Name: Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj optymalizację parametrów cytometrii przepływowej do izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskiwanie reprezentatywnych populacji sEV o rozmiarze 50-200 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Badań Naukowych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej Zhejiang (2020ZG29), Projekt Badań nad Podstawową Dobrocią Publiczną Prowincji Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), Projekt Departamentu Edukacji Prowincji Zhejiang (Y202147028) oraz Projekt Eksperymentalnej Technologii Wydziału Laboratoryjnego Uniwersytetu Zhejiang (SJS201712, SYB202130).

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę z pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Hodować ludzką komórkę raka trzustki, PANC-1, w kolbie hodowlanej o długości 75cm2 o gęstości 1 x 106 komórek/ml. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Subkulturuj komórki, gdy gęstość komórek osiągnie 75% -80% pod obserwacją mikroskopową. Usuń pożywkę i przepłucz 2x 3-5 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).</li>
	<li>Wyrzuć roztwór, dodaj 1-2 ml roztworu trypsyny-EDTA i pozwól komórkom oderwać się, aż staną się zaokrąglone i zawieszone w pożywce pod mikroskopem. Dodać świeżą pożywkę, aspirat i rozproszyć w kolbach hodowlanycho długości 75 cm2 z 15 ml pożywki hodowlanej. Stosować proporcje do uprawy 1:2 do 1:4 (zalecane). 
	UWAGA: Wszystkie operacje są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek.</li>
</ol>
2. Kolekcja pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zebrać supernatant komórkowy (90 ml) do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść sklarowany osad do nowych sterylnych probówek i odwirować kolejno przy 2 000 x g przez 20 minut, 10 000 x g przez 30 minut i 12 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 10 ml PBS, delikatnie pipetując. Odwirować przy 12 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu PBS w celu uzyskania mieszaniny EV.</li>
	<li>Wykonaj analizę śledzenia nanocząstek (NTA) w celu ilościowego określenia i wielkości mieszaniny EV. Wykonaj analizę NTA zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu i referencją21.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek
<ol>
	<li>Wykonaj standardową procedurę uruchamiania sortera przepływowego. Włącz urządzenie, naciskając przycisk uruchamiania. Kliknij przycisk Laser Power (Moc lasera) na panelu sterowania lasera. Naciśnij przycisk Change Tanks (Zmień zbiorniki) w podmenu inteligentnego samplera, aby zwiększyć ciśnienie w fluidics. 
	UWAGA: Przed uruchomieniem upewnij się, że zbiornik na odpady jest pusty, a zbiornik osłonowy jest pełny.</li>
	<li>Użyj ultradźwiękowo oczyszczonej dyszy strumieniowej o średnicy 50 μm i zainstaluj ją na zespole dyszy. Dostosuj ciśnienie do 80 psi dla płynu w osłonce i 80.3 psi dla przepływu próbki na konsoli ciśnieniowej.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start Sheath Flow, aby rozpocząć przepływ strumienia osłony. Kliknij przycisk bąbelkowy w podmenu inteligentnego samplera, aby automatycznie usunąć bąbelki przez 10 minut, a następnie wyłącz go. 
