Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Protokół ten zapewnia szybką i specyficzną dla wielkości metodę roztworu dla małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację parametrów sortowania cytometrii przepływowej. Optymalizacje te zapewniają panel krytycznych ustawień sortowania, który umożliwia uzyskanie reprezentatywnych populacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu tylko rozproszenia do przodu w porównaniu z rozproszeniem rozmiaru. Rozpocznij od wykonania standardowej procedury uruchamiania sortera przepływowego.

Włącz urządzenie, naciskając przycisk uruchamiania, a następnie kliknij przycisk zasilania lasera na panelu sterowania lasera. Naciśnij przycisk zmiany zbiorników w podmenu Smart Sampler, aby zwiększyć ciśnienie w płynach. Użyj ultradźwiękowo oczyszczonej dyszy strumieniowej i powietrznej o średnicy 50 mikrometrów i zainstaluj ją w zespole dyszy.

Dostosuj ciśnienie do 80 SI dla płynu w osłonie i 80,3 SI dla przepływu próbki na konsoli ciśnieniowej. Naciśnij przycisk rozpoczęcia przepływu osłony, aby rozpocząć przepływ strumienia osłony. Kliknij przycisk bąbelka w podmenu Smart Sampler, aby automatycznie usunąć bąbelki na 10 minut, a następnie wyłącz go.

Aby wyrównać strumień i określić plamkę lasera, włącz światło komory oświetleniowej, aby view strumień nad otworami. Wyreguluj mikrometry w górę iw dół, w lewo i w prawo oraz z przodu i z tyłu, aby wyśrodkować strumień na otworku i skupić strumień. Otwórz wszystkie migawki lasera, wybierz zakładkę przechwytywania lasera i strumienia, a następnie naciśnij przycisk zielonej strzałki w sposób ciągły zgodnie z monitem, aby zakończyć proces kalibracji przechwytywania lasera i wyrównania dyszy.

Uzyskaj dostęp do ekranu precyzyjnego wyrównywania lasera. Jako parametr osi x należy wybrać laser 640 nm i kanał pasmowoprzepustowy 772 bar 44 jako parametr osi x oraz laser 405 nm i kanał pasmowoprzepustowy 448 bar 59 jako parametr osi y. Naciśnij selektor parametrów wyzwalania i wybierz parametr rozproszenia do przodu lasera o długości 488 nanometrów.

Następnie rozcieńczyć tęczowe cząstki fluorescencyjne, dodając jedną kroplę do jednego mililitra podwójnie destylowanej wody do końcowego stężenia od 10 do sześciu kulek na mililitr. Otwórz drzwi komory na próbki i załaduj probówkę z przygotowanymi tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi. Naciśnij przycisk start sample i dostosuj mikrometry w górę iw dół, aby zoptymalizować intensywność fluorescencji, aby każdy sygnał był tak intensywny, jak to tylko możliwe.

Naciśnij przycisk rozpoczęcia kontroli jakości lub kontroli jakości na panelu sterowania na ekranie dotykowym, aby automatycznie przeprowadzić kontrolę jakości. Następnie naciśnij przycisk inicjalizacji IntelliSort. Przyrząd automatycznie dostosowuje częstotliwość i amplitudę oscylacji kropli, aby uzyskać opóźnienie kropli około 25 i być w stanie wyraźnie zwizualizować punkt zerwania kropli.

Następnie naciśnij przycisk opóźnienia upuszczania i przycisk podtrzymania. Wybierz rurę jako typ wyjścia sortowania. Umieść 15-mililitrowy uchwyt na probówki w komorze sortowania.

Włącz napięcie płytki i ustaw napięcie płytki na około 4 000 woltów. Następnie włącz wzorzec testowy, wybierając przycisk konfiguracji strumienia. Wyreguluj suwak fazy ładowania i suwak odchylenia, aby upewnić się, że obraz strumienia jest zgodny z rurką zbiorczą.

Następnie wybierz przycisk znacznika wyboru. Zaloguj się do stacji roboczej Summit na komputerze. Utwórz nowy protokół z menu głównego pliku.

