Name: Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji mikropęcherzyków i egzosomów za pomocą papierowego urządzenia XO Pad. Ta technika umożliwia wstępną koncentrację bez chemikaliów i maszyn, z wyższą wydajnością odzysku niż metody konwencjonalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee otrzymał grant badawczy z Uniwersytetu Kwangwoon w 2019 roku. Hyerin Kim była wspierana przez "Program Rozwoju Kompetencji dla Specjalistów Branżowych" Koreańskiego Ministerstwa Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE), prowadzony przez Koreański Instytut Rozwoju Technologii (KIAT) (nr P0002397, program HRD dla przemysłowej konwergencji inteligentnych urządzeń do noszenia).

1. Produkcja urządzeń
<ol>
	<li>Zdefiniuj obszar do wydrukowania na papierze za pomocą oprogramowania drukarki (Tabela materiałów). 
	UWAGA: Wzór składa się z 12 warstw z wzorem woskowym, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od 5 mm do 2 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego (Tabela materiałów) za pomocą komercyjnej drukarki woskowej (Tabela materiałów) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść papier zadrukowany woskiem w piecu laboratoryjnym na 80 s w temperaturze 120 °C. 
	UWAGA: Ten krok umożliwia woskowi dotarcie do wnętrza papieru poprzez uzyskanie termicznego rozpływu zadrukowanego wosku. Dzięki temu protokołowi inkubacji rozdzielczość wzoru wynosi ~2 mm. Dlatego należy uważać, aby nie drukować wzorów mniejszych niż 2 mm. W przeciwnym razie wzory zostaną zablokowane przez wosk.</li>
	<li>Wytnij papier zadrukowany woskiem za pomocą noża, aby wykonać indywidualne urządzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Upuść 5 μl i 2 μl membrany permselektywnej (np. Nafion; Tabela materiałów) na obszarach próbki w warstwach skrajnych po lewej i prawej stronie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Warstwy pokryte membraną permselektywną umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C na 30 minut w celu odparowania rozpuszczalnika membrany permselektywnej.</li>
	<li>Uszczelnij najbardziej zewnętrzną powierzchnię powlekanej warstwy skierowaną w stronę roztworu buforowego taśmą samoprzylepną, pozostawiając mały otwór.</li>
	<li>Złóż wydrukowane pojedyncze urządzenie (np. Exo-PAD) w przód iw tył wzdłuż białych linii. 
	UWAGA: Po złożeniu urządzenia wszystkie obszary próbki stają się zbieżnie połączone (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Ta konwergentna konstrukcja skupia linie pola elektrycznego, gdy napięcie jest przykładane do ICP, osiągając bardziej intensywną koncentrację wstępną mikropęcherzyków i egzosomów.</li>
</ol>
2. Wzbogacanie i ogniskowanie przestrzenne mikropęcherzyków i egzosomów poprzez polaryzację stężenia jonów
<ol>
	<li>Załaduj 15 μl próbki mikropęcherzyków i egzosomu (~3 x 1011 cząstek/ml w 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS] z 0,05% Tween 20) do zbieżnych obszarów próbki przez pipetowanie i odczekaj kilka sekund, aby zapewnić całkowite zwilżenie wszystkich obszarów próbki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Umieść dwie akrylowe komory na obu końcach Exo-PAD i zaciśnij Exo-PAD bezpiecznie za pomocą małych klipsów do segregatora, aby zapobiec rozkładaniu się (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Napełnij komory 110 μL 0,1x PBS i włóż dwie elektrody Ag/AgCl (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H).</li>
	<li>Przyłożyć 30 V do elektrod przez 20 minut za pomocą systemu pomiaru źródła prądu i napięcia (tabela materiałów). 
	UWAGA: Przyłożone napięcie generuje zjawisko ICP, a tym samym wstępnie koncentruje mikropęcherzyki i egzosomy na warstwach 8 i 9 Exo-PAD.</li>
</ol>
3. Izolacja wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów
<ol>
	<li>Oddziel złożony Exo-PAD od komór akrylowych i rozłóż urządzenie, aby wyizolować wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy od pozostałych warstw (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Wyciąć obszary próbki w warstwach 8 i 9, gdzie mikropęcherzyki i egzosomy są wzbogacone, do dalszej analizy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1J).</li>
</ol>
4. Analiza skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Utrwalić wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy, zanurzając wybite obszary w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu na 1 godzinę i w 1% tetratlenku osmu w 0,1 M kakodylanu sodu na 1 godzinę 
	UWAGA: Tetratlenek osmu jest silnie trującą i niebezpieczną substancją chemiczną. Ponieważ tetratlenek osmu może przenikać do tworzyw sztucznych, musi być przechowywany w szkle. Wszelkie obchodzenie się z tetratlenkiem osmu musi odbywać się w okapie oparów chemicznych z podwójnymi rękawicami nitrylowymi.</li>
	<li>Odwodnić utrwalone mikropęcherzyki i egzosomy rosnącymi stopniami 200-procentowego etanolu (tj. 50%, 70%, 90% i 100%) przez 30 minut każdy.</li>
	<li>Wysuszyć chemicznie próbkę, zanurzając ją w heksametylodilazanie w eksykatorze na 30 min. 
	UWAGA: Heksetylodilazan jest łatwopalną i wrażliwą na wilgoć substancją chemiczną. Musi być przechowywany w suchym i dobrze wentylowanym miejscu, z dala od źródeł zapłonu.</li>
	<li>Pokryj całkowicie wysuszone mikropęcherzyki i egzosomy złotem/palladem (~20 nm) za pomocą rozpylania i przechwytywania obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).</li>
</ol>
5. Analiza śledzenia nanocząstek
<ol>
	<li>Wyciąć obszary próbki w warstwach 6, 8 i 10 za pomocą stempla biopsyjnego po 20 minutach pracy urządzenia.</li>
	<li>Zanurz każdy wycięty obszar w roztworze buforowym (0,1x PBS z 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Wirować przez 10 minut i wirować przez 30 s przy 6,000 obr./min w celu ponownego zawieszenia wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów.</li>
	<li>Usuń wycięte obszary z roztworu i zmierz stężenie mikropęcherzyków i egzosomów za pomocą przyrządu do analizy śledzenia nanocząstek (NTA) (tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż Exo-PAD był z powodzeniem stosowany do wzbogacania i izolacji mikropęcherzyków i egzosomów, należy dokładnie rozważyć kilka krytycznych punktów: 1) czas inkubacji w piecu i temperaturę podczas przygotowywania urządzenia, 2) czas przetwarzania, 3) zastosowanie napięcia o różnych numerach warstw i średnicach powierzchni próbki oraz 4) możliwość zastosowania do próbek klinicznych.
Czas inkubacji i temperatura podane w protokole są optymalnymi warunkami do wytworzenia niezawodnego urządzen...