	UWAGA: W przypadku sortowania komórek, różne rozmiary dysz rozpylających powietrze wymagają różnych ciśnień płynu w osłonie, aby utrzymać stabilność przepływu cieczy. W tej metodzie zastosowano dyszę o średnicy 50 μm i tylko ciśnienie płynu w osłonie większe lub równe 80 psi mogło wytworzyć stabilne strumienie boczne. Różnica ciśnień między przepływem próbki a płynem w osłonie określa prędkość ładowania sortowania. W warunkach ustawienia metody (różnica ciśnień między przepływem próbki a płynem w osłonie wynosi 0,3-0,6 psi), przepływ cieczy był stosunkowo stabilny, a prędkość ładowania umożliwiła wzrost wydajności sortowania do 80% z 50% przy różnicy ciśnień mniejszej niż 0,3-0,6 psi.</li>
	<li>Wyrównaj strumień i określ plamkę lasera. Włącz oświetlenie komory oświetleniowej, aby view strumień nad otworkami. Dostosuj mikrometry góra-dół, lewo i prawo oraz przód i tył, aby wyśrodkować strumień na otworku i skupić strumień.</li>
	<li>Wybierz zakładkę Laser and Stream Intercept (Przechwytywanie lasera i strumienia). Naciśnij przycisk zielonej strzałki w sposób ciągły zgodnie z monitem, aby zakończyć proces kalibracji przecięcia lasera i wyrównania dyszy.</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do ekranu precyzyjnego wyrównywania lasera. Wybierz kanał 640-722/44 (H) jako parametr osi X i kanał 405-448/59 (H) jako parametr osi Y. Naciśnij selektor parametrów wyzwalania i wybierz parametr SSC lasera 488 nm. Otwórz wszystkie żaluzje laserowe. 
	UWAGA: Wybrane parametry osi X i Y zależą od konfiguracji lasera w systemie. Inne parametry są dozwolone, jeśli system nie jest wyposażony w laser 640 nm lub 405 nm. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wybierz lasery z największą separacją przestrzenną na pasku otworkowym (z wyłączeniem lasera 355 nm).</li>
	<li>Rozcieńczyć tęczowe cząstki fluorescencyjne, dodając jedną kroplę do 1 ml podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 106 kulek na ml. Otwórz drzwi komory na próbki i załaduj rurkę z przygotowanymi tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start Sample. Dostosuj mikrometry góra-dół, aby zoptymalizować intensywność fluorescencji, dzięki czemu każdy sygnał jest tak intensywny, jak to tylko możliwe. Naciśnij przycisk Rozpocznij kontrolę jakości (QC) na panelu sterowania na ekranie dotykowym, aby automatycznie przeprowadzić kontrolę jakości.</li>
	<li>Wykonaj opóźnienie upuszczenia. Uzyskaj dostęp do ekranu konfiguracji sortowania i wybierz przycisk opóźnienia upuszczania. Naciśnij przycisk inicjalizacji IntelliSort. Przyrząd automatycznie dostosowuje częstotliwość i amplitudę oscylacji kropli, aby uzyskać opóźnienie opadania 25 ± 5 i być w stanie wyraźnie zwizualizować punkt zerwania kropli. Naciśnij przycisk Utrzymaj.</li>
	<li>Wybierz rurę jako typ wyjścia sortowania. Umieść uchwyt na probówki o pojemności 15 ml w komorze sortowania. Włącz napięcie płytki i ustaw napięcie płytki na około 4000 V.</li>
	<li>Włącz wzorzec testowy, wybierając przycisk Stream Setup (Ustawienia strumienia). Wyreguluj suwak fazy ładowania i suwak odchylenia, aby upewnić się, że obraz strumienia jest wyrównany z rurką zbiorczą. Wybierz przycisk Znacznik wyboru.</li>
	<li>Zaloguj się do stacji roboczej Summit na komputerze. Utwórz nowy protokół z menu głównego Plik. Utwórz wykres punktowy, wybierając kartę Histogram w panelu sterowania oprogramowania Summit.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy osie nowego wykresu punktowego w obszarze roboczym i wybierz FSC jako parametr osi X i SSC jako parametr osi Y. Przedstaw FSC i SSC w formie logarytmicznej.</li>
	<li>Wybierz kartę Akwizycja i znajdź panel parametrów pozyskiwania. Włącz wszystkie sygnały w podmenu parametrów włączających. Wybierz FSC jako parametr wyzwalający i ustaw próg 0,01. Dostosuj napięcie i wzmocnienie FSC i SSC na poziomie 250 i 0,6, aby upewnić się, że zdarzenia na wykresie FSC i SSC oraz populacje są oddzielone. 