Następnie utwórz wykres punktowy, wybierając zakładkę histogramu w panelu sterowania Summit Software. Wybierz rozproszenie do przodu jako parametr osi x i rozproszenie boczne jako parametr osi y. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy oś nowego wykresu punktowego w obszarze roboczym i przedstaw punkt punktowy do przodu i punktowy do przodu w formie logarytmicznej.

Wybierz zakładkę akwizycji i znajdź panel parametrów akwizycji. Włącz wszystkie sygnały w podmenu parametrów włączających. Wybierz forward scatter jako parametr wyzwalający i ustaw próg 0,01.

Dostosuj napięcie i wzmocnienie rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego na poziomie 250 i 0,6, aby upewnić się, że zdarzenia na wykresie rozproszenia do przodu i bocznego wykresu punktowego oraz populacji są oddzielone. Rozcieńczyć fluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe na zawiesiny o długości 100, 200 i 300 nanometrów, dodając jeden mikrolitr mikrosfer do jednego mililitra podwójnie destylowanej wody. Następnie kolejno załaduj zawiesinę mikrosfery.

Wybierz Start w menu pobierania Summit Software, aby nagrać 20 000 zdarzeń, a następnie kliknij Zatrzymaj po nagraniu zdarzeń. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy z przodu i z boku z kropką, aby utworzyć prostokąty i przeciągnąć, aby zmienić rozmiar. Zmień położenie obszarów szumu elektronicznego i populacji mikrosfery 100 nanometrów, klikając regiony prawym przyciskiem myszy, aby zmienić ich nazwy odpowiednio na R7 i R4.

Powtórz kroki, aby obramować kolejno mikrosfery o długości 200 i 300 nanometrów prostokątami i zmienić ich nazwy odpowiednio na R5 i R6. Na koniec określ region sortowania od 50 do 200 nanometrów na podstawie szumu elektronicznego i położenia cząstek o długości 200 nanometrów, aby zdefiniować go jako R8. Edytuj decyzje dotyczące sortowania w panelu logiki sortowania i statystyk, klikając dwukrotnie puste pole lewego strumienia lub strumienia L1 i wybierając region o nazwie R8, aby utworzyć logikę sortowania. Wybierz tryb przerwania czystości i wybierz obwiednię kropli powyżej jednej kropli dla strumienia L1.

Załaduj 500 mikrolitrów próbki wcześniej przygotowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub mieszaniny EVs. Naciśnij przycisk Start w menu pobierania w programie Summit, aby pobrać dane, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj. Następnie naciśnij Start w menu sortowania, aby zebrać małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o wielkości od 50 do 200 nanometrów lub sEV do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Analiza cytometrii przepływowej mikrosfer polistyrenowych o standardowych rozmiarach w celu zlokalizowania zakresu wielkości od 50 do 200 nanometrów na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego ujawniła rozróżnialne sygnały cząstek. R4, R5 i R6 odnoszą się do pozycji cząstek odpowiednio 100, 200 i 300 nanometrów. R7 to szum elektroniczny jako granica wykrywalności dla cząstek o wielkości 50 nanometrów, a R8 oznacza zakres położenia cząstek o wielkości od 50 do 200 nanometrów.

Rozkład wielkości cząstek mieszaniny EVs pochodzącej z jednej komórki trzustki za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) mieścił się w szerokim zakresie od 40 do 400 nanometrów po ultrawirowaniu. Sortowanie metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu wyizolowania i oczyszczenia sEV o długości od 50 do 200 nanometrów w regionie R8. Jakość izolacji została zweryfikowana przez NTA i stwierdzono, że zakres wielkości cząstek sEV po sortowaniu wynosił od 50 do 200 nanometrów.

Obecność sEV była następnie obserwowana przez TEM, a izolowane sEV zawierały markery CD6, CD63 i CD81 za pomocą analizy Western Blot. Metoda ta pozwala na oddzielenie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i klasyfikację lub analizę protetyczną ekspresji genów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co otwiera wiele dalszych zastosowań badawczych.