Name: Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania β-baryłkowych białek błony zewnętrznej bakterii w ilościach miligramowych do badań strukturalnych. Technika umożliwia krystalizację i dyfrakcję tych białek błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Herve Celii z CNRS za dostarczenie zdjęć UV oraz Chrisowi Dettmarowi i Garthowi Simpsonowi z Wydziału Chemii Uniwersytetu Purdue za dostarczenie obrazów SONICC. Chcielibyśmy podziękować za dofinansowanie z Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek oraz Programu Badań Wewnętrznych w Narodowych Instytutach Zdrowia. Ponadto chcielibyśmy podziękować za dodatkowe fundusze z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (A.M.S. i C.J.), Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (N.N. 1K22AI113078-01) oraz Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue (N.N.).

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

β-beczkowe OMP odgrywają istotną rolę w bakteriach Gram-ujemnych, mitochondriach i chloroplastach i są ważnymi celami analizy strukturalnej, która oferuje bogactwo informacji na temat podstawowych mechanizmów molekularnych w zewnętrznych błonach tych odpowiednich organelli. Jednak wyprodukowanie wystarczającej ilości próbki do analizy strukturalnej nie zawsze jest proste, dlatego przedstawiono ogólny rurociąg produkcji wystarczającej ilości docelowych β-beczkowych OMP do określenia struktury, szczegółowo wyjaśniając proc...

β-beczkowe OMP można znaleźć tylko w zewnętrznych błonach mitochondriów, chloroplastach i bakteriach Gram-ujemnych1-3. Chociaż pełnią podobne role jak białka α-helikalne, mają bardzo różne fałdy składające się z centralnej domeny β-beczkowej osadzonej w błonie centralnej, w zakresie od 8 do 26 antyrównoległych nici β, przy czym każda nić jest ściśle połączona z dwiema sąsiednimi niciami (ryc. 1 i 2). Pierwsza i ostatnia nić domeny β-barrel oddziałują następnie ze sobą, prawie wyłącznie w sposób antyrównoległy (z wyjątkiem mitochondrialnego VDAC), aby zamknąć i uszczelnić domenę β-barrel od otaczającej błony. Wszystkie β-beczkowe OMP mają pętle zewnątrzkomórkowe o różnej sekwencji i długości, które odgrywają ważną rolę w interakcjach ligandów i / lub kontaktach białko-białko, przy czym pętle te czasami mają rozmiar nawet 75 reszt, takich jak znalezione w białku wiążącym Neisserial transferynę A (TbpA)4. β-beczkowe OMP mogą również mieć N-końcowe lub C-końcowe rozszerzenia peryplazmatyczne, które służą jako dodatkowe domeny do funkcjonalnego celu białka (np. BamA5-7, FimD8,9, FadL10). Chociaż istnieje wiele typów β-lufowych OMP11, dwa z bardziej powszechnych typów opisano poniżej jako przykłady dla osób mniej zaznajomionych z tą dziedziną: (1) transportery zależne od tony i (2) autotransportery.
Transportery zależne od TonB (np. FepA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) są niezbędne do importu składników odżywczych i zawierają N-końcową domenę wtyczki składającą się z ~150 reszt, która znajduje się schowana w C-końcowej 22-niciowej domenie β-baryłkowej osadzonej w zewnętrznej membranie12 (Rysunek 3). Podczas gdy ta domena czopowa zapobiega swobodnemu przechodzeniu substratu przez domenę beczkowatą, wiązanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w domenie czopowej, która prowadzi do tworzenia porów (albo przez przegrupowanie czopa, albo przez częściowe/pełne wyrzucenie czopa), co może następnie ułatwić transport substratu przez błonę zewnętrzną do peryplazmy. Transportery zależne od TonB są szczególnie ważne dla przetrwania niektórych patogennych szczepów bakterii Gram-ujemnych, takich jak Neisseria meningitidis, które wyewoluowały wyspecjalizowane transportery, które wychwytują składniki odżywcze, takie jak żelazo, bezpośrednio z ludzkich białek gospodarza4,13,14.
Autotransportery należą do systemu wydzielania bakterii Gram-ujemnych typu V i są β-beczkowymi OMP, które składają się z domeny β-beczkowej (zazwyczaj 12-niciowej jak w przypadku EstA i EspP) oraz domeny pasażerskiej, która jest albo wydzielana, albo prezentowana na powierzchni komórki15,16 (Rysunek 3). Te β-beczkowe OMP często odgrywają ważną rolę w przetrwaniu i zjadliwości komórek, a domena pasażera służy jako proteaza, adhezyna i / lub inny efektor, który pośredniczy w patogenezie.
Metody strukturalne, takie jak krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR i mikroskopia elektronowa (EM) pozwalają nam określić modele dla OMP w rozdzielczości atomowej, które z kolei mogą być wykorzystane do dokładnego rozszyfrowania, jak funkcjonują w zewnętrznej membranie. Te bezcenne informacje mogą być następnie wykorzystane do opracowania leków i szczepionek, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład białko wiążące transferynę A (TbpA) znajduje się na powierzchni Neisseria i jest niezbędne do patogenezy, ponieważ bezpośrednio wiąże ludzką transferynę, a następnie ekstrahuje i importuje żelazo dla własnego przetrwania. Bez TbpA Neisseria nie może wymiatać żelaza z ludzkiego gospodarza i staje się niepatogenna. Po rozwiązaniu struktury krystalicznej ludzkiej transferyny związanej z TbpA4 stało się znacznie jaśniejsze, w jaki sposób te dwa białka łączą się, jakie regiony TbpA pośredniczą w interakcji, jakie reszty są ważne dla ekstrakcji żelaza przez TbpA i jak można opracować terapie przeciwko Neisseria ukierunkowanej na TbpA. W związku z tym, biorąc pod uwagę znaczenie β-baryłkowatych OMP w bakteriach Gram-ujemnych dla przeżycia i patogenezy, a także w funkcji mitochondriów i chloroplastów, a także potrzebę dodatkowych informacji strukturalnych na temat tej unikalnej klasy białek błonowych i systemów, w których funkcjonują, przedstawiono ogólne protokoły z ogólnym celem ekspresji i oczyszczania docelowych OMP na wysokich poziomach w celu scharakteryzowania metodami strukturalnymi.

