Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Protokół ten ułatwia badanie aminopeptydaz o różnych stanach oligomerycznych i aktywnościach zależnych od oligomeryzacji, które są zrównoważone między nieaktywnymi dimerami a aktywnymi dodekamerami. Ta konwencjonalna technika może być łatwo wykonana w każdym laboratorium. I oprócz tego, że wymaga dostępu do linii badawczej lub zakładu krystalografii rentgenowskiej, nie wymaga specjalnych urządzeń.

Przy pewnej adaptacji metoda ta może być stosowana do dowolnego innego białka o aktywności lub funkcji zależnej od jego stopnia oligomeryzacji. Aby przetwarzać dane rentgenowskie, użytkownicy muszą mieć minimalną wiedzę na temat krystalografii. Zapraszamy użytkowników do śledzenia szkoleń, odwiedzania XDS Wiki i oglądania samouczków Phenix.

Aby przeprowadzić test aktywności, dodaj 25 mikrolitrów 100 mM L-leucyny p-nitroanilidu do 965 mikrolitrów 50-milimolowego MOPS, 250 mikromolowego chlorku kobaltu, dwóch chlorków i 10% metanolu Wstępnie inkubuj mieszaninę reakcyjną w suchej łaźni o temperaturze 75 stopni Celsjusza, a następnie rozcieńcz enzym do końcowego stężenia jednego mikromola z dodatkowymi 50 milimolowymi MOPS. Następnie dodaj 10 mikrolitrów jednego enzymu mikromolowego do mieszanki reakcyjnej i zwiruj powstały roztwór przed powrotem do suchej kąpieli o temperaturze 75 stopni Celsjusza na nie dłużej niż godzinę. Gdy roztwór zmieni kolor na żółty, zatrzymaj reakcję jednym mililitrem 20% kwaśnego kwasu i zwiruj mieszaninę przed pozostawieniem jej do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

Następnie przenieść podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej do celi spektrofotometru i odczytać absorbenty przy 410 nanometrach w porównaniu z inkubowaną mieszaniną reakcyjną bez enzymu, jako kontrolę ujemną. Do przygotowania apoenzymu dodać 10 mikrolitrów 1, 10-fenantrolinowego roztworu podstawowego do 890 mikrolitrów 50 milimolowych MOPS, 0,5 molowego siarczanu amonu i 100 mikrolitrów oczyszczonego TmPep1050. Sprawdzić utratę aktywności, stosując test aktywności, jak wykazano, bez dodatku chlorku kobaltu i dwóch.

Po wykonaniu testu przenieść próbkę do probówki dializacyjnej i poddać ją dializie w stosunku do 200 mililitrów 50-milimolowego MOPS i 0,5-molowego siarczanu amonu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W ciągu 48-godzinnej dializy należy trzykrotnie wymienić dializ ze świeżym buforem i pobrać próbkę z rurki dializowej. Używając jednostek ultrafiltracyjnych z odcięciem 30 kilodaltonów, skoncentruj próbkę z powrotem do 100 mikrolitrów i sprawdź stężenie na spektrofotometrze nanoobjętościowym o długości 280 nanometrów.

Aby przygotować dimery, rozcieńczyć apoenzym do stężenia jednego mikromola w 50 milimolowym MOPS i 0,5 molowym siarczanie amonu i inkubować reakcję przez dwie godziny w suchej łaźni o temperaturze 75 stopni Celsjusza. Następnie zagęścić próbkę enzymu do stężenia co najmniej 50 mikrolitrów i sprawdzić chromatografię wykluczania masy cząsteczkowej według wielkości. Aby poprawić kształt, rozmiar i krystaliczność kryształów białka, dodaj odpowiednią objętość zoptymalizowanego roztworu krystalizacyjnego do kropli kryształów, aby zwiększyć objętość kropli kryształu do 10 mikrolitrów.

Przenieś kropelkę do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 90 kolejnych mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego do zasianej studzienki. Do każdego rozcieńczenia nasion dodać 500 mikrolitrów odczynnika do krystalizacji na studzienkę do odpowiedniej liczby dołków na płytce krystalizacyjnej i wymieszać dwa mikrolitry próbki białka z dwoma mikrolitrami odczynnika do krystalizacji i 0,2 mikrolitra nasion w jednym podłożu krystalizacji na studzienkę. Następnie przymocuj podpory do każdej studzienki odczynnika do krystalizacji.

W celu pobrania kryształów należy napełnić kąpiel ciekłym azotem i zanurzyć w azocie wszelkie fiolki lub kosze używane do przenoszenia próbek. Obchodzenie się z ciekłym azotem jest niebezpieczne, może spowodować poważne odmrożenia. Pamiętaj, aby nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, takie jak rękawice kriogeniczne i okulary ochronne

Ustaw pętle pobierania próbek o różnych rozmiarach w zależności od rozmiaru kryształu i użyj lornetki, aby wybrać kroplę zawierającą kryształy. Następnie za pomocą pętli delikatnie wybierz izolowany kryształ z jednej studzienki i natychmiast zanurz pętlę w ciekłym azocie przed umieszczeniem pętli w odpowiedniej fiolce. Aby zmierzyć intensywność plamki dyfrakcyjnej, utwórz folder, z którego zostanie uruchomiony XDS i zlokalizuj ścieżkę do obrazów.

Aby uruchomić xdsme, wprowadź polecenie w oknie terminala. Po zakończeniu zadania przez XDS sprawdź poprawny plik lp i zanotuj prawdopodobieństwo wyznaczenia grupy przestrzennej, kompletność danych, najwyższą rozdzielczość, mozaikowość krystaliczną i jakość danych. Po sprawdzeniu bezsensownego dziennika XDS w celu uzyskania prawdopodobieństwa grup spacji, użyj poleceń, aby ponownie uruchomić xdsme z różnymi rozwiązaniami grup przestrzeni zaproponowanymi przez XDS, w osobnym folderze, aby uniknąć przesłaniania poprzedniego procesu.

Po wybraniu najlepszego rozwiązania na podstawie statystyk danych wprowadź polecenia, aby uruchomić XSCALE i XDSCONV. Aby wyznaczyć fazę bez anomalnego elementu rozpraszającego, użyj współrzędnych 4P X, Y, aby przygotować model początkowy do wymiany molekularnej. Z pliku PDB użyj edytora plików Phenix PDB, aby wyekstrahować monomer A i obciąć jego aminokwasy w alaninie.

Uruchom X klasyfikowany z plikiem odbicia wygenerowanym przez XDSCONV i sekwencją jako danymi wejściowymi. Sprawdź plik dziennika z Xtriage. Zwróć uwagę na kompletność, liczbę podjednostek w jednostce asymetrycznej, anizotropię, obecność pierścieni lodowych i występowanie bliźniaków.

Aby uruchomić Phaser-MR w Phenix w celu wymiany molekularnej, wybierz plik odbicia, sekwencję i początkowy model 4P six Y obcięty polialaniną i kliknij Uruchom. Po zakończeniu sprawdź, czy model został znaleziony i sprawdź wynik wymiany molekularnej. Współczynnik translacji Z wynoszący co najmniej osiem wskazuje, że rozwiązanie jest ostatecznie poprawne.

Po określeniu fazy przez zastąpienie molekularne wybierz opcję Uruchom automatyczną kompilację i kliknij przycisk Uruchom. Wszystkie wymagane pliki zostaną automatycznie dodane. Po zakończeniu sprawdź model w COOT i zbuduj i udoskonal model ręcznie, zgodnie z mapą gęstości elektronów w COOT.

Korzystając z tego modelu, sekwencji i danych dyfrakcyjnych jako danych wejściowych, udoskonal ręcznie wyselekcjonowany model w Phenix, odwołując się do Phenix, aby pomóc wybrać właściwą strategię. Po udoskonaleniu sprawdź wyniki, prace wolne od udoskonalania i udoskonalania muszą się zmniejszyć. Wskaźniki MolProbity muszą być przestrzegane, a wartości odstające o niskiej korelacji w przestrzeni rzeczywistej muszą być ograniczone.

Po wygenerowaniu najlepiej dopracowanego modelu uruchom MolProbity na serwerze i sprawdź wszystkie wartości odstające zidentyfikowane przez program. Chromatografia wykluczania wielkości może być stosowana do określenia pozornej masy cząsteczkowej oczyszczonego białka. Warunek krystalizacji peptydu można zoptymalizować, zmieniając pH w stosunku do stężenia PEG w zależności od stanu dimera.

Dla przykładu, najlepsze kryształy TmPep1050 H60A H307A, uzyskano w 0,1 molowym roztworze cytrynianu sodu o pH 5,2 i stężeniu 20% PEG 3350, po jednym cyklu mikrowysiewu w celu poprawy mikrokrystaliczności. W tej analizie indeksacja danych wykazała, że grupą przestrzenną kryształu TmPep1050 H60A H307A była C2221, ale XDS zaproponował inne rozwiązanie, grupę przestrzenną MP. Struktura TmPep1050 H60A H307A może zostać ukończona po kilku cyklach automatycznego i ręcznego udoskonalania.

Potwierdzenie stanu oligomerycznego z powierzchnią granicy faz wynoszącą 1 710 angstremów kwadratowych między oboma monomerami i swobodną energią tworzenia granicy faz wynoszącą minus 16,2 kilokalorii na mol. Tutaj można zaobserwować zbliżenie miejsca aktywnego TmPep1050 H60A H307A w porównaniu z miejscem aktywnym dimeru i dodekameru TmPep1050. Budując model, pamiętaj, aby budować tylko to, co widzisz w gęstości elektronów, aby uniknąć nadmiernej interpretacji danych i poświęcić czas na dopracowanie modelu.

Masę cząsteczkową dimeru i dodekameru można również określić za pomocą natywnej spektrometrii mas. Metody te mogą być przydatne do wykrywania oligomerów przejściowych.