Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie miligramowych ilości białek beta błony zewnętrznej, które ulegną krystalizacji i defraktorii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fałdowania i transportu białek błonowych, takie jak sposób białka beta-beczkowe są wprowadzane do błon komórkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona odporna na białka beta-beczkowe.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wybór detergentów do oczyszczania, krystalizacji i defrakcji jest trudny. Jeremy Guerin, doktor habilitowany z laboratorium Susan Buchanan, zademonstruje procedurę, wraz ze mną i kolegami z laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od budowy wektora ekspresyjnego T7 zawierającego zoptymalizowane pod kątem kodonu docelowe białko błony zewnętrznej lub gen OMP do ekspresji in vivo do błony, jak opisano w protokole tekstowym.

Przekształć konstrukt w ekspresyjny szczep bakterii do ekspresji, pipetując jeden mikrolitr plazmidu do 50 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3) i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji pulsuj cieplnie w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund w łaźni wodnej, a następnie umieść z powrotem na lodzie na jedną minutę.

Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego podłoża SOC i wytrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przy 1000 obr./min za pomocą inkubatora z wytrząsarką stołową. Po inkubacji rozłóż 100 mikrolitrów komórek na płytkach agarowych LB zawierających odpowiedni antybiotyk i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odwrócone. Następnie wykonaj testy ekspresji na małą skalę, zaszczepiając pięć mililitrów LB zawierających kulturę antybiotyków pojedynczą kolonią.

Powtórz dla pięciu do 10 kolonii. Rosną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem do gęstości optycznej przy 600 nanometrach w przybliżeniu punktu zerowego sześć. Indukuj ekspresję docelowego OMP poprzez dodanie pięciu mikrolitrów jednego molowego IPTG do każdej probówki hodowlanej i pozwól rosnąć dodatkowej jednej do dwóch godzin.

Aby porównać poziomy ekspresji dla wszystkich kolonii, odwiruj jeden mililitr każdej kultury przez jedną minutę w temperaturze 15 000 razy G, używając mikrowirówki. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach bufora ładującego 1X SDS-PAGE. Podgrzewać w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie ponownie wirować w temperaturze 15 000 razy G przez pięć minut.

Analizować próbki za pomocą SDS-PAGE, pipetując 20 mikrolitrów dziesięcioprocentowego żelu do każdego dołka. Uruchom żel na 35 minut przy stałym napięciu 200 woltów. Na koniec zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 6000 razy G przez dziesięć minut.

Ponownie zawiesić komórki w buforze do lizy w stosunku pięciu mililitrów na gram pasty komórkowej. Lizować komórki za pomocą prasy francuskiej lub homogenizatora komórkowego. Następnie wiruj lizowane komórki w temperaturze 15 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć nielizowane komórki i resztki komórek.

Przenieść supernatant do czystej probówki i ponownie odwirować z dużą prędkością przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powstały osad jest frakcją błonową, która zawiera interesujące białko. Za pomocą homogenizatora Dounce ponownie zawiesić frakcję membranową.

Najpierw przenieś membrany, a następnie dodaj bufor solubilizacyjny o stężeniu 2X bez detergentu. Wlej zawieszone membrany do cylindra z podziałką i dodawaj wodę, aż do osiągnięcia końcowego stężenia buforu 1X solubilizacyjnego. Przenieść próbkę do zlewki i powoli dodawać detergent do końcowego stężenia około 10-krotności krytycznego stężenia miceli.

Następnie mieszaj przez 0,5 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w zależności od tego, jak łatwo docelowe białko zostanie wyekstrahowane z błon. Na koniec odwirować rozpuszczoną próbkę w temperaturze 300 000 razy G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj kolumnę IMAC o pojemności od jednego do pięciu mililitrów lub użyj wstępnie wypełnionej kolumny.

Kolejne etapy chromatografii należy wykonywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Spłucz wodą, aby usunąć wszelkie ślady konserwantów. Jeśli korzystasz z automatycznego systemu oczyszczania, zainstaluj kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta.

