Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

W tym protokole opisujemy prostą metodę wytwarzania papierowego urządzenia o nazwie XO Pad, które jest przeznaczone do skutecznego wzbogacania w izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. XO Pad to proste urządzenie, które może wstępnie zagęścić i wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe bez użycia jakichkolwiek chemikaliów lub maszyn roboczych, wykazując jednocześnie wyższe wskaźniki odzysku niż konwencjonalne metody. Zacznij od zdefiniowania regionu do wydrukowania za pomocą oprogramowania drukarki.

Projekt powinien składać się z 12 warstw z wzorem wosku, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od pięciu do dwóch milimetrów. Następnie wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego. Umieść papier z nadrukiem woskowanym w piecu laboratoryjnym na 80 sekund w temperaturze 120 stopni Celsjusza, a następnie pokrój papier zadrukowany woskiem za pomocą noża, aby uzyskać indywidualne urządzenia XO Pad.

Upuść pięć i dwa mikrolitry selektywnej membrany do trwałej ondulacji na obszary próbki odpowiednio w skrajnej lewej i prawej warstwie. Warstwy oznaczone membraną selektywną do trwałej ondulacji umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 30 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Następnie uszczelnij najbardziej zewnętrzną powierzchnię powlekanej warstwy skierowaną w stronę roztworu buforowego taśmą samoprzylepną, pozostawiając mały otwór.

Złóż urządzenie XO Pad w przód iw tył wzdłuż białych linii, aby zbieżnie połączyć wszystkie obszary próbki. Pobrać pipetę 15 mikrolitrów próbki mikropęcherzyków i egzosomu w zbieżnych obszarach próbki i odczekać kilka sekund, aby zapewnić całkowite zwilżenie. Umieść dwie akrylowe komory na obu końcach XO Pad i zaciśnij go bezpiecznie za pomocą małych klipsów do segregatora, aby zapobiec rozkładaniu.

Napełnij komory 110 mikrolitrami 0,1X PBS i włóż dwie srebrne elektrody. Następnie użyj systemu pomiaru źródła napięcia prądu, aby przyłożyć 30 woltów do elektrod przez 20 minut. Aby wyizolować wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy, należy oddzielić złożoną podkładkę XO Pad od komór akrylowych i rozłożyć urządzenie, aby odizolować wzbogacone cząstki od pozostałych warstw.

Wykraść obszary próbki w warstwach ósmej i dziewiątej, gdzie mikropęcherzyki i egzosomy są wzbogacone do dalszej analizy. Przeprowadzono test migracji poklatkowej znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków i egzosomów w celu optymalizacji czasu operacji w celu maksymalnego odzysku wzbogaconych cząstek. Intensywności fluorescencji we wszystkich obszarach próbki określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

Przed procesem wzbogacania mikropęcherzyki i egzosomy zostały rozproszone we wszystkich obszarach próbki ze stopniowym zmniejszaniem intensywności. Po 10 minutach przetwarzania cząstki migrowały elektrokinetycznie i na siódmej warstwie pojawił się natychmiastowy czop wstępnego zatężenia. Gdy czas osiągnął 20 minut, mikropęcherzyki i egzosomy zostały silnie skoncentrowane na warstwach ósmej i dziewiątej i wzbogacone pięciokrotnie w zależności od intensywności fluorescencji.

Integralność wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów w warstwie ósmej badano za pomocą SEM. Po procesie wzbogacania zaobserwowano znacznie więcej nieuszkodzonych cząstek. Przeanalizowano również rozkład wielkości wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów.

Następnie przeanalizowano rzeczywiste stężenie wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów na obszarach próbek w warstwach szóstej, ósmej i dziesiątej. W warstwie ósmej mikropęcherzyki i egzosomy zostały wstępnie zagęszczone przez współczynnik 5,58, ale w pozostałych warstwach nie zaobserwowano zauważalnego stężenia wstępnego. Aby zapewnić powtarzalność tej procedury, należy dokładnie przestrzegać protokołu dotyczącego czasu inkubacji i temperatury pieca podczas weryfikacji urządzenia i czasu pracy urządzenia, ponieważ są to warunki zoptymalizowane.

XO Pad może być również używany do oddzielania i izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od próbek bogatych w białka, takich jak surowica lub osocze, za pomocą buforu węglanowego. Protokół ten może stanowić wydajne, proste narzędzie przygotowawcze, z jego możliwościami wstępnej koncentracji i izolacji wymaganymi w badaniach klinicznych, takich jak diagnoza, dostarczanie leków, immunoterapia i inne terapie.