Name: Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny śmierci komórek raka jelita grubego przy użyciu bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych indukujących apoptozę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez programy "Ustanowienie standardów pomiarowych dla chemii i promieniowania", grant numer KRISS-2020-GP2020-0003, oraz "Rozwój standardów pomiarowych i technologii dla biomateriałów i konwergencji medycznej", numer grantu KRISS-2020-GP2020-0004, finansowane przez Koreański Instytut Badań nad Standardami i Nauką. Badania te były również wspierane przez Ministerstwo Nauki i ICT (MSIT), Koreańską Narodową Fundację Badawczą (NRF-2019M3A9F3065868), Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (MOHW), Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Opieki Zdrowotnej (KHIDI, HI20C0558), Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE) oraz Koreański Instytut Oceny Technologii Przemysłowej (KEIT, 20009350). Identyfikator ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Numer telefonu: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Dziękujemy Chang Woo Park za pomoc w eksperymentach.

1. Hodowle komórek bakteryjnych i przygotowanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS)
UWAGA: Kroki 1.2 - 1.9 są przeprowadzane w komorze beztlenowej.
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę agarową MRS i bulion zawierający L-cysteinę i sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Wstępnie inkubować płytkę agarową MRS w komorze beztlenowejH2 utrzymywanej w temperaturze 37 °C z 20 ppm tlenu.</li>
	<li>Rozmrozić materiał bakteryjny Lactobacillus i zaszczepić płytkę agarową kulturą bakteryjną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A (i)).</li>
	<li>Inkubować bakterie przez 2 - 3 dni w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu, aż do uzyskania pojedynczych kolonii bakteryjnych.</li>
	<li>Umyj i osusz probówkę do hodowli beztętnianowej typu Hungate. Autoklawować probówkę hodowlaną w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Następnie inkubować probówkę w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu w celu usunięcia tlenu.</li>
	<li>Umieść 2-3 ml bulionu MRS w probówce. Uszczelnij rurkę korkiem z gumy butylowej i zakręć nakrętkę.</li>
	<li>Uzyskać pojedynczą kolonię z pętlą i umieścić ją w probówce hodowlanej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 1x PBS. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A (ii)).</li>
	<li>Zawiesić kolonię za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A (iii)). W tym celu należy umieścić igłę strzykawki o pojemności 1 ml w środku wieczka probówki, zasysać zawieszoną kolonię, a następnie ponownie umieścić ją w pożywce bulionowej MRS. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A (iv)).</li>
	<li>Inkubować pożywkę bulionową MRS w inkubatorze z wytrząsarką przez 2 dni (37 °C, 5% CO2, 200 obr./min).</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru w celu monitorowania krzywych wzrostu bakterii, aż absorbancja przy OD620 osiągnie 2,0.</li>
	<li>Oddzielić granulki bakteryjne od kondycjonowanej pożywki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 15 minut. Umyj zebrane granulki bakteryjne 1x PBS i ponownie zamieszaj w 4 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Nie należy dodawać żadnych antybiotyków do pożywki.</li>
	<li>Utrzymuj granulki bakteryjne w RPMI i inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przy prędkości 100 obr./min.</li>
	<li>W celu przygotowania supernatantu probiotycznego usunąć osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskany supernatant należy sterylnie przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Generowanie sferoid
<ol>
	<li>Przygotowanie linii komórkowych raka jelita grubego
	<ol>
		<li>Hoduj linie komórkowe DLD-1, HT-29 i WiDr jako monowarstwy do 70-80% zbiegu i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 (pożywka wzrostowa: RPMI zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny).</li>
		<li>W przypadku komórek hodowanych na szalce Petriego o średnicy 100 mm należy dwukrotnie przemyć płytkę 4 ml 1x PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować szalkę Petriego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu dysocjacji komórek.</li>
		<li>Po inkubacji sprawdź dysocjację komórek pod mikroskopem i zneutralizuj trypsynę-EDTA za pomocą 5 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić ponownie z 3 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić żywe komórki za pomocą hemocytometru. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B (i))</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formacja sferoidalna
	<ol>
		<li>W stożkowej probówce o pojemności 15 ml rozcieńczyć komórki od 2.1.5, aby uzyskać 1 - 2 x 105 komórek/ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B (ii))</li>
		<li>Dodać końcowe stężenie 0,6% metylocelulozy do zawiesiny komórek i przenieść rozcieńczone komórki do sterylnego zbiornika. 
		UWAGA: Dla każdej linii komórkowej należy miareczkować i odpowiednio określać potrzebną ilość metylocelulozy.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 200 μl komórek do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim nasadce. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B (iii))</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 24-36 godzin.</li>
		<li>Po 24 - 36 godzinach obserwuj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że tworzy się sferoidy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie komórek 3D raka jelita grubego za pomocą LCFS
<ol>
	<li>Wygeneruj sferoidy zgodnie z opisem w krokach 2 i 3.</li>
	<li>Przed wykonaniem zabiegu LCFS należy rozmrozić zamrożony LCFS w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 - 20 minut.</li>
	<li>Zaszczepić roztwór podstawowy LCFS w pożywce wzrostowej. Seryjnie rozcieńczyć do 25%, 12,5% i 6% w pożywce wzrostowej (tj. 25% LCFS = 150 μL pożywki wzrostowej + 50 μL LCFS).</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sferoidy i usunąć jak najwięcej pożywki wzrostowej z każdej studzienki za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Dodać pożywkę wzrostową z LCFS na komórki i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 - 48 godzin 
	UWAGA: Objętość, która ma być użyta, będzie zależeć od rozmiaru płytki w następujący sposób: 2 ml dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; 200 μl dla 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
4. Żywotność komórek dla sferoidów
<ol>
	<li>Przygotuj 8 - 10 sferoid raka jelita grubego leczonych LCFS na nieprzezroczystych płytkach wielodołkowych (testy żywotności komórek wykonuje się 48 godzin po leczeniu LCFS).</li>
	<li>Rozmrozić odczynnik do żywotności komórek (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przed użyciem wyrównać odczynnik żywotności komórek do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przed wykonaniem testu należy usunąć 50% pożywki wzrostowej ze sferoid.</li>
	<li>Dodać 100 μl odczynnika żywotności komórek do każdego dołka. 
	UWAGA: Objętość, która ma być użyta, będzie zależeć od rozmiaru płytki w następujący sposób: 100 μl dla 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Mieszaj odczynnik energicznie przez 5 minut, aby przyspieszyć lizę komórek.</li>
	<li>Inkubować przez 30 min – 2 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zapisz luminescencję.</li>
</ol>
5. Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym dla sferoidów
<ol>
	<li>Dla każdego warunku przygotuj 10 - 15 sferoid w probówce o pojemności 2 ml i odwiruj przez 3 minuty przy 400 x g.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć sferoidy w 1 ml lodowatego środka 1x PBS. 
	UWAGA: Unikaj wirowania, pozwól sferoidom się uspokoić.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej 1x PBS i wyizolować RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu.</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA z 1 μg RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową, aby wszystkie próbki rozprowadzić w trzech egzemplarzach (zob. tabela 1 i tabela 2).</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację w 20 μl wzorcowej mieszaniny matrycy do każdej płytki qPCR.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj reakcje i w razie potrzeby odwiruj.</li>
	<li>Uruchom próbki zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia (Tabela 3).</li>
</ol>
6. Western blot ze sferoidów
UWAGA: Podczas zbierania sferoid użyj pipety o pojemności 200 μL i odetnij końcówki końcówek, aby nie naruszyć ich struktury.
<ol>
	<li>Dla każdego warunku przygotuj 30 - 40 sferoid w probówce o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie i pozwól sferoidom osiąść na dnie probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć sferoidy w 1 ml lodowatego środka 1x PBS 
	UWAGA: Unikaj wirowania, pozwól sferoidom się uspokoić.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej 1x PBS i dodać bufor RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy (10 sferoid = 30 μl buforu RIPA).</li>
	<li>Poddać komórki lizie przez pipetowanie w górę i w dół i wykonywać sonikację przez 30 sekund z 30 sekundami odpoczynku na lodzie przez 10 cykli.</li>
	<li>Odwirować lizaty białkowe przy 15000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Określ stężenie białka dla każdego lizatu komórkowego.</li>
	<li>Przed załadowaniem gotować lizat komórkowy w buforze do próbek w temperaturze 100 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Załaduj równe ilości białka do studzienek żelu SDS-PAGE i uruchom żel przez 1 - 2 godziny pod napięciem 100 V.</li>
	<li>Przenieś białko z żelu do membrany PVDF.</li>
	<li>Po przeniesieniu zablokować membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego (5% mleka odtłuszczonego + TBS z 0,05% Tween-20).</li>
	<li>Inkubować błonę z rozcieńczeniami pierwszorzędowego przeciwciała w stosunku 1:1 000 (Tabela 4) w 1x TBST z 5% buforem BSA w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj membranę trzykrotnie TBST, 15 minut na każde pranie.</li>
	<li>Inkubować błonę z rozcieńczeniami przeciwciała drugorzędowego w proporcji 1:2,500 w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umyj membranę trzykrotnie TBST, 15 minut na każde pranie.</li>
	<li>Przygotować membranę do detekcji HRP za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów chemiluminescencyjnych.</li>
</ol>
7. Barwienie sferoidów jodkiem propidyny (PI)
<ol>
	<li>Przygotować 5-10 sferoid zgodnie z opisem w kroku 4.1 i umieścić sferoidy w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Rozcieńczyć zapas 1 mg/ml PI 1:100 w 1x PBS.</li>
	<li>Usuń 50% pożywki z każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu PI do każdej studzienki i umieścić studzienki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 10 - 15 minut.</li>
	<li>Przepłukać roztwór PI 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 200 μl pożywki wzrostowej i wykonać zdjęcie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przeanalizuj intensywność fluorescencji za pomocą obrazu J, aby uzyskać liczbę żywotności sferoidy.</li>
</ol>
8. Analiza FACS sferoidów
<ol>
	<li>Wygeneruj sferoidy zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
	<li>Dla każdego warunku przygotuj 30 - 40 sferoid w probówce FACS i odwiruj przez 3 minuty przy 400 x g i RT.</li>
	<li>Odessać supernatant i przemyć sferoidy w 3 ml 1 PBS, a następnie odwirować przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 200 μl 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 -3 minuty 
	UWAGA: Czas inkubacji zależy od wielkości sferoidy i typu komórki.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS i delikatnie rozdzielić sferoidy za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 3 min. 
	UWAGA: Bufor FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrowany za pomocą górnego filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać odczynnik 7-AAD/Aneksyna V (7AAD (5 μl), Aneksyna V (5 μl)/próbkę).</li>
	<li>Delikatnie zwirować komórki i inkubować przez 13 - 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu FACS i przefiltrować komórki za pomocą stożkowych probówek z polistyrenu w celu usunięcia komórek zbiorczych.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g i 4 °C przez 3 min.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu wiążącego Aneksyna V do każdej probówki i ponownie zawiesić.</li>
	<li>Analizuj za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+molecular+insights+into+the+interaction+between+probiotics+and+the+host+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).</li>
<li>Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacteria+and+their+molecular+communication+with+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).</li>
<li>Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+and+prebiotics+in+intestinal+health+and+disease%3A+from+biology+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).</li>
<li>Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics%2C+prebiotics+and+synbiotics-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review.</a> Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).</li>
<li>Harish, K., Varghese, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+in+humans-evidence+based+review%5BTitle%5D)+AND+%22Calicut+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probiotics in humans-evidence based review.</a> Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).</li>
<li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+influences+anticancer+immunosurveillance+and+general+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+of+the+cell-based+data-harvesting+efforts+that+drive+the+integration+of+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Jong, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103(2016).</li>
<li>Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+A+breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
<li>Lee, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Anti-Cancer+Activity+of+the+Probiotic+Bacterium+Lactobacillus+fermentum+Using+2D+vs.+3D+Culture+in+Colorectal+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells.</a> Biomolecules. 9 (10), 557(2019).</li>
<li>Koledova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: An introduction.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+The+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+patient-derived+3D+mesothelioma+tumor+organoids+facilitate+patient-centric+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening.</a> Scientific Reports. 8, 2886(2018).</li>
<li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+Based+Thermally+Reversible+Hydrogel+System+for+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications.</a> Cells. 2 (3), 460-475 (2013).</li>
<li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+as+a+scaffold+in+the+culture+of+liver-organoids+for+the+potential+of+treating+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure.</a> Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).</li>
<li>Lee, W., Park, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+patterned+stem+cell+differentiation+using+thermo-responsive+methylcellulose+hydrogel+molds%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds.</a> Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).</li>
<li>Fan, H., Demirci, U., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+organoid+models%3A+Leaping+forward+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research.</a> Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Liou, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Metabolic+Pathway+for+Activation+of+Dietary+Glucosinolates+by+a+Human+Gut+Symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont.</a> Cell. 180 (4), 717-728 (2020).</li>
<li>Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+and+the+social+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota and the social brain.</a> Science. 366 (6465), 2016(2019).</li>
<li>Honda, K., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+in+adaptive+immune+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease.</a> Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).</li>
<li>Bárcena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthspan+and+lifespan+extension+by+fecal+microbiota+transplantation+into+progeroid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice.</a> Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).</li>
<li>Michalovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+disease+severity+magnify+disturbed+microbiome-immune+interactions+in+asthma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients.</a> Nature Communications. 10, 5711(2019).</li>
<li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

Mikrośrodowisko tkankowe, w tym sąsiednie komórki i macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), ma fundamentalne znaczenie dla wytwarzania tkanek i ma kluczowe znaczenie w kontroli wzrostu komórek i rozwoju tkanek13. Jednak hodowle 2D mają kilka wad, takich jak zakłócenie interakcji komórkowych, a także zmiany w morfologii komórek, środowiskach zewnątrzkomórkowych i zbliżaniu się podziału14. Systemy hodowli komórkowych 3D zostały rygorystycznie przebadane w celu lepszego odtworzenia e...

Probiotyki to najkorzystniejsze mikroorganizmy w jelitach, które poprawiają homeostazę immunologiczną i metabolizm energetyczny gospodarza1. Probiotyki z Lactobacillus i Bifidobacterium są najbardziej zaawansowanymi tego rodzaju produktami występującymi w jelitach2,3. Wcześniejsze badania wykazały, że Lactobacillus ma działanie hamujące i antyproliferacyjne na kilka nowotworów, w tym raka jelita grubego4. Ponadto probiotyki zapobiegają chorobom zapalnym jelit, chorobie Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącemu zapaleniu jelita grubego5,6. Jednak większość badań z probiotykami przeprowadzono w dwuwymiarowych (2D) monowarstwach, które są hodowane na stałych powierzchniach.
Sztuczne systemy hodowlane nie mają cech środowiskowych, co nie jest naturalne dla komórek rakowych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano trójwymiarowe (3D) systemy hodowli7,8. Komórki nowotworowe w 3D wykazują poprawę pod względem podstawowych mechanizmów biologicznych, takich jak żywotność komórek, proliferacja, morfologia, komunikacja komórka-komórka, wrażliwość na leki i trafność in vivo9,10. Co więcej, sferoidy są zbudowane z wielokomórkowych typów raka jelita grubego i są zależne od interakcji komórka-komórka oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)11. Nasze poprzednie badanie wykazało, że probiotyczny supernatant bezkomórkowy (CFS) wytwarzany przy użyciu Lactobacillus fermentum wykazał działanie przeciwnowotworowe na hodowle 3D komórek raka jelita grubego (CRC)12. Zaproponowaliśmy, że CFS jest odpowiednią alternatywną strategią do testowania wpływu probiotyków na sferoidy 3D12.
Tutaj prezentujemy podejście, które może dostosować się do wielokomórkowych typów 3D raka jelita grubego do analizy efektów terapeutycznych probiotycznego supernatantu bezkomórkowego (CFS) na kilka systemów mimikry 3D raka jelita grubego. Metoda ta zapewnia środki do analizy powiązanych działań probiotycznych i przeciwnowotworowych in vitro.

<table><tbody><tr><td> 10% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 15-dołkowe, 15 i mikro; l</td><td>Biorad</td><td>4561036</td><td>Opakowanie 10</td></tr><tr><td>sztuk Applied Biosystems MicroAmp Optyczny klej samoprzylepny Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>100 pokryw</td></tr><tr><td>10x bufor transferowy</td><td>Intron</td><td>IBS-BT031A</td><td>1 L</td></tr><tr><td>10X Tris-Glycine (W/SDS)</td><td>Intron</td><td>IBS-BT014</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Axygen 2,0 mL MaxyClear Snaplock Mikrowirówka, polipropylen, przezroczysta, niesterylna, 500 probówek/opakowanie, 10 paczek / opakowanie</td><td>Corning</td><td>SCT-200-C</td><td>500 probówek / opakowanie, 10 opakowań / opakowanie</td></tr><tr><td>BD Difco Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>500 g</td></tr><tr><td>BD Difco Lactobacilli MRS Bulion</td><td>BD</td><td>DF0881-17-5</td><td>500 g</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Test żywotności komórek</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>100&mu; l/test w 96-dołkowych płytkach</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td>fiolka 20 tabletek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Corning, 1X bez wapnia i magnezu, pH 7,4 i plusmn; 0,1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF Membrany transferowe</td><td>fisher Scientific IPVH00010</td><td></td><td>rolka 26,5 cm x 3,75 m; Wielkość porów: 0,45um</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskowym sitkiem do komórek</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>25 / opakowanie, 500 / skrzynka</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenie z USA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA, 25 x 20 i mikro; l rxns #1708890</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>25 x 20 &mikro; L rxns</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Biorad</td><td>1725121</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Lactobacillus fermentum</td><td>Koreańska kolekcja dla kultur typu</td><td>KCTC 3112</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-cysteiny jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Metyloceluloza (3500-5600mPa&middot; s, 2% w wodzie o sile 20&deg; C)</td> <td>TCI</td><td>M0185</td><td>500 g</td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>20 płytek</td></tr><tr><td>Jednostka filtra strzykawkowego Millex-GS, 0,22 i mikro; m, mieszane estry celulozy, 33 mm, sterylizowane tlenkiem etylenu</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>250</td></tr><tr><td>PE Annexin V Zestaw do wykrywania apoptozy z 7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>640934</td><td>100 testami</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Introgen</td><td>jodku propidyny</td><td>P1304MP</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>RIPA Bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89901</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>250</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>trypsyny-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Nazwa materiałów/sprzętu/oprogramowania</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>anti - p-I&kappa; B&alfa; (B-9)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-8404</td><td>200 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>anty-BclxL (H-5)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-8392</td><td>200 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>anty-PARP 1 (C2-10)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-53643</td><td>50 &micro; l wodobrzusze</td></tr><tr><td>anty-&beta;-aktyna (C4)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-47778</td><td>200 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSDerse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>San Diego, CA, USA</td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader</td> Inkubator <td>CO2 BioT</td><td>S1LFA</td> Thermo fisher HERAcell 150i Rurka <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stożkowa 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka Corning Costar Ultra-Low Płytka wielodołkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7007</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Tool Płytka wielodołkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Costar 50 mL Zbiorniki na odczynniki, 5 w worku, sterylne</td><td>Szkiełka komory</td> do liczenia komórek Costar <td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Countess Thermofisher</td><td></td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAF1000</tr><tr><td>Czytnik wielomodowy EnSpire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Enspire 2300</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus Pipeta wielokanałowa, 8-kanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3122000051</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>TreeStar</td><td></td><td>Ashland, OR, USA</td></tr><tr><td>Kozia IgG Przeciw Myszom (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-035-062</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Kozia IgG Przeciw Królikowi (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td>2.0 mL</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Inc., San Diego, CA, USA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 mini</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubowana</td><td>Towarzysz laboratoryjny</td><td>SIF-6000R</td><td></td></tr><tr><td>Multi Gauge Ver. 3.0,</td> <td>Fujifilm</td><td></td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Spektrofotometry gęstości optycznej (OD)LAMBDA UV/Vis</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Waltham, MA, Stany</td></tr><tr><td>Zjednoczone Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Olympus</td><td></td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Probówka mikrowirówkowa SPL 1,5 ml</td><td>SPL</td><td>60015</td><td></td></tr><tr><td>SPL Zbiorniki wielokanałowe, 12-kanałowe, PS, sterylne</td><td>SPL</td><td>21012</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Waltham, MA, Stany</td></tr><tr><td>Zjednoczone Ultradźwiękowe procesory cieczy Vibra-cell</td><td>SONICS-vibra cell</td><td>VC 505</td><td>500 Watt procesor ultradźwiękowy</td></tr><tr><td>Winylowa komora anaerobowa</td><td>COY LAB PRODUCTS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Ten manuskrypt opisuje protokół oceny zgonów komórek rakowych w trójwymiarowych (3D) sferoidach wielokomórkowych typów komórek nowotworowych przy użyciu supernatantów z hodowli komórkowych Lactobacillus fermentum, uważanych za kultury probiotyczne. Wykorzystanie kultur 3D do testowania supernatantu bezkomórkowego Lactobacillus (LCFS) jest lepszą opcją niż testowanie w monowarstwach 2D, zwłaszcza że L. fermentum może wywoływać działanie przeciwnowotworowe w jelitach. Stwierdzono, że supernatant L. fermentum ma zwiększone działanie antyproliferacyjne przeciwko kilku komórkom raka jelita grubego (CRC) w warunkach hodowli 3D. Co ciekawe, efekty te były silnie związane z modelem hodowli, wykazując godną uwagi zdolność L. fermentum do indukowania śmierci komórek rakowych. Stabilne sferoidy wygenerowano z różnych komórek CRC (raka jelita grubego) przy użyciu protokołu przedstawionego poniżej. Ten protokół generowania sferoidy 3D jest oszczędzający czas i opłacalny. System ten został opracowany w celu łatwego badania przeciwnowotworowego działania LCFS w wielu typach sferoid CRC. Zgodnie z oczekiwaniami, sferoidy CRC traktowane LCFS silnie indukowały śmierć komórki podczas eksperymentu i wyrażały specyficzne markery molekularne apoptozy, analizowane za pomocą qRT-PCR, western blotting i analizy FACS. Dlatego metoda ta jest cenna dla badania żywotności komórek i oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych.

Opisujemy protokół otrzymywania sferoidów z różnych linii komórkowych raka jelita grubego. Do generowania sferoidów wymagane było zastosowanie metylocelulozy. Przedstawiamy również metodę przygotowania LCFS oraz model do badania korelacji między probiotykami a rakiem jelita grubego. Protokoły tworzenia sferoidów i przygotowania LCFS przedstawiono schematycznie na Rysunku 1A,B. Jak pokazano na Rysunku 2A, stężenie metylocelulozy wynoszące 0,6% pr...

Tutaj przedstawiono metody pozwalające zrozumieć przeciwnowotworowe działanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Linie komórkowe raka jelita grubego wykazują śmierć komórek po leczeniu LCFS w hodowlach 3D. Proces generowania sferoid można zoptymalizować w zależności od rusztowania, a przedstawione metody analizy są przydatne do oceny zaangażowanych szlaków sygnałowych.

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Protokół ten został zoptymalizowany, aby ułatwić badanie przeciwnowotworowego działania bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus w wielu typach sferoid komórek raka jelita grubego. Technika ta jest pierwszym podejściem, które bada przeciwnowotworowe działanie LCFS na sferoidy raka jelita grubego w warunkach mimikry in vivo. Zacznij od umieszczenia wysterylizowanej w autoklawie płytki agarowej MRS w wodorowej komorze beztlenowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20 częściami na milion tlenu i zaszczepienia płytki świeżo rozmrożonym bulionem bakteryjnym Lactobacillus.Dodaj dwa do trzech mililitrów bulionu MRS, uzupełnionego l-cysteiną do probówki i uszczelnij probówkę korkiem z gumy butylowej i nakrętką tubki. Następnie użyj pętli, aby zebrać pojedynczą kolonię i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce hodowlanej zawierającej 500 mikrolitrów PBS. Ponownie zawiesić kolonię jednorodnie w soli fizjologicznej i załadować całą zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki.Włóż igłę do środka pokrywy probówki hodowlanej i wprowadź kolonię do pożywki. Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 200 obrotach na minutę. Po dwóch dniach zmierz OD620 w kulturze na spektrofotometrze.Gdy OD620 jest równy dwa, osadź bakterie przez odwirowanie i przemyj osad bakteryjny PBS. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś bakterie w czterech mililitrach RPMI 1640, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą bez antybiotyków i umieść bakterie w inkubatorze do wytrząsania na cztery godziny z prędkością 100 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji rozpuść bakterie przez odwirowanie i sterylnie przefiltruj odzyskany supernatant przez sitko o wielkości 0,22 mikrona do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby przygotować linie komórkowe raka jelita grubego do tworzenia sferoidów, należy wyhodować interesujące komórki jako monowarstwy na 100-milimetrowych szalkach Petriego w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, przemyj kultury dwa razy czterema mililitrami PBS na pranie, a następnie odłącz komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny-EDTA na naczynie. Po dwóch minutach sprawdź, czy nie ma dysocjacji pod mikroskopem świetlnym.Jeśli komórki się odłączyły, zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą pięciu mililitrów pożywki wzrostowej. Zbierz komórki przez odwirowanie w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów na kulturę komórkową i delikatnie zawieś granulki z trzema mililitrami pożywki wzrostowej na probówkę. Następnie policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do jednego do dwóch razy od 10 do piątych komórek na mililitr stężenia w świeżej pożywce i dodać metylocelulozę do komórek do końcowego stężenia 0,6%. Przenieś komórki do sterylnego zbiornika i za pomocą wielokanałowej pipety dozuj 200 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 36 godzin przed sprawdzeniem, czy tworzą się sferoidy za pomocą mikroskopii świetlnej.W przypadku leczenia LCFS należy seryjnie rozcieńczyć przygotowany rozmrożony roztwór podstawowy LCFS w świeżej pożywce wzrostowej do stężeń 25, 12,5 i 6% i użyć pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu z każdej studzienki z posianych hodowli komórkowych raka jelita grubego. Następnie delikatnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej LCFS w trzech egzemplarzach do każdego zestawu komórek rakowych i umieść płytkę w inkubatorze na dodatkowe 24 do 48 godzin. Stężenie metylocelulozy wynoszące 0,6% przekształca badane komórki linii komórek rakowych w zwarte sferoidy, co wskazuje, że sferoidy mogą być generowane z kilku typów raka jelita grubego przy użyciu tego protokołu.Sferoidy hodowane z 25% LCFS wykazują zakłóconą powierzchnię i zmniejszoną żywotność komórek w sposób zależny od dawki. Rzeczywiście, współhodowane komórki LCFS wykazują wyższy poziom ekspresji jodku propidyny w porównaniu z żywotnymi komórkami kontrolnymi. Można również przeprowadzić analizę PCR z odwrotną transkryptazą, Western blot i analizę aneksyny V/7-AAD cytometryczną w celu oceny wpływu LCFS na apoptozę komórek rakowych.Należy pamiętać, aby obchodzić się ze sferoidami delikatnie podczas usuwania podłoża wzrostowego, ponieważ sferoidy mogą łatwo pękać, co uniemożliwia zaobserwowanie efektu leczenia LCFS. Po tej procedurze można przeprowadzić testy żywotności komórek, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting i analizę FACS, aby bardziej szczegółowo scharakteryzować działanie przeciwnowotworowe LCFS.

evaluating-cell-death-using-cell-free-supernatant-probiotics-three

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ten film demonstruje test in vitro do badania przeciwnowotworowego działania bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Po wystawieniu sferoid raka jelita grubego na różne dawki LCFS, interakcja z metabolitami bakteryjnymi w LCFS indukuje apoptozę w komórkach nowotworowych, zaburzając strukturę sferoidalną i prowadząc do śmierci komórki w sposób zależny od dawki.

Test do oceny działania przeciwnowotworowego supernatantu bezkomórkowego Lactobacillus

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Poznaj metodę oceny śmierci komórek raka jelita grubego przy użyciu bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych indukujących apoptozę.

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów