Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie ilości miligramowych białek beta-beczułkowych błony zewnętrznej, które będą zdolne do krystalizacji i dyfrakcji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny fałdowania i transportu białek błonowych, takie jak sposób wbudowywania białek beta-beczułkowych w błony komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka skuteczność w przypadku białek beta-beczułkowych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ dobór detergentów do oczyszczania, krystalizacji i defrakcji jest wymagający. Procedurę zaprezentuje Jeremy Guerin, postdoc z laboratorium Susan Buchanan, wraz ze mną oraz współpracownikami z laboratorium. Należy rozpocząć procedurę od konstrukcji wektora ekspresyjnego T7 zawierającego zoptymalizowany kodon docelowego białka błony zewnętrznej (OMP) do ekspresji in vivo w błonie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przekształć konstrukt w szczep bakterii ekspresyjnych poprzez pipetowanie 1 µL plazmidu do 50 µL chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3), a następnie wymieszaj delikatnie, pipetując ciecz w górę i w dół. Inkubuj na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 30 sekund w łaźni wodnej, a następnie ponownie umieść na lodzie na jedną minutę.

Dodaj jeden mililitr uprzednio ogrzanej pożywki SOC i inkubuj przy 37 °C przez jedną godzinę przy 1000 RPM, używając inkubatora z wytrząsarką naktavową. Po inkubacji wyсій 100 µL komórek na płytki z agarem LB zawierającym odpowiedni antybiotyk i inkubuj przez noc przy 37 °C w pozycji odwróconej. Następnie przeprowadź testy ekspresji w małej skali, szczepiąc pięć mililitrów hodowli LB z antybiotykiem pojedynczą kolonią.

Powtórz procedurę dla od pięciu do 10 kolonii. Inkubuj w temperaturze 37°C z wytrząsaniem do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej około 0,6. Indukuj ekspresję docelowego OMP, dodając 5 µL 1 M IPTG do każdej probówki z hodowlą, i inkubuj przez dodatkowe 1 do 2 godzin.

Aby porównać poziomy ekspresji dla wszystkich kolonii, odwiruj jeden mililitr każdej hodowli przez jedną minutę przy 15 000 ×g w mikrocentryfudze. Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 200 µL 1X buforu do ładowania SDS-PAGE. Podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez pięć minut, a następnie ponownie odwiruj przy 15 000 ×g przez pięć minut.

Próbki należy przeanalizować metodą SDS-PAGE, pipetując 20 µL do każdego otworu żelu o stężeniu 10%. Elektroforezę prowadzić przez 35 minut przy stałym napięciu 200 V. Na koniec komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 6000 ×g przez 10 minut.

Resuspender komórki w buforze lizującym w stosunku pięciu mililitrów na gram pasty komórkowej. Przeprowadzić lizę komórek za pomocą prasy francuskiej lub homogenizatora komórkowego. Następnie wirować zlizowane komórki z prędkością 15 000 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć niezlizowane komórki i szczątki komórkowe.

Przenieś nadsącz do czystej probówki i ponownie wiruj z dużą prędkością przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Powstały osad stanowi frakcję błonową zawierającą białko docelowe. Za pomocą homogenizatora Dounce resuspenduj frakcję błonową.

Najpierw przenieś membrany, a następnie dodaj bufor solubilizujący w stężeniu 2X bez detergentu. Przelej resuspenderowane membrany do cylindra miarowego i dolej wody, aż do osiągnięcia końcowego stężenia 1X buforu solubilizującego. Przenieś próbkę do zlewki i powoli dodawaj detergent do końcowego stężenia wynoszącego około 10-krotność krytycznego stężenia micelarnego.

Następnie mieszać od 0,5 do 16 godzin w temperaturze 4°C, w zależności od tego, jak łatwo białko docelowe ulega ekstrakcji z błon. Na koniec odwirować zsolubilizowaną próbkę z prędkością 300 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze 4°C. Przygotować kolumnę IMAC o pojemności od 1 do 5 ml lub użyć kolumny wstępnie napełnionej.

Kolejne etapy chromatografii należy przeprowadzić w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Płukać wodą, aby usunąć wszelkie ślady konserwantów. W przypadku korzystania z automatycznego systemu oczyszczania, należy zainstalować kolumnę zgodnie z instrukcją producenta.

Przygotuj 500 mililitrów buforu IMAC A bez imidazolu oraz 250 mililitrów buforu IMAC B z imidazolem w stężeniu jeden molarnym. Równoważ kolumnę IMAC, używając 10 objętości kolumny buforu IMAC A. Dodaj imidazol do próbki białka do końcowego stężenia 25 milimolarnego i wymieszaj. Następnie nałóż próbkę na zrównoważoną kolumnę IMAC z prędkością dwóch mililitrów na minutę.

Zebrać przełom. Następnie przemyć kolumnę IMAC pięciokrotnie objętością kolumny buforu B o stopniowo zwiększającym się stężeniu imidazolu. Przeciwpłukania zbierać w frakcjach o objętości 2 ml. Eluować próbkę stężeniem końcowym 250 mM przez pięć objętości kolumny, zbierając eluat w frakcjach o objętości 2 ml.

Przeanalizuj frakcje przepływowe, płukane i elucyjne za pomocą analizy SDS-PAGE na podstawie ich absorbancji przy 280 nanometrach. Zbierz frakcje zawierające docelowe OMP o strukturze beta-beczki, co należy potwierdzić analizą SDS-PAGE. Następnie usuń znacznik 6X histydyny, dodając proteazę TEV do połączonych próbek i inkubując je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu.

Ponownie nałóż roztwór proteazy z próbką na kolumnę IMAC, aby oddzielić docelowe OMP o strukturze beta-beczki od odciętych znaczników oraz nieprzeciętej próbki. Frakcja przepływowa będzie zawierać odciętą próbkę pozbawioną znacznika. W celu przygotowania do krystalizacji nałóż próbkę na kolumnę do filtracji żelowej w buforze zawierającym detergent, który zostanie użyty do krystalizacji.

Zbierać frakcje o objętości 1 ml i analizować je za pomocą SDS-PAGE na podstawie ich absorbancji przy 280 nm. Połączyć frakcje zawierające białko docelowe, a następnie zagęścić do stężenia około 10 mg/ml. Przed przygotowaniem próbek zmontować aparat do elektroforezy żelowej.

Należy użyć schłodzonego buforu do elektroforezy lub przeprowadzić elektroforezę w pomieszczeniu chłodniczym. Próbkę należy przefiltrować przez filtr wirówkowy 0,22 µm w celu usunięcia cząstek stałych i osadów. Następnie należy pipetować 0,25 µl próbki do dwóch probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.

Oznacz jedną probówkę jako „gotowaną”, a drugą jako „RT”. Następnie dodaj 9,75 µL buforu do próbek do każdej probówki i wymieszaj poprzez pipetowanie. Do obu próbek dodaj również 10 µL 2X buforu do ładowania SDS i delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Gotuj próbkę oznaczoną jako „gotowana” w temperaturze 95 °C przez pięć minut, pozostawiając próbkę „RT” w temperaturze pokojowej.

Następnie krótko odwiruj zagotowaną próbkę. Potem nanieś 20 µL obu próbek na wcześniej przygotowany żel natywny. Po prowadzeniu elektroforezy przez 60 minut przy stałym napięciu 150 V wyjmij żel i zanurz go w roztworze barwiącym, aby zwizualizować wyniki.

Należy przeprowadzić próby krystalizacji w detergentach, bi-komórkach oraz w lipidowej fazie kubicznej, stosując wcześniej opublikowane metody JoVE. Głowice krystalizacyjne są wizualizowane pod mikroskopem UV w celu weryfikacji, czy kryształy są rzeczywiście białkowe, a nie stanowią soli, lipidów lub detergentu. Wybrane kryształy są badane przy użyciu źródła domowego lub w synchrotronie, aby sprawdzić, czy ulegają dyfrakcji.

Po zebraniu danych z kryształów o dobrej dyfrakcji, przetwórz dane przy użyciu oprogramowania do przetwarzania, takiego jak HKL2000. Prześlij wynikowe pliki do pakietu programów do wyznaczania struktury, takiego jak Phoenix Suit, i wykonaj wymianę molekularną w celu wstępnego wyznaczenia faz oraz określenia struktury. Strukturę krystaliczną YIUR wyznaczono tą metodą z rozdzielczością 2,6 Angstrom.

Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, proces ten można zrealizować w ciągu dwóch tygodni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ekspresować i oczyszczać bakteryjne białka błony zewnętrznej na potrzeby badań strukturalnych.