Name: Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj krystalografię rentgenowską w celu badania przejścia dimer-dodekamer aminopeptydazy TmPep1050 z Thermotoga maritima. Ta metoda umożliwia analizę strukturalną stanów oligomerycznych i funkcji enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Martine Roovers za korektę tego artykułu i konstruktywne komentarze. Dostęp do linii badawczej Proxima 2 (synchrotron SOLEIL) odbywał się w ramach Grup Alokacji Bloków 20151139.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół pozwala zrozumieć przejście dimer-dodekamer TmPep1050 na poziomie strukturalnym. Metodologia ta była wcześniej stosowana do określania struktury obu oligomerów TmPep105011. Najtrudniejszym krokiem było znalezienie warunków sprzyjających dysocjacji dodekamerów na stabilne dimery. Takie warunki musiały być na tyle łagodne, aby umożliwić ponowną asocjację dimerów w dodekamery po dodaniu kofaktora jonów metali. Separacja oligomerów była również krytycznym kroki...

Oligomeryzacja jest dominującym procesem, który dyktuje biologiczne funkcje wielu białek. Szacuje się, że w Escherichia coli tylko 35% białek jest monomerycznych1. Niektóre białka, zwane morfeinami, mogą nawet przyjmować kilka stanów oligomerycznych z podjednostkami o odrębnej strukturze w każdym stanie oligomerycznym2. Przejście między ich stanami oligomerycznymi jest często środkiem do regulacji aktywności białek, ponieważ każdy stan oligomeryczny może mieć inną specyficzną aktywność lub funkcję. Kilka przykładów morfein zostało dobrze udokumentowanych w literaturze, w szczególności syntaza porfobilinogenu3, kinaza/fosfataza HPr4, Lon proteaza5, dehydrogenaza mleczanowa6, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu7, kinaza pirogronianowa8, syntaza cytrynianowa9 i rybonukleaza A10. Niedawno opisaliśmy aminopeptydazę M42 TmPep1050, kolejny przykład enzymu o zachowaniu podobnym do morfeiny, którego aktywność zależy od jego stanów oligomerycznych11. Przejście między stanami oligomerycznymi odbywa się za pośrednictwem kofaktorów metalicznych, które indukują kilka modyfikacji strukturalnych podjednostek.
Rodzina aminopeptydazy M42 należy do klanu MH12,13, i jest szeroko rozpowszechniona wśród bakterii i Archaea14. Aminopeptydazy M42 są prawdziwymi enzymami dwujądrowymi rozkładającymi peptydy o długości do 35 reszt aminokwasowych15. Przyjmują osobliwą strukturę w kształcie czworościanu zbudowaną z 12 podjednostek, których miejsca aktywne są zorientowane w kierunku wewnętrznej jamy. Taki układ jest często opisywany jako nano-kompartmentacja aktywności w celu uniknięcia niekontrolowanej proteolizy. Fizjologiczna funkcja aminopeptydaz M42 może być związana z proteasomem, hydrolizującymi peptydami powstałymi w wyniku degradacji białek16,17. Pyrococcus horikoshii posiada cztery aminopeptydazy M42, z których każda wykazuje odrębną, ale uzupełniającą się specyficzność18,19,20,21. Pojedynczo u P. horikoshii opisano heterokompleksy zbudowane z dwóch różnych typów podjednostek, co sugeruje istnienie kompleksów peptydasomów22,23.
