Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Wyhoduj pożądaną linię komórkową jako przylegającą monowarstwę 2D. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Następnie dodaj trypsynę i inkubuj, podczas gdy komórki odrywają się od powierzchni kolby i stają się okrągłe. Dodaj świeże podłoże, aby zneutralizować trypsynę i zawiesić komórki. Przenieś mieszaninę do stożkowej probówki i użyj wirówki do granulowania komórek.

Zastąp supernatant świeżą pożywką i ponownie zawieś osad ogniwa. Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i obliczyć stężenie robocze. Następnie przenieś odpowiednią ilość mieszanki komórek na okrągłodenną płytkę studzienkową o bardzo niskiej przyczepności i inkubuj. Komórki osiadają na dnie i agregują się. Ostatecznie połączą się ze sobą i utworzą kompaktowy zespół komórek 3D, sferoidę.

W przykładowym protokole zobaczymy, jak wygenerować sferoidy 3D z linii komórkowej raka jelita grubego i jak obrazowanie na żywo jest stosowane do śledzenia ich powstawania. Zacznij od przemycia interesującej nas linii komórek raka jelita grubego pięcioma mililitrami PBS i usunięcia komórek z dna kolby 0,5 mililitra trypsyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem zneutralizować enzym dysocjacji komórek za pomocą 10 mililitrów kompletnej pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej kompletnej pożywki do liczenia i ponownie zawiesić komórki przy stężeniu 1,5 razy 10 do trzecich komórek na mililitr

Następnie wysiew 20 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem i umieść płytkę w automatycznym aparacie do obrazowania w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i wilgotnością 95%. Zaloguj się do oprogramowania akwizycyjnego aparatu i wybierz Zaplanuj nabycie, Wystrzel Dodaj naczynie, Skanuj zgodnie z harmonogramem i Utwórz naczynie, nowe. Następnie wybierz Typ skanowania, Sferoida i wybierz odpowiednie kanały Brightfield i Fluorescence, które Cię interesują. Ustaw powiększenie na 10 razy i wybierz model płytki oraz jej położenie w szufladzie aparatu obrazowego. Wybierz położenie studzienek, które mają być zobrazowane, i wprowadź opis eksperymentu, w tym nazwę, typ komórek i liczbę komórek.

W polu Ustawienia analizy wybierz opcję Odłóż analizę na później, kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania, a następnie ustaw opcję Dodaj skany co maksymalnie cztery godziny i Łącznie do 24 godzin. Następnie ustaw czas rozpoczęcia na co najmniej godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania. Aby sprawdzić postęp wzrostu sferoidów, co dwa dni loguj się do oprogramowania do obrazowania i wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany. Kliknij dwukrotnie interesujący Cię eksperyment i wybierz opcję Brightfield w panelu Kanały obrazu. Następnie użyj narzędzia Zmierz cechy obrazu, aby zmierzyć średnicę sferoid. Dodanie 50 mikrolitrów kompletnej pożywki na studzienkę w czwartym dniu, aby ograniczyć jakiekolwiek efekty zjawy.