<table><tbody><tr><td>Robot krystalizacyjny</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Any</td><td></td> <td>powinien tu pracować, z wyjątkiem termocyklera do krystalizacji LCP</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Eppendorf,</td> <td>BioRad-Media</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick,</td> spektrometru Infors <td>HT-UV-vis</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>aparatu Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE i natywne żele</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td> <td>Healthcare-Mikrowirówka</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka (niska-średnia prędkość)</td><td>Beckman-Coulter-Ultrawirówka</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(wysoka prędkość) Wirnik</td> <td>Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Wirnik Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti Wirnik</td><td>Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti Homogenizator</td><td>Beckman-Coulter-Dounce</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Emulsiflex</td><td></td><td></td> Avestin-Dialysis <td></td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia LCP Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton, TTP</td> <td>Labtech-VDX</td><td></td></tr> <tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Płytki warstwowe</td><td>Hampton Research, Wymiary molekularne</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Arkusze krystalizacji</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR</td><td>kolumna GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Q-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany krystalizacji</td><td>Hampton Research, Qiagen, Wymiary molekularne-Strzykawka</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gazoszczelna (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Białka błonowe pełnią ważne funkcje w komórkach, takie jak transport składników odżywczych, ruchliwość, sygnalizacja, przeżycie i zjadliwość, ale stanowią tylko ~1% procent znanych struktur. Istnieją dwa rodzaje białek błonowych, α-helisowe i β-beczkowe. Podczas gdy białka błonowe α-helisowe można znaleźć w prawie wszystkich błonach komórkowych, białka błonowe β beczkowe można znaleźć tylko w zewnętrznych błonach mitochondriów, chloroplastach i bakteriach Gram-ujemnych. Jednym z powszechnych wąskich gardeł w badaniach strukturalnych białek błonowych w ogóle jest uzyskanie wystarczającej ilości czystej próbki do analizy. W nadziei na pomoc osobom zainteresowanym w rozwiązaniu struktury ich ulubionego białka błony zewnętrznej β beczki (OMP), przedstawiono ogólne protokoły produkcji docelowych OMP z β beczkami na poziomach przydatnych do określania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej i / lub spektroskopii NMR. W tym miejscu przedstawiamy projekt konstrukcji zarówno dla ekspresji natywnej, jak i dla ekspresji w ciałach inkluzyjnych, oczyszczania za pomocą znacznika powinowactwa i krystalizacji przy użyciu technik przesiewania detergentów, bicelle i lipidowej fazy sześciennej. Protokoły te zostały przetestowane i stwierdzono, że działają w przypadku większości OMP z bakterii Gram-ujemnych; Istnieją jednak pewne cele, szczególnie dla mitochondriów i chloroplastów, które mogą wymagać innych metod ekspresji i oczyszczania. W związku z tym przedstawione metody powinny mieć zastosowanie do większości projektów, które obejmują OMP z bakterii Gram-ujemnych, jednak poziomy ekspresji i ilość oczyszczonej próbki będą się różnić w zależności od docelowego OMP.

YiuR jest zależnym od TonB transporterem żelaza, który stanowi domniemanym celem szczepionkowym przeciwko Yersinia pestis. Został on pierwotnie zidentyfikowany za pomocą analizy mikromacierzy. W niniejszym rozdziale przedstawiono kroki podjęte w celu określenia struktury YiuR przy użyciu krystalografii rentgenowskiej (Rycina 9). Do klonowania wykorzystano sekwencję DNA YiuR (z pominięciem N-końcowej sekwencji sygnałowej), którą namnożono metodą PCR z DNA genomowe...

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie ilości miligramowych białek beta-beczułkowych błony zewnętrznej, które będą zdolne do krystalizacji i dyfrakcji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny fałdowania i transportu białek błonowych, takie jak sposób wbudowywania białek beta-beczułkowych w błony komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka skuteczność w przypadku białek beta-beczułkowych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ dobór detergentów do oczyszczania, krystalizacji i defrakcji jest wymagający. Procedurę zaprezentuje Jeremy Guerin, postdoc z laboratorium Susan Buchanan, wraz ze mną oraz współpracownikami z laboratorium. Należy rozpocząć procedurę od konstrukcji wektora ekspresyjnego T7 zawierającego zoptymalizowany kodon docelowego białka błony zewnętrznej (OMP) do ekspresji in vivo w błonie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przekształć konstrukt w szczep bakterii ekspresyjnych poprzez pipetowanie 1 µL plazmidu do 50 µL chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3), a następnie wymieszaj delikatnie, pipetując ciecz w górę i w dół. Inkubuj na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji poddaj komórki szo

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania β-baryłkowych białek błony zewnętrznej bakterii w ilościach miligramowych do badań strukturalnych. Technika umożliwia krystalizację i dyfrakcję tych białek błonowych.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Przeglądaj więcej filmów