Kilka struktur aminopeptydaz M42 zostało opisanych w literaturze11,16,18,19,20,24,25,26. Podjednostka składa się z dwóch odrębnych domen, domeny katalitycznej i domeny dimeryzacji. Domena katalityczna przyjmuje wspólny fałd α/β zachowany w całym klanie MH, przy czym archetypową domeną katalityczną jest aminopeptydaza Ap1 Vibrio proteolyticus27. Domena dimeryzacji przyjmuje podobną do PDZ klasę fold<sup="xref">16 i może mieć, oprócz swojej roli w oligomeryzacji, rolę w kontrolowaniu dostępu substratu i wiązania w wewnętrznej jamie11. Ponieważ podstawowym elementem składowym jest dimer, dodekamer jest często opisywany jako asocjacja sześciu dimerów, z których każdy jest umieszczony na każdej krawędzi czworościanu16. Oligomeryzacja aminopeptydaz M42 opiera się na dostępności jej kofaktorów metali. Jony metali dwuwartościowych, często Zn2+ i Co2+, są katalitycznie zaangażowane w wiązanie i hydrolizę peptydów. Znajdują się one w dwóch różnych miejscach wiązania, a mianowicie w miejscach M1 i M2. Dwa jony metali również napędzają i precyzyjnie dostrajają oligomeryzację, jak pokazano dla PhTET2, PhTET3, PfTET3 i TmPep105011,24,28,29. Gdy kofaktory metali są wyczerpane, dodekamer rozpada się na dimery, jak w PhTET2, PhTET3 i TmPep105011,16,28, a nawet monomery, jak w PhTET2 i PfTET324,29.
Prezentowany tutaj jest protokół używany do badania struktur oligomerów TmPep1050. Protokół ten jest zestawem powszechnych metod, w tym oczyszczania białek, badania przesiewowego aktywności proteolitycznej, krystalizacji, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i wymiany molekularnej. Podkreślono subtelności związane z radzeniem sobie z metaloenzymami, oligomeryzacją białek, krystalizacją białek i wymianą molekularną. Przedstawiono również przypadek badania, które pokazuje, czy dodekamery TmPep1050 mogą dalej dysocjować na monomery, czy nie. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zbadano wariant TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, którego miejsca wiązania metali są upośledzone przez mutację His-60 (miejsce M2) i His-307 (miejsce M1) do reszt Ala. Protokół ten może być stosowany do badania innych aminopeptydaz M42 lub dowolnych metaloenzymów o zachowaniu podobnym do morfeiny.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantrolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 15 Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>odwiedź http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Całkowicie wolny od EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>N/A</td><td></td><td>odwiedź https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>Crystal Screen I</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen II</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Naukowe</td><td></td> 15-dołkowe narzędzie EasyXtal <td></td></tr><tr><td></td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli Szczep PPY</td><td>N/A</td><td></td><td>patrz odniesienie 31</td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 niebieski szczep</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kalibracji filtracji żelowej HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kalibracji filtracji żelowej LMW</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>Standard filtracji żelowej</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Zestaw minipreparacyjny plazmidu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Indeks</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td> Wymiary <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>L-leucyna-p-nitroanilid</td><td>Bachem AG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka Neggia</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>odwiedź https://www.dectris.com/</td></tr> <tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tube JCSG Core Suite III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>Wizyta w ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>https://www.phenix-online.org/</td></tr> <tr><td>Phusion Polimeraza DNA High-Fidelity</td><td>Sól ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td> RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Sól RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy SnakeSkin, 3,5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Źródło 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Źródło 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Klasa przygotowawcza Superdex 200</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 szczep</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>Repozytorium plazmidów DNASU</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>XDS</td><td>Odwiedź http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Odwiedź https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy thermotoga maritima m42 tmpep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Aminopeptydazy M42 tworzą funkcjonalnie aktywne kompleksy złożone z 12 podjednostek. Wydaje się, że ich proces składania jest regulowany przez kofaktory jonów metali, które wyzwalają przejście dimer-dodekamer. Po związaniu jonów metalu zachodzi kilka modyfikacji strukturalnych w miejscu aktywnym i na granicy interakcji, kształtując dimery w celu promowania samoorganizacji. Aby zaobserwować takie modyfikacje, stabilne oligomery muszą zostać wyizolowane przed badaniem strukturalnym. Opisano tutaj metodę, która umożliwia oczyszczanie stabilnych dodekamerów i dimerów TmPep1050, aminopeptydazy M42 T. maritima oraz określenie ich struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Dimery otrzymano z dodekamerów poprzez usunięcie jonów metali za pomocą czynnika chelatującego. Bez ich kofaktora dodekamery stawały się mniej stabilne i ulegały całkowitej dysocjacji po podgrzaniu. Struktury oligomeryczne zostały rozwiązane za pomocą prostego podejścia opartego na wymianie molekularnej. Aby zilustrować metodologię, przedstawiono strukturę wariantu TmPep1050, całkowicie upośledzonego w wiązaniu jonów metali, bez dalszego rozkładu dimerów do monomerów.

