Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru
29 kwietnia 2020
Prezentowany jest protokół do produkcji papierowego urządzenia do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów.
W tym protokole opisujemy prostą metodę wytwarzania papierowego urządzenia o nazwie XO Pad, które jest przeznaczone do skutecznego wzbogacania w izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. XO Pad to proste urządzenie, które może wstępnie zagęścić i wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe bez użycia jakichkolwiek chemikaliów lub maszyn roboczych, wykazując jednocześnie wyższe wskaźniki odzysku niż konwencjonalne metody. Zacznij od zdefiniowania regionu do wydrukowania za pomocą oprogramowania drukarki.
Projekt powinien składać się z 12 warstw z wzorem wosku, w których średnice okrągłych obszarów próbki stopniowo zmniejszają się od pięciu do dwóch milimetrów. Następnie wydrukuj wosk hydrofobowy na wyznaczonych obszarach po obu stronach papieru celulozowego. Umieść papier z nadrukiem woskowanym w piecu laboratoryjnym na 80 sekund w temperaturze 120 stopni Celsjusza, a następnie pokrój papier zadrukowany woskiem za pomocą noża, aby uzyskać indywidualne urządzenia XO Pad.
Upuść pięć i dwa mikrolitry selektywnej membrany do trwałej ondulacji na obszary próbki odpowiednio w skrajnej lewej i prawej warstwie. Warstwy oznaczone membraną selektywną do trwałej ondulacji umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 30 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Następnie uszczelnij najbardziej zewnętrzną powierzchnię powlekanej warstwy skierowaną w stronę roztworu buforowego taśmą samoprzylepną, pozostawiając mały otwór.
Złóż urządzenie XO Pad w przód iw tył wzdłuż białych linii, aby zbieżnie połączyć wszystkie obszary próbki. Pobrać pipetę 15 mikrolitrów próbki mikropęcherzyków i egzosomu w zbieżnych obszarach próbki i odczekać kilka sekund, aby zapewnić całkowite zwilżenie. Umieść dwie akrylowe komory na obu końcach XO Pad i zaciśnij go bezpiecznie za pomocą małych klipsów do segregatora, aby zapobiec rozkładaniu.
Napełnij komory 110 mikrolitrami 0,1X PBS i włóż dwie srebrne elektrody. Następnie użyj systemu pomiaru źródła napięcia prądu, aby przyłożyć 30 woltów do elektrod przez 20 minut. Aby wyizolować wzbogacone mikropęcherzyki i egzosomy, należy oddzielić złożoną podkładkę XO Pad od komór akrylowych i rozłożyć urządzenie, aby odizolować wzbogacone cząstki od pozostałych warstw.
Wykraść obszary próbki w warstwach ósmej i dziewiątej, gdzie mikropęcherzyki i egzosomy są wzbogacone do dalszej analizy. Przeprowadzono test migracji poklatkowej znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków i egzosomów w celu optymalizacji czasu operacji w celu maksymalnego odzysku wzbogaconych cząstek. Intensywności fluorescencji we wszystkich obszarach próbki określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Przed procesem wzbogacania mikropęcherzyki i egzosomy zostały rozproszone we wszystkich obszarach próbki ze stopniowym zmniejszaniem intensywności. Po 10 minutach przetwarzania cząstki migrowały elektrokinetycznie i na siódmej warstwie pojawił się natychmiastowy czop wstępnego zatężenia. Gdy czas osiągnął 20 minut, mikropęcherzyki i egzosomy zostały silnie skoncentrowane na warstwach ósmej i dziewiątej i wzbogacone pięciokrotnie w zależności od intensywności fluorescencji.
Integralność wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów w warstwie ósmej badano za pomocą SEM. Po procesie wzbogacania zaobserwowano znacznie więcej nieuszkodzonych cząstek. Przeanalizowano również rozkład wielkości wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów.
Następnie przeanalizowano rzeczywiste stężenie wzbogaconych mikropęcherzyków i egzosomów na obszarach próbek w warstwach szóstej, ósmej i dziesiątej. W warstwie ósmej mikropęcherzyki i egzosomy zostały wstępnie zagęszczone przez współczynnik 5,58, ale w pozostałych warstwach nie zaobserwowano zauważalnego stężenia wstępnego. Aby zapewnić powtarzalność tej procedury, należy dokładnie przestrzegać protokołu dotyczącego czasu inkubacji i temperatury pieca podczas weryfikacji urządzenia i czasu pracy urządzenia, ponieważ są to warunki zoptymalizowane.
