, takie jak nasze. Można ocenić każde białko będące przedmiotem zainteresowania. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się ze szkiełkami ostrożnie i upewnić się, że nie wysychają, aby zapobiec utracie aktywności wydrukowanych białek.Po przeprowadzeniu badań przesiewowych interesującego białka zdecydowanie zaleca się dalszą walidację wszelkich zaobserwowanych trafień przy użyciu technologii ortogonalnych, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania interakcji białek zewnątrzkomórkowych u ludzi.

extracellular-protein-microarray-technology-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Poznaj technologię mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych partnerów wiążących dla białek zewnątrzkomórkowych.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie (Wideo) | JoVE Journal

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Przeglądaj więcej filmów