Aby zbadać możliwą dysocjację dodekameru na monomery w TmPep1050, kodony His-60 i His-307 zastąpiono kodonem alaniny przy użyciu syntetycznego genu. Gen ten sklonowano następnie w wektorze pBAD w celu ekspresji i oczyszczania odpowiadającego wariantu TmPep1050, nazwanego później TmPep1050H60A H307A. Chromatografia wykluczania (Rysunek 3B) wykazała, że oczyszczone białko miało pozorną masę cząsteczkową 56 kDa (masa cząsteczkowa monomeru wynosi 36,0 kDa). Podobna pozorna masa cząste...

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Protokół ten ułatwia badanie aminopeptydaz o różnych stanach oligomerycznych i aktywnościach zależnych od oligomeryzacji, które są zrównoważone między nieaktywnymi dimerami a aktywnymi dodekamerami. Ta konwencjonalna technika może być łatwo wykonana w każdym laboratorium. I oprócz tego, że wymaga dostępu do linii badawczej lub zakładu krystalografii rentgenowskiej, nie wymaga specjalnych urządzeń.Przy pewnej adaptacji metoda ta może być stosowana do dowolnego innego białka o aktywności lub funkcji zależnej od jego stopnia oligomeryzacji. Aby przetwarzać dane rentgenowskie, użytkownicy muszą mieć minimalną wiedzę na temat krystalografii. Zapraszamy użytkowników do śledzenia szkoleń, odwiedzania XDS Wiki i oglądania samouczków Phenix.Aby przeprowadzić test aktywności, dodaj 25 mikrolitrów 100 mM L-leucyny p-nitroanilidu do 965 mikrolitrów 50-milimolowego MOPS, 250 mikromolowego chlorku kobaltu, dwóch chlorków i 10% metanolu Wstępnie inkubuj mieszaninę reakcyjną w suchej łaźni o temperaturze 75 stopni Celsjusza, a następnie rozcieńcz enzym do końcowego stężenia jednego mikromola z dodatkowymi 50 milimolowymi MOPS. Następnie dodaj 10 mikrolitrów jednego enzymu mikromolowego do mieszanki reakcyjnej i zwiruj powstały roztwór przed powrotem do suchej kąpieli o temperaturze 75 stopni Celsjusza na nie dłużej niż godzinę. Gdy roztwór zmieni kolor na żółty, zatrzymaj reakcję jednym mililitrem 20% kwaśnego kwasu i zwiruj mieszaninę przed pozostawieniem jej do ostygnięcia do temperatury pokojowej.Następnie przenieść podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej do celi spektrofotometru i odczytać absorbenty przy 410 nanometrach w porównaniu z inkubowaną mieszaniną reakcyjną bez enzymu, jako kontrolę ujemną. Do przygotowania apoenzymu dodać 10 mikrolitrów 1, 10-fenantrolinowego roztworu podstawowego do 890 mikrolitrów 50 milimolowych MOPS, 0,5 molowego siarczanu amonu i 100 mikrolitrów oczyszczonego TmPep1050. Sprawdzić utratę aktywności, stosując test aktywności, jak wykazano, bez dodatku chlorku kobaltu i dwóch.Po wykonaniu testu przenieść próbkę do probówki dializacyjnej i poddać ją dializie w stosunku do 200 mililitrów 50-milimolowego MOPS i 0,5-molowego siarczanu amonu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W ciągu 48-godzinnej dializy należy trzykrotnie wymienić dializ ze świeżym buforem i pobrać próbkę z rurki dializowej. Używając jednostek ultrafiltracyjnych z odcięciem 30 kilodaltonów, skoncentruj próbkę z powrotem do 100 mikrolitrów i sprawdź stężenie na spektrofotometrze nanoobjętościowym o długości 280 nanometrów.Aby przygotować dimery, rozcieńczyć apoenzym do stężenia jednego mikromola w 50 milimolowym MOPS i 0,5 molowym siarczanie amonu i inkubować reakcję przez dwie godziny w suchej łaźni o temperaturze 75 stopni Celsjusza. Następnie zagęścić próbkę enzymu do stężenia co najmniej 50 mikrolitrów i sprawdzić chromatografię wykluczania masy cząsteczkowej według wielkości. Aby poprawić kształt, rozmiar i krystaliczność kryształów białka, dodaj odpowiednią objętość zoptymalizowanego roztworu krystalizacyjnego do kropli kryształów, aby zwiększyć objętość kropli kryształu do 10 mikrolitrów.Przenieś kropelkę do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 90 kolejnych mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego do zasianej studzienki. Do każdego rozcieńczenia nasion dodać 500 mikrolitrów odczynnika do krystalizacji na studzienkę do odpowiedniej liczby dołków na płytce krystalizacyjnej i wymieszać dwa mikrolitry próbki białka z dwoma mikrolitrami odczynnika do krystalizacji i 0,2 mikrolitra nasion w jednym podłożu krystalizacji na studzienkę. Następnie przymocuj podpory do każdej studzienki odczynnika do krystalizacji.W celu pobrania kryształów należy napełnić kąpiel ciekłym azotem i zanurzyć w azocie wszelkie fiolki lub kosze używane do przenoszenia próbek. Obchodzenie się z ciekłym azotem jest niebezpieczne, może spowodować poważne odmrożenia. Pamiętaj, aby nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, takie jak rękawice kriogeniczne i okulary ochronne.Ustaw pętle pobierania próbek o różnych rozmiarach w zależności od rozmiaru kryształu i użyj lornetki, aby wybrać kroplę zawierającą kryształy. Następnie za pomocą pętli delikatnie wybierz izolowany kryształ z jednej studzienki i natychmiast zanurz pętlę w ciekłym azocie przed umieszczeniem pętli w odpowiedniej fiolce. Aby zmierzyć intensywność plamki dyfrakcyjnej, utwórz folder, z którego zostanie uruchomiony XDS i zlokalizuj ścieżkę do obrazów.Aby uruchomić xdsme, wprowadź polecenie w oknie terminala. Po zakończeniu zadania przez XDS sprawdź poprawny plik lp i zanotuj prawdopodobieństwo wyznaczenia grupy przestrzennej, kompletność danych, najwyższą rozdzielczość, mozaikowość krystaliczną i jakość danych. Po sprawdzeniu bezsensownego dziennika XDS w celu uzyskania prawdopodobieństwa grup spacji, użyj poleceń, aby ponownie uruchomić xdsme z różnymi rozwiązaniami grup przestrzeni zaproponowanymi przez XDS, w osobnym folderze, aby uniknąć przesłaniania poprzedniego procesu.Po wybraniu najlepszego rozwiązania na podstawie statystyk danych wprowadź polecenia, aby uruchomić XSCALE i XDSCONV. Aby wyznaczyć fazę bez anomalnego elementu rozpraszającego, użyj współrzędnych 4P X, Y, aby przygotować model początkowy do wymiany molekularnej. Z pliku PDB użyj edytora plików Phenix PDB, aby wyekstrahować monomer A i obciąć jego aminokwasy w alaninie.Uruchom X klasyfikowany z plikiem odbicia wygenerowanym przez XDSCONV i sekwencją jako danymi wejściowymi. Sprawdź plik dziennika z Xtriage. Zwróć uwagę na kompletność, liczbę podjednostek w jednostce asymetrycznej, anizotropię, obecność pierścieni lodowych i występowanie bliźniaków.Aby uruchomić Phaser-MR w Phenix w celu wymiany molekularnej, wybierz plik odbicia, sekwencję i