	UWAGA: Ustawienie progu jest równoznaczne z ustawieniem wielkości cząstek, które można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej. Im większy jest próg, tym większe będą wykryte cząstki, a małe cząstki zostaną odcięte przez próg i nie będzie można ich wykryć. W tej metodzie próg jest ustawiony na 0,01, dzięki czemu można wykryć wszystkie cząstki większe niż szum elektronowy.</li>
</ol>
4. Izolacja sEV
<ol>
	<li>Rozcieńczyć fluorescencyjne mikrosfery polistyrenu do zawiesin o długości 100 nm, 200 nm i 300 nm. Dodaj 1 μl mikrosfer do 1 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Kolejno ładuj zawieszenie mikrosfery. Wybierz Start w menu pobierania oprogramowania summit i zarejestruj 20 000 zdarzeń. 
	UWAGA: Liczba zdarzeń jest opcjonalna. Zaleca się nie mniej niż 5 000 zdarzeń, aby spełnić wymagania dotyczące istotności statystycznej.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy FSC vs. SSC, aby utworzyć prostokąty i przeciągnij, aby zmienić rozmiar i położenie obszarów szumu elektronicznego i populacji mikrosfer 100 nm. Kliknij regiony prawym przyciskiem myszy, aby zmienić ich nazwy odpowiednio na R7 i R4. Powtórz powyższe kroki, aby obramować kolejno mikrosfery 200 nm i 300 nm prostokątami i zmienić ich nazwy odpowiednio na R5 i R6.</li>
	<li>Na koniec określ obszar sortowania 50-200 nm na podstawie szumu elektronicznego i pozycji cząstek 200 nm zdefiniowanych jako R8. 
	UWAGA: Dolna granica wykrywalności wynosząca 50 nm znajduje się tuż nad szumem elektronicznym sortera z komórką przepływową. Obszar między hałasem a populacją mikrosfery 200 nm można zatem określić jako obszar między 50-200 nm.</li>
	<li>Edytowanie decyzji sortowania w panelu logiki sortowania i statystyk. Kliknij dwukrotnie puste pole lewego strumienia (L1). Wybierz region o nazwie R8, aby utworzyć logikę sortowania. Wybierz tryb czystości Przerwij i wybierz obwiednię kropli o długości 1 kropli dla strumienia L1.</li>
	<li>Załadować 500 μl próbki mieszaniny EVs z kroku 2.3. Naciśnij przycisk Start w menu akwizycji w Summit, aby uzyskać dane, a następnie naciśnij Start w menu sortowania, aby zebrać 50-200 nm sEV do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Sterylne środowisko jest konieczne, aby zminimalizować zanieczyszczenie podczas każdego zabiegu.</li>
	<li>Obserwuj obecność sEV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i sprawdź wielkość cząstek sEV za pomocą NTA. Wykonaj analizę western blot (WB), aby dodatkowo potwierdzić ekspresję markerów CD9, CD63 i CD8118.</li>
</ol>

<ol><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li>
<li>Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533(2015).</li>
<li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li>
<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+vesicles%2C+their+origin%2C+composition%2C+purpose%2C+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111(2014).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999(2015).</li>
<li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li>
<li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity%2C+yield%2C+viability%2C+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li>
<li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten przedstawia zoptymalizowaną metodę izolowania i oczyszczania sEV o określonej wielkości cząstek 50-200 nm przy użyciu sortera przepływowego, który został zatwierdzony przez NTA. Metoda rozwiązała problem wąskiego gardła polegający na otrzymywaniu sEV o jednolitej wielkości cząstek i wysokiej czystości, unikając interferencji powodowanej przez niepowiązane cząsteczki biologiczne owinięte w duże EV22. Szybkie, wysokoprzepustowe analizy są możliwe dzięki cytometrii przepływowej, która mo...