Przygotować 500 mililitrów buforu IMAC A bez imidizolu i 250 mililitrów buforu B IMAC z jednym molowym imidizolem. Zrównoważyć kolumnę IMAC, używając 10 objętości kolumny buforu IMAC A. Dodać imidizol do próbki białka do końcowego stężenia 25 milimolów i wymieszać. Następnie załaduj próbkę do zrównoważonej kolumny IMAC z prędkością dwóch mililitrów na minutę.

Zbierz przepływ. Następnie przemyć kolumnę IMAC pięcioma objętościami kolumny, z których każda ma rosnące stężenie imidizolu, używając buforu B. Zebrać popłuczyny w dwóch mililitrowych frakcjach. Eluować próbkę o końcowym stężeniu 250 milimolów dla objętości pięciu kolumn i zebrać eluowaną próbkę w dwóch frakcjach mililitrowych.

Analizuj przepływ, frakcje płuczące i frakcje elucyjne za pomocą analizy SDS-PAGE w oparciu o ich absorbancję przy 280 nanometrach. Zbierz frakcje zawierające docelowy OMP z beczki beta, zgodnie z weryfikacją za pomocą analizy SDS-PAGE. Następnie usuń 6-krotny znacznik histadyny, dodając proteazę TEV do połączonej próbki i inkubując przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem.

Załaduj próbkę roztworu proteazy ponownie do kolumny IMAC, aby oddzielić docelową beczkę beta OMP od rozszczepionych znaczników i wszelkich nieutwardzonych próbek. Przepływ będzie zawierał rozszczepioną próbkę bez znacznika. Aby przygotować się do krystalizacji, należy załadować próbkę do żelowej kolumny filtracyjnej do buforu zawierającego detergent, który ma być użyty do krystalizacji.

Zbierz frakcje o wielkości jednego mililitra i przeanalizuj za pomocą analizy SDS-PAGE na podstawie ich absorbancji przy 280 nanometrach. Zebrać te frakcje, które zawierają białko docelowe, a następnie skoncentrować do około 10 miligramów na mililitr. Przed przygotowaniem próbek należy zmontować aparat żelowy.

Użyj wstępnie schłodzonego bufora do biegania żelu lub uruchom żel w chłodni. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra odśrodkowego o wielkości 0,22 mikrona w celu usunięcia cząstek stałych i opadów. Następnie odpipetuj 0,25 mikrolitra próbki do dwóch 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.

Oznacz jeden jako ugotowany"a drugi jako RT"Następnie dodaj 9,75 mikrolitra buforu próbki do każdej probówki i wymieszaj przez pipetowanie. Do obu próbek dodać również 10 mikrolitrów buforu ładującego 2X SDS i delikatnie wymieszać pipetując. Gotować ugotowaną próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, pozostawiając próbkę RT w temperaturze pokojowej.

Następnie krótko odwiruj ugotowaną próbkę. Następnie załaduj 20 mikrolitrów obu próbek na wstępnie zmontowany natywny żel. Po uruchomieniu żelu przez 60 minut przy stałym napięciu 150 woltów, usuń żel i zanurz go w roztworze barwiącym, aby zobaczyć wyniki.

Kontynuuj próby krystalizacji w detergencie, bikomórkach i lipidowej fazie sześciennej, stosując wcześniej opublikowane metody Jove. Głowice krystalizacyjne są wizualizowane pod mikroskopem UV w celu sprawdzenia, czy kryształy są rzeczywiście białkiem, a nie rozpuszczonym, lipidem lub detergentem. Kryształy ołowiu są przesiewane za pomocą źródła domowego lub w synchrotronie, aby sprawdzić, czy kryształy ulegają odchyleniu.

Po zebraniu danych o kryształach, które dobrze się odpierają, przetwórz dane za pomocą oprogramowania do przetwarzania, takiego jak HKL2000. Przenieś pliki wynikowe do pakietu oprogramowania w celu określenia struktury, takiego jak Phoenix Suit, i wykonaj zastępstwo molekularne w celu wstępnego fazowania i określenia struktury. Tą metodą wyznaczono strukturę krystaliczną YIUR z rozdzielczością 2,6 angstrema.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać i oczyszczać bakteryjne białka błony zewnętrznej do badań strukturalnych.