początkowy model 4P six Y obcięty polialaniną i kliknij Uruchom. Po zakończeniu sprawdź, czy model został znaleziony i sprawdź wynik wymiany molekularnej. Współczynnik translacji Z wynoszący co najmniej osiem wskazuje, że rozwiązanie jest ostatecznie poprawne.Po określeniu fazy przez zastąpienie molekularne wybierz opcję Uruchom automatyczną kompilację i kliknij przycisk Uruchom. Wszystkie wymagane pliki zostaną automatycznie dodane. Po zakończeniu sprawdź model w COOT i zbuduj i udoskonal model ręcznie, zgodnie z mapą gęstości elektronów w COOT.Korzystając z tego modelu, sekwencji i danych dyfrakcyjnych jako danych wejściowych, udoskonal ręcznie wyselekcjonowany model w Phenix, odwołując się do Phenix, aby pomóc wybrać właściwą strategię. Po udoskonaleniu sprawdź wyniki, prace wolne od udoskonalania i udoskonalania muszą się zmniejszyć. Wskaźniki MolProbity muszą być przestrzegane, a wartości odstające o niskiej korelacji w przestrzeni rzeczywistej muszą być ograniczone.Po wygenerowaniu najlepiej dopracowanego modelu uruchom MolProbity na serwerze i sprawdź wszystkie wartości odstające zidentyfikowane przez program. Chromatografia wykluczania wielkości może być stosowana do określenia pozornej masy cząsteczkowej oczyszczonego białka. Warunek krystalizacji peptydu można zoptymalizować, zmieniając pH w stosunku do stężenia PEG w zależności od stanu dimera.Dla przykładu, najlepsze kryształy TmPep1050 H60A H307A, uzyskano w 0,1 molowym roztworze cytrynianu sodu o pH 5,2 i stężeniu 20% PEG 3350, po jednym cyklu mikrowysiewu w celu poprawy mikrokrystaliczności. W tej analizie indeksacja danych wykazała, że grupą przestrzenną kryształu TmPep1050 H60A H307A była C2221, ale XDS zaproponował inne rozwiązanie, grupę przestrzenną MP. Struktura TmPep1050 H60A H307A może zostać ukończona po kilku cyklach automatycznego i ręcznego udoskonalania.Potwierdzenie stanu oligomerycznego z powierzchnią granicy faz wynoszącą 1 710 angstremów kwadratowych między oboma monomerami i swobodną energią tworzenia granicy faz wynoszącą minus 16,2 kilokalorii na mol. Tutaj można zaobserwować zbliżenie miejsca aktywnego TmPep1050 H60A H307A w porównaniu z miejscem aktywnym dimeru i dodekameru TmPep1050. Budując model, pamiętaj, aby budować tylko to, co widzisz w gęstości elektronów, aby uniknąć nadmiernej interpretacji danych i poświęcić czas na dopracowanie modelu.Masę cząsteczkową dimeru i dodekameru można również określić za pomocą natywnej spektrometrii mas. Metody te mogą być przydatne do wykrywania oligomerów przejściowych.

x-ray-crystallography-to-study-oligomeric-state-transition-thermotoga

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

W tym artykule opisujemy protokoły ekspresji, oczyszczania, krystalizacji i określania struktury N-końcowej domeny receptora ryanodine z diamentowej (Plutella xylostella).

Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Poznaj krystalografię rentgenowską w celu badania przejścia dimer-dodekamer aminopeptydazy TmPep1050 z Thermotoga maritima. Ta metoda umożliwia analizę strukturalną stanów oligomerycznych i funkcji enzymatycznych.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Przeglądaj więcej filmów