Komórka uwalnia pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o różnych rozmiarach, które skutkują cząsteczkami sygnałowymi i inkluzjami błonowymi, które są ważne dla komunikacji międzykomórkowej1. EV o różnych rozmiarach odgrywają również różne role biologiczne, przy czym sEV o długości fali 50-200 nm jest w stanie precyzyjnie rozprowadzać RNA, DNA i białka do właściwej lokalizacji zewnątrzkomórkowej. sEV pomaga również określić mechanizmy ich wydzielania, obejmujące nie tylko regulację normalnych procesów fizjologicznych, takich jak nadzór immunologiczny, utrzymanie komórek macierzystych, krzepnięcie krwi i naprawa tkanek, ale także patologię leżącą u podstaw kilku chorób, takich jak progresja guza i przerzuty2,3. Skuteczna izolacja i analiza sEV mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji biomarkerów i projektowania przyszłych interwencji lekowych.
Dzięki ciągłym badaniom nad klinicznym zastosowaniem sEV, metody izolacji sEV stawiają wyższe wymagania. Ze względu na niejednorodność sEV pod względem rozmiaru, źródła i zawartości, a także ich podobieństwo do innych EV pod względem właściwości fizykochemicznych i biochemicznych, nie ma standardowej metody izolacji sEV4,5. Obecnie ultrawirowanie, chromatografia wykluczania wielkości (SEC), wytrącanie polimerów i wychwytywanie powinowactwa immunologicznego są najczęstszymi metodami izolacji sEV6. Ultrawirowanie jest nadal złotym standardem izolacji sEV w badaniach, mimo że jest czasochłonne, co skutkuje niską czystością przy szerokim rozkładzie wielkości 40-500 nm i znacznymi uszkodzeniami mechanicznymi sEV po długotrwałym wirowaniu7,8,9. Wytrącanie polimerów, które zwykle wykorzystuje glikol polietylenowy (PEG), cierpi z powodu niedopuszczalnej czystości dla późniejszej analizy funkcjonalnej z jednoczesnym wytrącaniem zewnątrzkomórkowych agregatów białkowych i zanieczyszczeniem polimerów10,11. Metody oparte na powinowactwie immunologicznym wymagają kosztownych przeciwciał o różnej swoistości, a także mają problemy z niską objętością przetwarzania i wydajnością12,13,14. Wielkość cząstek jest jednym z głównych wskaźników oceny czystości izolowanego sEV. Chociaż czystość sEV pozostaje nieosiągalnym celem, SEC usuwa znaczną ilość składników średnich, a cząstki sEV ekstrahowane metodą SEC mieszczą się głównie w zakresie 50-200 nm15. Istniejące techniki mają kilka wad, w tym między innymi są czasochłonne, mają niską czystość, niską wydajność, słabą odtwarzalność, niską przepustowość próbek i potencjalne uszkodzenie sEV, co czyni je niekompatybilnymi z wykorzystaniem klinicznym16. W związku z tym szybka, niedroga i określona pod względem wielkości metoda izolacji sEV mająca zastosowanie do różnych płynów biologicznych jest niezbędną potrzebą w wielu sytuacjach badawczych i klinicznych.
W cytometrii przepływowej pojedyncze cząstki są analizowane w sposób wieloparametryczny, a podzbiory są sortowane17. Ze względu na niejednorodność EV, idealny byłby pomiar cytometryczny przepływu pojedynczych cząstek, który został wykorzystany do zbadania EV zgodnie z paradygmatami analizy komórek, z dyspersją światła i znacznikami fluorescencji używanymi do identyfikacji cech związanych z fizjologią i składników białkowych18,19,20. Niemniej jednak konwencjonalna cytometria przepływowa jest wyzwaniem ze względu na mały rozmiar sEV i niską obfitość biomarkerów powierzchniowych. Czułość cytometrii przepływowej można poprawić, optymalizując parametry detekcji w celu rozróżnienia szumu tła i sEV niezależnie od użycia rozpraszania do przodu (FSC), rozpraszania bocznego (SSC) lub parametru wyzwalającego próg fluorescencji19.
Zgodnie z obecnym protokołem, ustawienia sortowania cytometrycznego o wysokiej rozdzielczości zostały zoptymalizowane przy użyciu standardowych koralików fluorescencyjnych. Dobierając odpowiedni rozmiar dyszy, ciśnienie płynu w osłonie, parametr wyzwalania progu oraz napięcia kontrolujące natężenie światła rozproszonego, byliśmy w stanie wyizolować określony podzbiór sEV ze złożonej mieszaniny.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430641</tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowana pożywka orła</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>SUER</td><td>SUER050QY</td><td></td></tr><tr><td>Przepływowy sortownik komórek</td><td>Beckman Coulter</td><td>Moflo Astrios EQ</td><td></td></tr><tr><td>Komórka ludzkiego raka trzustki, PANC-1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>PANC-1 Komórki zostały przekazane przez profesora Weijun Yanga, College of Life Sciences, Zhejiang University</td></tr><tr><td>Laserowa wielkość cząstek i potencjał zeta Analizator&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Gibco</td><td>C20012500BT</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Beckman Coulter</td><td>6602336</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>JEOL</td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Gibco</td><td>1713949</td><td></td></tr><tr><td>Ultra tęczowe cząstki fluorescencyjne</td><td>Beckman Coulter</td><td>B28479</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima-L80XP</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka z wirnikiem</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW32TI</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) mogą być uwalniane ze wszystkich typów komórek i przenoszą białka, DNA i RNA. Cząsteczki sygnałowe służą jako wskaźniki fizjologicznego i patologicznego stanu komórki. Nie ma jednak standardowej metody izolacji sEV, która uniemożliwia dalszą identyfikację biomarkerów i badania interwencyjne leków. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji i oczyszczania sEV o długości fali 50-200 nm za pomocą sortera z komórkami przepływowymi. W tym celu wybrano dyszę 50 μm i ciśnienie płynu w osłonie 80 psi, aby uzyskać dobrą szybkość sortowania i stabilny strumień boczny. Do zlokalizowania populacji cząstek o długości 100, 200 i 300 nm użyto mikrosfer polistyrenowych o standardowych rozmiarach. Dzięki dodatkowej optymalizacji progu wyzwalania napięcia, wzmocnienia i rozproszenia do przodu (FSC), sygnał sEV może być oddzielony od szumu tła. Optymalizacje te zapewniają panel krytycznych ustawień sortowania, który umożliwia uzyskanie reprezentatywnej populacji sEV przy użyciu FSC w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC). Metoda izolacji oparta na cytometrii przepływowej nie tylko pozwala na analizę o wysokiej przepustowości, ale także pozwala na synchroniczną klasyfikację lub analizę proteomu sEV w oparciu o ekspresję biomarkerów, otwierając wiele dalszych zastosowań badawczych.

Schemat blokowy protokołu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1. W tej metodzie jako standardy referencyjne do rozkładu wielkości cząstek wykorzystano polistyrenowe mikrosfery o standardowych rozmiarach. Przy określonych parametrach aparatury sygnał cząstek można było wyraźnie odróżnić od szumu tła na wykresie FSC vs. SSC z zastosowaniem skali logarytmicznej. Strategie bramkowania przedstawiono na Rysunku 2. R4, R5 i R6 odnoszą się odpowiednio do pozycji ...

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Protokół ten zapewnia szybką i specyficzną dla wielkości metodę roztworu dla małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację parametrów sortowania cytometrii przepływowej. Optymalizacje te zapewniają panel krytycznych ustawień sortowania, który umożliwia uzyskanie reprezentatywnych populacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu tylko rozproszenia do przodu w porównaniu z rozproszeniem rozmiaru. Rozpocznij od wykonania standardowej procedury uruchamiania sortera przepływowego.Włącz urządzenie, naciskając przycisk uruchamiania, a następnie kliknij przycisk zasilania lasera na panelu sterowania lasera. Naciśnij przycisk zmiany zbiorników w podmenu Smart Sampler, aby zwiększyć ciśnienie w płynach. Użyj ultradźwiękowo oczyszczonej dyszy strumieniowej i powietrznej o średnicy 50 mikrometrów i zainstaluj ją w zespole dyszy.Dostosuj ciśnienie do 80 SI dla płynu w osłonie i 80,3 SI dla przepływu próbki na konsoli ciśnieniowej. Naciśnij przycisk rozpoczęcia przepływu osłony, aby rozpocząć przepływ strumienia osłony. Kliknij przycisk bąbelka w podmenu Smart Sampler, aby automatycznie usunąć bąbelki na 10 minut, a następnie wyłącz go.Aby wyrównać strumień i określić plamkę lasera, włącz światło komory oświetleniowej, aby view strumień nad otworami. Wyreguluj mikrometry w górę iw dół, w lewo i w prawo oraz z przodu i z tyłu, aby wyśrodkować strumień na otworku i skupić strumień. Otwórz wszystkie migawki lasera, wybierz zakładkę przechwytywania lasera i strumienia, a następnie naciśnij przycisk zielonej strzałki w sposób ciągły zgodnie z monitem, aby zakończyć proces kalibracji przechwytywania lasera i wyrównania dyszy.Uzyskaj dostęp do ekranu precyzyjnego wyrównywania lasera. Jako parametr osi x należy wybrać laser 640 nm i kanał pasmowoprzepustowy 772 bar 44 jako parametr osi x oraz laser 405 nm i kanał pasmowoprzepustowy 448 bar 59 jako parametr osi y. Naciśnij selektor parametrów wyzwalania i wybierz parametr rozproszenia do przodu lasera o długości 488 nanometrów.Następnie rozcieńczyć tęczowe cząstki fluorescencyjne, dodając jedną kroplę do jednego mililitra podwójnie destylowanej wody do końcowego stężenia od 10 do sześciu kulek na mililitr. Otwórz drzwi komory na próbki i załaduj probówkę z przygotowanymi tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi. Naciśnij przycisk start sample i dostosuj mikrometry w górę iw dół, aby zoptymalizować intensywność fluorescencji, aby każdy sygnał był tak intensywny, jak to tylko możliwe.Naciśnij przycisk rozpoczęcia kontroli jakości lub kontroli jakości na panelu sterowania na ekranie dotykowym, aby automatycznie przeprowadzić kontrolę jakości. Następnie naciśnij przycisk inicjalizacji IntelliSort. Przyrząd automatycznie dostosowuje częstotliwość i amplitudę oscylacji kropli, aby uzyskać opóźnienie kropli około 25 i być w stanie wyraźnie zwizualizować punkt zerwania kropli.Następnie naciśnij przycisk opóźnienia upuszczania i przycisk podtrzymania. Wybierz rurę jako typ wyjścia sortowania. Umieść 15-mililitrowy uchwyt na probówki w komorze sortowania.Włącz napięcie płytki i ustaw napięcie płytki na około 4 000 woltów. Następnie włącz wzorzec testowy, wybierając przycisk konfiguracji strumienia. Wyreguluj suwak fazy ładowania i suwak odchylenia, aby upewnić się, że obraz strumienia jest zgodny z rurką zbiorczą.Następnie wybierz przycisk znacznika wyboru. Zaloguj się do stacji roboczej Summit na komputerze. Utwórz nowy protokół z menu głównego pliku.Następnie utwórz wykres punktowy, wybierając zakładkę histogramu w panelu sterowania Summit Software. Wybierz rozproszenie do przodu jako parametr osi x i rozproszenie boczne jako parametr osi y. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy oś nowego wykresu punktowego w obszarze roboczym i przedstaw punkt punktowy do przodu i punktowy do przodu w formie logarytmicznej.Wybierz zakładkę akwizycji i znajdź panel parametrów akwizycji. Włącz wszystkie sygnały w podmenu parametrów włączających. Wybierz forward scatter jako parametr wyzwalający i ustaw próg 0,01.Dostosuj napięcie i wzmocnienie rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego na poziomie 250 i 0,6, aby upewnić się, że zdarzenia na wykresie rozproszenia do przodu i bocznego wykresu punktowego oraz populacji są oddzielone. Rozcieńczyć fluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe na zawiesiny o długości 100, 200 i 300 nanometrów, dodając jeden mikrolitr mikrosfer do jednego mililitra podwójnie destylowanej wody. Następnie kolejno załaduj zawiesinę mikrosfery.Wybierz Start w menu pobierania Summit Software, aby nagrać 20 000 zdarzeń, a następnie kliknij Zatrzymaj po nagraniu zdarzeń. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy z przodu i z boku z kropką, aby utworzyć prostokąty i przeciągnąć, aby zmienić rozmiar. Zmień położenie obszarów szumu elektronicznego i populacji mikrosfery 100 nanometrów, klikając regiony prawym przyciskiem myszy, aby zmienić ich nazwy odpowiednio na R7 i R4.Powtórz kroki, aby obramować kolejno mikrosfery o długości 200 i 300 nanometrów prostokątami i zmienić ich nazwy odpowiednio na R5 i R6. Na koniec określ region sortowania od 50 do 200 nanometrów na podstawie szumu elektronicznego i położenia cząstek o długości 200 nanometrów, aby zdefiniować go jako R8. Edytuj decyzje dotyczące sortowania w panelu logiki sortowania i statystyk, klikając dwukrotnie puste pole lewego strumienia lub strumienia L1 i wybierając region o nazwie R8, aby utworzyć logikę sortowania. Wybierz tryb przerwania czystości i wybierz obwiednię kropli powyżej jednej kropli dla strumienia L1.Załaduj 500 mikrolitrów próbki wcześniej przygotowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub mieszaniny EVs. Naciśnij przycisk Start w menu pobierania w programie Summit, aby pobrać dane, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj. Następnie naciśnij Start w menu sortowania, aby zebrać małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o wielkości od 50 do 200 nanometrów lub sEV do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Analiza cytometrii przepływowej mikrosfer polistyrenowych o standardowych rozmiarach w celu zlokalizowania zakresu wielkości od 50 do 200 nanometrów na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego ujawniła rozróżnialne sygnały cząstek. R4, R5 i R6 odnoszą się do pozycji cząstek odpowiednio 100, 200 i 300 nanometrów. R7 to szum elektroniczny jako granica wykrywalności dla cząstek o wielkości 50 nanometrów, a R8 oznacza zakres położenia cząstek o wielkości od 50 do 200 nanometrów.Rozkład wielkości cząstek mieszaniny EVs pochodzącej z jednej komórki trzustki za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) mieścił się w szerokim zakresie od 40 do 400 nanometrów po ultrawirowaniu. Sortowanie metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu wyizolowania i oczyszczenia sEV o długości od 50 do 200 nanometrów w regionie R8. Jakość izolacji została zweryfikowana przez NTA i stwierdzono, że zakres wielkości cząstek sEV po sortowaniu wynosił od 50 do 200 nanometrów.Obecność sEV była następnie obserwowana przez TEM, a izolowane sEV zawierały markery CD6, CD63 i CD81 za pomocą analizy Western Blot. Metoda ta pozwala na oddzielenie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i klasyfikację lub analizę protetyczną ekspresji genów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co otwiera wiele dalszych zastosowań badawczych.

optimization-flow-cytometric-sorting-parameters-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

W tym filmie opisujemy protokół opartego na cytometrii przepływowej sortowania naiwnych komórek B, komórek B pamięci i subpopulacji komórek plazmatycznych plazmablastów z ludzkich komórek B krwi obwodowej. Różne subpopulacje komórek B można rozróżnić na podstawie wiązania przeciwciał na bazie fluoroforu z receptorami CD19, CD27 i CD38 ulegającymi ekspresji na powierzchni komórek B, a następnie sortowania komórek.

Sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej dla różnych populacji krążących komórek B

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Poznaj optymalizację parametrów cytometrii przepływowej do izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskiwanie reprezentatywnych populacji sEV o rozmiarze 50-200 nm.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów