Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego
13 czerwca 2020
Tutaj przedstawiono metody pozwalające zrozumieć przeciwnowotworowe działanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Linie komórkowe raka jelita grubego wykazują śmierć komórek po leczeniu LCFS w hodowlach 3D. Proces generowania sferoid można zoptymalizować w zależności od rusztowania, a przedstawione metody analizy są przydatne do oceny zaangażowanych szlaków sygnałowych.
Protokół ten został zoptymalizowany, aby ułatwić badanie przeciwnowotworowego działania bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus w wielu typach sferoid komórek raka jelita grubego. Technika ta jest pierwszym podejściem, które bada przeciwnowotworowe działanie LCFS na sferoidy raka jelita grubego w warunkach mimikry in vivo. Zacznij od umieszczenia wysterylizowanej w autoklawie płytki agarowej MRS w wodorowej komorze beztlenowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20 częściami na milion tlenu i zaszczepienia płytki świeżo rozmrożonym bulionem bakteryjnym Lactobacillus.
Dodaj dwa do trzech mililitrów bulionu MRS, uzupełnionego l-cysteiną do probówki i uszczelnij probówkę korkiem z gumy butylowej i nakrętką tubki. Następnie użyj pętli, aby zebrać pojedynczą kolonię i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce hodowlanej zawierającej 500 mikrolitrów PBS. Ponownie zawiesić kolonię jednorodnie w soli fizjologicznej i załadować całą zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki.
Włóż igłę do środka pokrywy probówki hodowlanej i wprowadź kolonię do pożywki. Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 200 obrotach na minutę. Po dwóch dniach zmierz OD620 w kulturze na spektrofotometrze.
Gdy OD620 jest równy dwa, osadź bakterie przez odwirowanie i przemyj osad bakteryjny PBS. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś bakterie w czterech mililitrach RPMI 1640, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą bez antybiotyków i umieść bakterie w inkubatorze do wytrząsania na cztery godziny z prędkością 100 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji rozpuść bakterie przez odwirowanie i sterylnie przefiltruj odzyskany supernatant przez sitko o wielkości 0,22 mikrona do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Aby przygotować linie komórkowe raka jelita grubego do tworzenia sferoidów, należy wyhodować interesujące komórki jako monowarstwy na 100-milimetrowych szalkach Petriego w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, przemyj kultury dwa razy czterema mililitrami PBS na pranie, a następnie odłącz komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny-EDTA na naczynie. Po dwóch minutach sprawdź, czy nie ma dysocjacji pod mikroskopem świetlnym.
Jeśli komórki się odłączyły, zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą pięciu mililitrów pożywki wzrostowej. Zbierz komórki przez odwirowanie w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów na kulturę komórkową i delikatnie zawieś granulki z trzema mililitrami pożywki wzrostowej na probówkę. Następnie policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do jednego do dwóch razy od 10 do piątych komórek na mililitr stężenia w świeżej pożywce i dodać metylocelulozę do komórek do końcowego stężenia 0,6%. Przenieś komórki do sterylnego zbiornika i za pomocą wielokanałowej pipety dozuj 200 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim mocowaniu. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 36 godzin przed sprawdzeniem, czy tworzą się sferoidy za pomocą mikroskopii świetlnej.
W przypadku leczenia LCFS należy seryjnie rozcieńczyć przygotowany rozmrożony roztwór podstawowy LCFS w świeżej pożywce wzrostowej do stężeń 25, 12,5 i 6% i użyć pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu z każdej studzienki z posianych hodowli komórkowych raka jelita grubego. Następnie delikatnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej LCFS w trzech egzemplarzach do każdego zestawu komórek rakowych i umieść płytkę w inkubatorze na dodatkowe 24 do 48 godzin. Stężenie metylocelulozy wynoszące 0,6% przekształca badane komórki linii komórek rakowych w zwarte sferoidy, co wskazuje, że sferoidy mogą być generowane z kilku typów raka jelita grubego przy użyciu tego protokołu.
Sferoidy hodowane z 25% LCFS wykazują zakłóconą powierzchnię i zmniejszoną żywotność komórek w sposób zależny od dawki. Rzeczywiście, współhodowane komórki LCFS wykazują wyższy poziom ekspresji jodku propidyny w porównaniu z żywotnymi komórkami kontrolnymi. Można również przeprowadzić analizę PCR z odwrotną transkryptazą, Western blot i analizę aneksyny V/7-AAD cytometryczną w celu oceny wpływu LCFS na apoptozę komórek rakowych.
Należy pamiętać, aby obchodzić się ze sferoidami delikatnie podczas usuwania podłoża wzrostowego, ponieważ sferoidy mogą łatwo pękać, co uniemożliwia zaobserwowanie efektu leczenia LCFS. Po tej procedurze można przeprowadzić testy żywotności komórek, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting i analizę FACS, aby bardziej szczegółowo scharakteryzować działanie przeciwnowotworowe LCFS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania efektów przeciwnowotworowych nadianadpłynu z hodowli Lactobacillus pozbawionego komórek (LCFS) na sferoidach raka jelita grubego. Badanie optymalizuje proces generowania sferoidów oraz ocenia szlaki sygnałowe zaangażowane w śmierć komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
Wstęp
- Lactobacillus jest znany ze swojego potencjalnego korzystnego wpływu na zdrowie.
- Bezkomórkowe supernatanty mogą zawierać związki bioaktywne.
- Rak jelita grubego pozostaje istotnym wyzwaniem zdrowotnym.
- Trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe lepiej naśladują warunki in vivo.
Cel badania
- Zbadanie przeciwnowotworowego działania LCFS na sferoidy raka jelita grubego.
- Optymalizacja technik generowania sferoidów.
- Analiza szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w obserwowane efekty.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytek z agarem MRS w komorze beztlenowej.
- Inokulacja płytek zawiesiną bakterii z rodzaju Lactobacillus.
- Hodowla bakterii w bulionie MRS uzupełnionym o l-cysteinę.
- Zbiór i resuspensja kolonii bakteryjnych do dalszej obróbki.
Główne wyniki
- Linie komórkowe raka jelita grubego wykazały śmierć komórek po potraktowaniu LCFS.
- Zoptymalizowane metody generowania sferoidów poprawiły wyniki eksperymentalne.
- Skutecznie przeanalizowano szlaki sygnalizacyjne zaangażowane w śmierć komórek.
- Badanie to dostarcza nowego podejścia do badań nad leczeniem nowotworów.
Wnioski
- LCFS wykazuje potencjał jako potencjalny środek przeciwnowotworowy.
- Techniki hodowli 3D są niezbędne do dokładnego modelowania.
- Dalsze badania są konieczne, aby w pełni zrozumieć zaangażowane mechanizmy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym ocenę aktywności przeciwnowotworowej supernatantów pochodzących z probiotyków w fizjologicznie istotnych trójwymiarowych (3D) modelach raka jelita grubego. Dzięki zastosowaniu wolnego od komórek supernatantu z Lactobacillus fermentum (LCFS) w stabilnych kulturach sferoidów, metoda ta wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku kandydatów na produkty naturalne oraz zwiększa pewność prognostyczną w działaniach związanych z walidacją celów terapeutycznych. Podejście to łączy screening na etapie odkrywania z relewantnością translacyjną poprzez modelowanie oddziaływań w mikrośrodowisku jelitowym, które wpływają na żywotność komórek nowotworowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotez terapeutycznych dotyczących metabolitów mikrobiologicznych i ich wpływu na szlaki śmierci komórek raka jelita grubego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez odczyty żywotności zależne od dawki w modelach sferoidów 3D.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie apoptozy indukowanej przez LCFS z mierzalnymi markerami molekularnymi za pomocą qRT-PCR, Western blot i FACS.
Przesiewanie i rozwój testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania związków, wykorzystując powtarzalne tworzenie sferoidów w płytkach o ultra-niskiej adhezji.
- Wyniki ilościowe: Generuje dane zależności dawka-odpowiedź (25%, 12,5%, 6% LCFS), umożliwiając szacowanie IC50 oraz modelowanie zależności struktura-aktywność.
- Skalowalność: Wykorzystuje format 96-dołkowy, kompatybilny z automatycznym dozowaniem cieczy i wysokoprzepustowym badaniem żywotności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modelowanie patofizjologii raka jelita grubego z wykorzystaniem sferoidów z linii komórkowych pochodzących od pacjentów lub ustalonych linii komórkowych, które odzwierciedlają architekturę guza in vivo.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie wyników badań podstawowych z walidacją przedkliniczną poprzez utrzymanie spójnych warunków hodowli 3D na wszystkich etapach testu.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwienie określenia kryteriów go/no-go na podstawie indukcji apoptozy i progów żywotności zaobserwowanych w kokulturach sferoidów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi procesami odkrywania leków po identyfikacji celu i przed optymalizacją związku wiodącego, zapewniając system istotny dla danej jednostki chorobowej do oceny bioaktywnych supernatantów pochodzenia mikrobiologicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących przeciwnowotworowych mechanizmów drobnoustrojów oraz wyjaśnianie szlaków w modelach 3D, które lepiej przewidują odpowiedzi in vivo.
- Screening: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki ustandaryzowanym protokołom formowania sferoidów oraz traktowania LCFS.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (żywotność, markery apoptozy), co pozwala na porównania statystyczne między różnymi warunkami traktowania i liniami komórkowymi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od screeningu opartego na sferoidach do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie wierności hodowli 3D.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do screeningu supernatantów probiotyków, ekstraktów z żywności fermentowanej lub terapeutyków pochodzących z mikrobiomu w odniesieniu do wielu typów nowotworów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich w modelach 2D oraz uchwycenie efektów zależnych od mikrośrodowiska.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy generowania sferoidów i schematy ich traktowania, co poprawia powtarzalność między ośrodkami i zmniejsza zmienność analiz.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka interwencji ukierunkowanych na mikrobiom przed kosztownymi badaniami in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków wiodących pochodzenia naturalnego z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o indukcję apoptozy i odpowiedź na dawkę w modelach istotnych klinicznie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli bakterii beztlenowych, pracy z sferoidami 3D oraz technikach analizy apoptozy (qPCR, WB, FACS).
- Zależy od dostępności aparatury, w tym komór beztlenowych, inkubatorów z wytrząsaniem, spektrofotometrów oraz cytometrów przepływowych.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa (zespoły mikrobiologii i biologii nowotworów) w celu zapewnienia spójności przygotowania LCFS oraz kontroli jakości sferoidów.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu metody na inne szczepy bakteryjne lub rodzaje nowotworów poza modelami jelita grubego.
- Ograniczeniem jest kruchość sferoidów podczas wymiany pożywki, co wymaga delikatnego obchodzenia się z próbkami w celu zachowania ich integralności strukturalnej dla uzyskania dokładnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