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe pęcherzyki błonowe o wymiarach odpowiednio 0,2−1 μm i 30−200 nm. Są one wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego przez kilka różnych typów komórek1,2,3,4,5. Zawierają one informacje o komórkach rodzicielskich w postaci podzbiorów DNA, mRNA, miRNA, białek i lipidów i krążą w całym organizmie za pośrednictwem różnych płynów ustrojowych, takich jak surowica, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn owodniowy i ślina6,7,8,9. W związku z tym techniki skutecznej izolacji mikropęcherzyków i egzosomów z płynów biologicznych mogą zapewnić szerokie możliwości w dziedzinie diagnozowania, prognozowania i monitorowania chorób w czasie rzeczywistym, a także w opracowywaniu nowych środków terapeutycznych.
Jednak konwencjonalna metoda izolacji mikropęcherzyków i egzosomów oparta na ultrawirowaniu jest niezwykle czasochłonna i powoduje znaczne straty i zanieczyszczenie próbki. Dzieje się tak, ponieważ wiąże się to z kilkoma kłopotliwymi etapami pipetowania i ładowania oraz odrzucaniem różnych odczynników przy wielokrotnym ultrawirowaniu5,6,10,11,12. Co więcej, wysokie naprężenie ścinające wywołane ultrawirowaniem (~100 000 x g) może powodować fizyczną lizę mikropęcherzyków i egzosomów, co skutkuje słabymi wskaźnikami odzysku (5−23%)6,13,14. Dlatego należy opracować wysoce wydajną, dyskretną technikę izolacji mikropęcherzyków i egzosomów, aby zmniejszyć uszkodzenia i straty, osiągając w ten sposób wyższe wskaźniki odzysku.
Urządzenie oparte na papierze origami (Exo-PAD) zostało opracowane do prostszej, łagodniejszej i wysoce efektywnej izolacji mikropęcherzyków i egzosomów6. Konstrukcja Exo-PAD to wielokrotnie składany papier z szeregowo połączonymi obszarami próbki, które stopniowo zmniejszają swoją średnicę. Technika polaryzacji stężenia jonów (ICP), która jest zjawiskiem nanoelektrokinetycznym, które wstępnie koncentruje naładowane biomolekuły, została zintegrowana z tym unikalnym projektem. Zastosowanie Exo-PAD skutkowało pięciokrotnym wzbogaceniem mikropęcherzyków i egzosomów w określone warstwy oraz ich izolacją poprzez proste rozłożenie urządzenia. Ten artykuł szczegółowo opisuje Exo-PAD, od ogólnej produkcji i działania urządzenia po analizę jego użycia, aby zilustrować metodę i pokazać reprezentatywne wyniki6.

<table><tbody><tr><td>Elektrody Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td><td>Albumina o średnicy 0,15"</td></tr><tr><td>z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA sprzężony z Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Bufor węglanowo-wodorowęglanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Bufor węglanowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CorelDraw (Coral Co., Kanada)</td><td>Oprogramowanie drukarki Corel Corporation</td><td></td><td>do definiowania druku woskiem region</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Drukarka woskowa</td></tr><tr><td>Bibuła chromatograficzna klasa 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Papier celulozowy, wymiar: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Wzorce egzosomów znakowane fluorescencyjnie</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Egzosom oznaczony FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Miernik źródła prądu/napięcia Keithley 2410</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Bieżący&ndash; system pomiaru źródła napięcia</td></tr><tr><td>Roztwór żywicy perfluorowanej Nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Membrana permselektywna, 20% wag. % w mieszaninie niższych alkoholi alifatycznych i wody; zawiera 34% wody</td></tr><tr>Technologia <td></td><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight</td><td>Maszyna do analizy śledzenia nanocząstek (NTA)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Mikropęcherzyki i egzosomy to małe błoniaste pęcherzyki uwalniane do środowiska zewnątrzkomórkowego i krążące po całym ciele. Ponieważ zawierają różne biomolekuły pochodzące z komórek rodzicielskich, takie jak DNA, mRNA, miRNA, białka i lipidy, ich wzbogacenie i izolacja są kluczowymi etapami ich wykorzystania jako potencjalnych biomarkerów do zastosowań klinicznych. Jednak konwencjonalne metody izolacji (np. ultrawirowanie) powodują znaczne straty i uszkodzenia mikropęcherzyków i egzosomów. Metody te wymagają również wielu powtarzających się etapów ultrawirowania, ładowania i marnowania odczynników. W artykule opisano szczegółową metodę wytwarzania urządzenia na bazie papieru origami (Exo-PAD) przeznaczonego do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów w prosty sposób. Unikalna konstrukcja Exo-PAD, składająca się z wielowarstwowych warstw przypominających harmonijkę ze zbieżnymi obszarami próbki, jest zintegrowana z techniką polaryzacji stężenia jonów, umożliwiając w ten sposób pięciokrotne wzbogacenie mikropęcherzyków i egzosomów na określonych warstwach. Ponadto wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy są izolowane po prostu przez rozłożenie Exo-PAD.

Czas operacyjny musi zostać zoptymalizowany, aby osiągnąć maksymalną wydajność odzysku wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów. Zbyt krótki czas nie pozwala na wystarczającą migrację mikropęcherzyków i egzosomów, co zmniejsza stopień wzbogacenia, natomiast czas nadmierny pogarsza ogniskowanie przestrzenne, a w konsekwencji rozprasza mikropęcherzyki i egzosomy. Dzięki etapowi optymalizacji czasu można zatem określić maksymalny czynnik prekoniestracji mikropęcherzyków i egzosomów oraz ostateczną lokalizację, w której są ...

Prezentowany jest protokół do produkcji papierowego urządzenia do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów.

Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

W tym protokole opisujemy prostą metodę wytwarzania papierowego urządzenia o nazwie XO Pad, które jest przeznaczone do skutecznego wzbogacania w izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. XO Pad to proste urządzenie, które może wstępnie zagęścić i wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe bez użycia jakichkolwiek chemikaliów lub maszyn roboczych, wykazując jednocześnie wyższe wskaźniki odzysku niż konwencjonalne metody. Zacznij od zdefiniowania regionu do wydrukowania za pomocą oprogramowania drukarki.Projekt powinien składać się z 12 warstw z wzorem wosku, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od pięciu do dwóch milimetrów. Następnie wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego. Umieść papier z nadrukiem woskowanym w piecu laboratoryjnym na 80 sekund w temperaturze 120 stopni Celsjusza, a następnie pokrój papier zadrukowany woskiem za pomocą noża, aby uzyskać indywidualne urządzenia XO Pad.Upuść pięć i dwa mikrolitry selektywnej membrany do trwałej ondulacji na obszary próbki odpowiednio w skrajnej lewej i prawej warstwie. Warstwy oznaczone membraną selektywną do trwałej ondulacji umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 30 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Następnie uszczelnij najbardziej zewnętrzną powierzchnię powlekanej warstwy skierowaną w stronę roztworu buforowego taśmą samoprzylepną, pozostawiając mały otwór.Złóż urządzenie XO Pad w przód iw tył wzdłuż białych linii, aby zbieżnie połączyć wszystkie obszary próbki. Pobrać pipetę 15 mikrolitrów próbki mikropęcherzyków i egzosomu w zbieżnych obszarach próbki i odczekać kilka sekund, aby zapewnić całkowite zwilżenie. Umieść dwie akrylowe komory na obu końcach XO Pad i zaciśnij go bezpiecznie za pomocą małych klipsów do segregatora, aby zapobiec rozkładaniu.Napełnij komory 110 mikrolitrami 0,1X PBS i włóż dwie srebrne elektrody. Następnie użyj systemu pomiaru źródła napięcia prądu, aby przyłożyć 30 woltów do elektrod przez 20 minut. Aby wyizolować wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy, należy oddzielić złożoną podkładkę XO Pad od komór akrylowych i rozłożyć urządzenie, aby odizolować wzbogacone cząstki od pozostałych warstw.Wykraść obszary próbki w warstwach ósmej i dziewiątej, gdzie mikropęcherzyki i egzosomy są wzbogacone do dalszej analizy. Przeprowadzono test migracji poklatkowej znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków i egzosomów w celu optymalizacji czasu operacji w celu maksymalnego odzysku wzbogaconych cząstek. Intensywności fluorescencji we wszystkich obszarach próbki określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.Przed procesem wzbogacania mikropęcherzyki i egzosomy zostały rozproszone we wszystkich obszarach próbki ze stopniowym zmniejszaniem intensywności. Po 10 minutach przetwarzania cząstki migrowały elektrokinetycznie i na siódmej warstwie pojawił się natychmiastowy czop wstępnego zatężenia. Gdy czas osiągnął 20 minut, mikropęcherzyki i egzosomy zostały silnie skoncentrowane na warstwach ósmej i dziewiątej i wzbogacone pięciokrotnie w zależności od intensywności fluorescencji.Integralność wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów w warstwie ósmej badano za pomocą SEM. Po procesie wzbogacania zaobserwowano znacznie więcej nieuszkodzonych cząstek. Przeanalizowano również rozkład wielkości wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów.Następnie przeanalizowano rzeczywiste stężenie wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów na obszarach próbek w warstwach szóstej, ósmej i dziesiątej. W warstwie ósmej mikropęcherzyki i egzosomy zostały wstępnie zagęszczone przez współczynnik 5,58, ale w pozostałych warstwach nie zaobserwowano zauważalnego stężenia wstępnego. Aby zapewnić powtarzalność tej procedury, należy dokładnie przestrzegać protokołu dotyczącego czasu inkubacji i temperatury pieca podczas weryfikacji urządzenia i czasu pracy urządzenia, ponieważ są to warunki zoptymalizowane.XO Pad może być również używany do oddzielania i izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od próbek bogatych w białka, takich jak surowica lub osocze, za pomocą buforu węglanowego. Protokół ten może stanowić wydajne, proste narzędzie przygotowawcze, z jego możliwościami wstępnej koncentracji i izolacji wymaganymi w badaniach klinicznych, takich jak diagnoza, dostarczanie leków, immunoterapia i inne terapie.

paper-based-preconcentration-isolation-microvesicles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błoniastych cząsteczek uwalnianych z komórek, z zaledwie 10 μl próbek surowicy. Takie podejście pozwala obejść potrzebę ultrawirowania, wymaga tylko kilku minut czasu na oznaczenie i umożliwia izolację EV od próbek o ograniczonej objętości.

Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę izolacji mikropęcherzyków i egzosomów za pomocą papierowego urządzenia XO Pad. Ta technika umożliwia wstępną koncentrację bez chemikaliów i maszyn, z wyższą wydajnością odzysku niż metody konwencjonalne.

Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

Przeglądaj więcej filmów