XO Pad może być również używany do oddzielania i izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od próbek bogatych w białka, takich jak surowica lub osocze, za pomocą buforu węglanowego. Protokół ten może stanowić wydajne, proste narzędzie przygotowawcze, z jego możliwościami wstępnej koncentracji i izolacji wymaganymi w badaniach klinicznych, takich jak diagnoza, dostarczanie leków, immunoterapia i inne terapie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wytwarzania urządzenia o nazwie XO Pad, opartego na papierze, zaprojektowanego do efektywnego wzbogacania i izolacji wezykuł zewnątrzkomórkowych. XO Pad umożliwia prekoncentrację i izolację bez użycia chemikaliów lub maszyn, wykazując wyższe współczynniki odzysku niż tradycyjne metody.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biotechnologia
- Wezykuły zewnątrzkomórkowe
Tło
- Wezykuły zewnątrzkomórkowe odgrywają kluczową rolę w komunikacji komórkowej.
- Konwencjonalne metody izolacji tych wezykuł często wymagają skomplikowanych procedur.
- XO Pad oferuje prostszą alternatywę dla badaczy.
- Wyższe współczynniki odzysku mogą poprawić badania nad wezykułami zewnątrzkomórkowymi.
Cel badania
- Zaoferowanie prostego metodu izolacji mikrowezykuł i egzosomów.
- Poprawa współczynników odzysku w porównaniu z istniejącymi technikami.
- Ułatwienie badań nad biologią wezykuł zewnątrzkomórkowych.
Stosowane metody
- Projektowanie XO Pad z 12 warstwami wzorowanymi na wosku.
- Drukowanie hydrofobowanego wosku na papierze celulozowym.
- Podgrzewanie wydrukowanej papieru w piekarniku laboratoryjnym.
- Cięcie wydrukowanej papieru woskowej na pojedyncze urządzenia XO Pad.
Główne wyniki
- XO Pad skutecznie wzbogaca i izoluje wezykuły zewnątrzkomórkowe.
- Wykazano wyższe współczynniki odzysku niż w metodach konwencjonalnych.
- Prosty proces produkcji bez potrzeby użycia chemikaliów.
- Możliwość szerokiego zastosowania w badaniach.
Wnioski
- XO Pad jest cennym narzędziem dla badaczy studiujących wezykuły zewnątrzkomórkowe.
- Upraszcza proces izolacji poprawiając efektywność.
- Ta metoda może poszerzyć zrozumienie funkcji wezykuł zewnątrzkomórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of extracellular vesicles remains a bottleneck in biomarker discovery due to low yield and sample damage from conventional methods. The paper-based Exo-PAD enables chemical-free, fivefold enrichment of microvesicles and exosomes, improving recovery while preserving vesicle integrity. This supports early-stage target validation and assay development by providing a scalable, reproducible workflow for downstream omics and functional analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through enriched vesicle cargo analysis.
- Operational Value: Reduces sample loss and damage compared to ultracentrifugation, increasing usable material for target de-risking.
- Predictive Value: Fivefold enrichment improves signal detection in low-abundance biomarkers, supporting portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, concentrated vesicle preparations suitable for assay standardization.
- Operational Value: Eliminates need for centrifuges or chemicals, simplifying workflow and reducing operational complexity.
- Scalability: Paper-based design allows parallel processing and platform reuse across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enriched vesicles maintain integrity for downstream functional assays and biomarker profiling.
- Disease-Relevant Systems: Compatible with biofluids like serum or plasma when used with carbonate buffer, supporting clinical relevance.
- Mechanistic De-risking: Reliable isolation enables consistent evaluation of vesicle-mediated mechanisms in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The Exo-PAD fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling reliable vesicle preparation for analytical and functional downstream applications.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by providing intact vesicles for cargo analysis and pathway interrogation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs essential for assay readiness and compound screening campaigns.
- Analytics: Enables fluorescence-based quantification and size distribution analysis for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through preserved vesicle structure and function.
- Enterprise Reuse: Simple fabrication and operation allow adoption as a reusable platform across teams and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through higher recovery and intact vesicle isolation.
- Operational Value: Standardizes enrichment process, reduces reagent waste, and eliminates equipment dependency.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by reducing false negatives in biomarker detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through reliable, scalable vesicle preparation for diagnostic and therapeutic applications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in wax patterning and ion concentration polarization principles for device fabrication.
- Needs access to laboratory oven, hot plate, cutter, and voltage source for operation.
- Demands standardization of sample volume, buffer composition, and processing time across users.
- Adaptation to viscous biofluids may require buffer optimization, such as carbonate serum/plasma compatibility.
- Practical limitation: Enrichment is layer-specific (layers 8–9), requiring precise puning for downstream analysis.
