Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

Protokół ten został zoptymalizowany, aby ułatwić badanie przeciwnowotworowego działania bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus w wielu typach sferoid komórek raka jelita grubego. Technika ta jest pierwszym podejściem, które bada przeciwnowotworowe działanie LCFS na sferoidy raka jelita grubego w warunkach mimikry in vivo. Zacznij od umieszczenia wysterylizowanej w autoklawie płytki agarowej MRS w wodorowej komorze beztlenowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20 częściami na milion tlenu i zaszczepienia płytki świeżo rozmrożonym bulionem bakteryjnym Lactobacillus.

Dodaj dwa do trzech mililitrów bulionu MRS, uzupełnionego l-cysteiną do probówki i uszczelnij probówkę korkiem z gumy butylowej i nakrętką tubki. Następnie użyj pętli, aby zebrać pojedynczą kolonię i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce hodowlanej zawierającej 500 mikrolitrów PBS. Ponownie zawiesić kolonię jednorodnie w soli fizjologicznej i załadować całą zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki.

Włóż igłę do środka pokrywy probówki hodowlanej i wprowadź kolonię do pożywki. Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 200 obrotach na minutę. Po dwóch dniach zmierz OD620 w kulturze na spektrofotometrze.

Gdy OD620 jest równy dwa, osadź bakterie przez odwirowanie i przemyj osad bakteryjny PBS. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś bakterie w czterech mililitrach RPMI 1640, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą bez antybiotyków i umieść bakterie w inkubatorze do wytrząsania na cztery godziny z prędkością 100 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji rozpuść bakterie przez odwirowanie i sterylnie przefiltruj odzyskany supernatant przez sitko o wielkości 0,22 mikrona do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przygotować linie komórkowe raka jelita grubego do tworzenia sferoidów, należy wyhodować interesujące komórki jako monowarstwy na 100-milimetrowych szalkach Petriego w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, przemyj kultury dwa razy czterema mililitrami PBS na pranie, a następnie odłącz komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny-EDTA na naczynie. Po dwóch minutach sprawdź, czy nie ma dysocjacji pod mikroskopem świetlnym.

Jeśli komórki się odłączyły, zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą pięciu mililitrów pożywki wzrostowej. Zbierz komórki przez odwirowanie w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów na kulturę komórkową i delikatnie zawieś granulki z trzema mililitrami pożywki wzrostowej na probówkę. Następnie policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do jednego do dwóch razy od 10 do piątych komórek na mililitr stężenia w świeżej pożywce i dodać metylocelulozę do komórek do końcowego stężenia 0,6%. Przenieś komórki do sterylnego zbiornika i za pomocą wielokanałowej pipety dozuj 200 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 36 godzin przed sprawdzeniem, czy tworzą się sferoidy za pomocą mikroskopii świetlnej.

W przypadku leczenia LCFS należy seryjnie rozcieńczyć przygotowany rozmrożony roztwór podstawowy LCFS w świeżej pożywce wzrostowej do stężeń 25, 12,5 i 6% i użyć pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu z każdej studzienki z posianych hodowli komórkowych raka jelita grubego. Następnie delikatnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej LCFS w trzech egzemplarzach do każdego zestawu komórek rakowych i umieść płytkę w inkubatorze na dodatkowe 24 do 48 godzin. Stężenie metylocelulozy wynoszące 0,6% przekształca badane komórki linii komórek rakowych w zwarte sferoidy, co wskazuje, że sferoidy mogą być generowane z kilku typów raka jelita grubego przy użyciu tego protokołu.

Sferoidy hodowane z 25% LCFS wykazują zakłóconą powierzchnię i zmniejszoną żywotność komórek w sposób zależny od dawki. Rzeczywiście, współhodowane komórki LCFS wykazują wyższy poziom ekspresji jodku propidyny w porównaniu z żywotnymi komórkami kontrolnymi. Można również przeprowadzić analizę PCR z odwrotną transkryptazą, Western blot i analizę aneksyny V/7-AAD cytometryczną w celu oceny wpływu LCFS na apoptozę komórek rakowych.

Należy pamiętać, aby obchodzić się ze sferoidami delikatnie podczas usuwania podłoża wzrostowego, ponieważ sferoidy mogą łatwo pękać, co uniemożliwia zaobserwowanie efektu leczenia LCFS. Po tej procedurze można przeprowadzić testy żywotności komórek, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting i analizę FACS, aby bardziej szczegółowo scharakteryzować działanie przeciwnowotworowe LCFS.