Name: Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę multipleksowej analizy modyfikacji histonów w pojedynczych komórkach. Protokół ten umożliwia wysokoczułą i ilościową charakterystykę heterogeniczności chromatyny w komórkach Hep G2/C3A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Bernice Morrow i dr Jidong Shanowi z Molecular Cytogenetics Core w Albert Einstein College of Medicine za utrzymanie instrumentu cellenONE.

<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

J.C. jest pracownikiem SCIENION US Inc.

Możliwość pomiaru modyfikacji histonów po translacji na poziomie pojedynczych komórek stanowi kluczowy krok w kierunku zrozumienia prawdziwej heterogeniczności regulacji chromatyny. Tradycyjne metody masowe dostarczyły bezcennych informacji na temat średniego rozkładu hPTM w tkankach, a jednocześnie maskują zmienność między komórkami, która jest coraz częściej uznawana za biologicznie istotną5. Podejścia proteomiczne jednokomórkowe pozwalają nam teraz rozwinąć tę ukrytą warstwę złożoności, ujawnia...

Histony są białkowymi składnikami nukleosomów, powtarzalnymi jednostkami chromatyny. Ich ogony N-końcowe są bogate w reszty lizyny i argininy i są silnie regulowane przez modyfikacje posttranslacyjne (PTM), takie jak acetylacja, metylacja i fosforylacja. Te modyfikacje wpływają na dostępność DNA, a tym samym kontrolują procesy takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa. Zmienione wzorce histonowych PTM są silnie powiązane ze stanami chorobowymi, od nowotworów po neurodegenerację i starzeniesię 1,2. Z tego powodu analiza histonowych PTM stała się bardzo interesująca w badaniach epigenetycznych i proteomicznych. Spektrometria mas (MS) zapewnia analizę modyfikacji histonów specyficzną dla miejsca i ilościową, jednak histony stanowią unikalne wyzwania analityczne. Ich skład aminokwasowy, liczne miejsca modyfikacji oraz złożone wzorce kombinatoryczne sprawiają, że są trudniejsze do analizy niż typowe białka. Ustalone protokoły opierają się na chemicznej deriwatyzacji w celu blokowania reszt lizyny przed trawieniem wody, co poprawia odzyskiwanie peptydów i wydajność chromatograficzną3. Chociaż skuteczne w analizach masowych, te wieloetapowe protokoły derytacyjne mogą powodować straty problematyczne dla wejść pojedynczych komórek. Analiza pojedynczych komórek staje się coraz ważniejsza, ponieważ systemy biologiczne są z natury heterogeniczne. Histone objęty analizuje przeciętne sygnały w wielu komórkach i dlatego nie rejestruje tej zmienności. Subpopulacje komórek mogą różnić się stanem chromatyny, a te różnice mogą napędzać rozwój, przeprogramowanie komórek lub odpowiedzi na leki 4,5.
Przedstawiamy tutaj zautomatyzowaną metodę przygotowania próbki do multipleksowanej analizy histonów pojedynczych komórek PTM (sc-hPTM2). Metoda ta opiera się na systemie CellenONE, który umożliwia precyzyjne podawanie pojedynczych komórek i odczynników na skalę nanolitrową w sposób zautomatyzowany. Metoda ta jest wariacją na temat metody nanoproteomicznej próbki (nPOP), która po raz pierwszy wprowadziła stosowanie preparatu kropli na szkiełkuszklanym 6. Platforma nPOP posiada zaawansowaną zautomatyzowaną proteomikę pojedynczych komórek, jednak jej standardowy protokół trawienia tryptycznego jest suboptymalny dla histonów ze względu na ich wysoką zawartość lizyny i rozległą gęstość modyfikacji. W tym miejscu dostosowaliśmy system CellenONE do włączenia złotego standardu derywacji histonów z bezwodkiem propionowym oraz wprowadziliśmy znakowanie izotopowe, umożliwiające dokładną i kompleksową ilościową ilościową identyfikację modyfikacji histonów po translacji z rozdzielczością pojedynczych komórek. Konkretnie upraszczamy protokół, stosując proteazę ArgC Ultra do trawienia białek. W przeciwieństwie do trypsyny, ArgC rozszczepia jedynie reszty argininy i nie wymaga blokowania lizyny. Eliminuje to potrzebę stosowania strategii derywacji dwuetapowej, usprawniając protokół. Ponadto metoda wykorzystuje dwu-pleksowy schemat znakowania izotopowego z użyciem bezwodnika propionowego i bezwodnika d10 propionowego, co pozwala na jednoczesną analizę dwóch komórek 7,3. Po trawieniu i oznakowaniu próbki pojedynczych komórek są pozyskiwane i analizowane za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS)/MS, korzystając z pozyskiwania niezależnego od danych (DIA). W naszych rękach metoda ta wykazuje wzrost zarówno czułości, jak i powtarzalności w zakresie ilościowania PTM histonów w porównaniu do poprzedniej wersji tej metody8.
Aby zademonstrować tę metodę, sprofilowaliśmy dynamikę PTM histonów pojedynczych komórek histonowych w sferoidach pochodzących z komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2/C3A. Lecząc te sferoidy za pomocą miąslanu sodu, dobrze scharakteryzowanego inhibitora deacetylazy histonowej, który zwiększa acetylację histonów i stanowi punkt odniesienia do badania regulacji chromatyny 9,10. Porównując kontrolne i masaczniane sferoidy z masacznianem sodu w rozdzielczości pojedynczej komórki, wykazujemy dowód zasady reprezentatywnych wyników, podkreślając potencjał szerszych zastosowań w biologii chromatyny i epigenetyce nowotworów. W odniesieniu do protokołu odwołujemy się do wcześniejszej publikacji opisującej wzrost i leczenie 3D sferoidów10, pozyskiwanie peptydów histonowych w spektrometrii masowej11 oraz analizę danych z użyciem oprogramowania EpiProfile12.

<table><tbody><tr><td>Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mikro; Końcówki pipetu o średnicy L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; Końcówki pipetu o średnicy L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka PCR Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy z 96 dołkami</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa Optima LC-MS/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Folie płytek PCR z kleju</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Etykiety, roztwór zapasowy do produkcji luzem</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, klasa spektrometrii masowej</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Woda do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Numer katalogowy jest dołączony do wyceny</td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Etykiety roztwór zapasowy</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy 98%&ndash; 100% dla LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hydroksylaminy 50&nbsp;wt. % w H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>detergent n-Dodecyl-beta-maltozyd (DDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieistotne</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr mas Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór wodny EM klasy</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (powłoka typu 2)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Numer katalogowy jest dołączony do wyceny</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 10x, pH 7,4, wolna od RNazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Piruśliwy dimetylosulfoksyd (DMSO), klasa LC-MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet pipetowy</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik propionowy &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik propionowy-d10 &ge; 98% atomów D i ge; 99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka chłodzona</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka SciCHIP H1 pokryte powłoką szklaną</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Numer katalogowy jest dołączony do wyceny</td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy SpeedVac (płyty 96-odwiertowe)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterylny kaptur</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Dead Cell Stain, do cytometrii przepływowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express (1X), bez fenolu czerwonego</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Modyfikacje posttranslacyjne histonów (hPTM) są centralnymi regulatorami organizacji chromatyny i ekspresji genów. Ich zaburzenia regulacji są związane z rozwojem, rakiem i starzeniem się. Chociaż spektrometria mas jest metodą wyboru do badania hPTM, większość protokołów jest przeznaczona dla próbek masowych i nie jest w stanie rozwiązywać zmienności między komórkami. Rozszerzenie analizy PTM histonów do poziomu pojedynczych komórek jest więc niezbędne, ale technicznie wymagające, ponieważ histony są niską ilością, bogate w lizynę i silnie modyfikowane.
Tutaj opisujemy zautomatyzowany workflow proteomiki jednokomórkowej do analizy PTM histonów z wykorzystaniem nano-cieczy obsługiwającej cieczy. System umożliwia przetwarzanie pojedynczych komórek na skalę nanolitrową przy minimalnym obsłudze i wysokiej powtarzalności. Workflow obejmuje trawienie za pomocą proteazy ArgC Ultra, która rozszczepia reszty argininy i eliminuje konieczność wykonywania etapów derytacji blokujących lizynę, typowych dla proteomiki histonów. Aby umożliwić ilościowe porównanie między stanami, stosujemy strategię znakowania dwu-plexowego z bezwodkiem propionowym i jego deuterowanym odpowiednikiem, anhydrydem propionowym-d10. To połączenie automatycznego przygotowania próbki, izotopowego multipleksowania oraz trawienia ArgC Ultra skutkuje uprościonym i czułym protokołem analizy PTM histonów pojedynczych komórek.
Metoda pozwala badać heterogeniczność chromatyny oraz wpływ perturbacji epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby zademonstrować ten proces, wygenerowaliśmy sferoidy z komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2/C3A i potraktowaliśmy je mięczanianem sodu, inhibitorem deacetylazy histonowej indukującym hiperacetylację.

Aby zademonstrować zastosowanie naszego workflow proteomiki pojedynczej komórki histonowej w naszym systemie, przeanalizowaliśmy sferoidy komórek HepG2/C3A traktowanych 5 mM butyrianinem sodu przez 24 godziny. Po pozyskaniu LC-MS/MS surowe dane były przetwarzane za pomocą EpiProfile zarówno dla znakowania lekkiego (bezwodnik propionowy), jak i ciężkiego (bezwodnik propionowy-d10), uzyskując znormalizowane dane reprezentujące obfitość peptydów i znaków histonowych. Pakiet QuantQC R został następnie użyty do odwzorowania m...

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

Rozwijamy proteomikę pojedynczych komórek dzięki zautomatyzowanej metodzie multipleksowej do badania globalnej heterogeniczności chromatyny w posttranslacyjnych modyfikacjach. To, co utrudnia ten protokół, to przygotowanie proteomiczne na skalę pikogramową, znakowanie multipleksowe oraz rozdzielanie złożonych kombinatorycznych zmodyfikowanych peptydów histonowych. Na początek należy odtworzyć komórki raka Hep G2/C3A w końcowym stężeniu 200 do 500 komórek na mikrolitr w lodowatym PBS.Ustaw szerokość impulsu i napięcie napędu każdej dyszy na wartości podane przez producenta. Aby uzyskać maksymalną efektywność odbioru, upewnij się, że przesunięcie Z między dwoma dyszami różni się o mniej niż 50 mikrometrów. Zidentyfikuj optymalną pozycję styku dla każdej dyszy i porównaj odczyty wysokości Z w zakładce ustawień dyszy.W przypadku schematu multipleksowania tuplex załaduj pojedynczy zamek na uchwyt zamka w osłonie, a następnie przenosi go na instrument. Używając pipety, zaszczep 150 mikrolitrów DMSO klasy LCMS do nowej rurki PCR. Umieść go w pozycji drugiej na stanowisku myjniczym z pokrywką rury skierowaną w stronę drzwi przyrządu.Rozpocznij bieg DMSO. Uzyskaj stabilny drop po zasysaniu DMSO. Zwróć uwagę na zmianę przezroczystości PDC.Może być konieczne zwiększenie napięcia. Sprawdź stabilność, wykonując pomiar głośności dropów. Wykonaj konfigurację kreatora kamery na głowie, aby wyrównać kamerę.Wydanie DMSO i pozwól instrumentowi na automatyczne płukanie dysz oraz rejestrowanie obrazów na wszystkich slajdach dla kontroli jakości. Przejrzyj te obrazy, aby zweryfikować jednolitą kroplę DMSO na każdym slajdzie oraz sprawdzić, czy nie ma brakujących lub nie trafiających do celu. Po aspiracji zawiesiny komórki otwórz komórkę w jednym module, wykonaj przechwyt tła, a następnie uruchom procedurę mapowania, aby zdefiniować strefę wyrzutu.Przeprowadź analizę, a następnie przeprowadź cząstki, aby wybrać komórki na podstawie rozmiaru i wydłużenia. Teraz przygotuj świeżą mieszankę do trawienia w wodzie LCMS. Odgazuj roztwór pompą próżniową przez 10 minut na lodzie.Po wylaniu mieszanki trawiennej na preparaty pozwól instrumentowi automatycznie przepłukać dysze i zrobić zdjęcia każdej preparatu. Przejrzyj obrazy, aby upewnić się, że każda kropla otrzymuje mieszankę trawienną w sposób równomierny. Inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez całą noc, aby przeprowadzić trawienie.Po rozpoczęciu parowania i trawienia przez noc obejrzyj obrazy. Jeśli krople są wystarczająco suche, zatrzymaj bieg. Jeśli nie, kliknij kontynuuj i susz przez kolejne pięć minut.Do etykietowania najpierw przygotuj roztwory do wielowarstwowej derywityzacji histonów. Po wydawaniu pozwól instrumentowi na automatyczne przepłukanie dysz i wykonaj zdjęcia każdego slajdu. Przejrzyj zdjęcia, aby potwierdzić równomierne rozmieszczenie i prawidłowe rozmieszczenie kropelek na wszystkich slajdach.Po zakończeniu inkubacji podawaj roztwór hydroksylaminy do hartowania. Aby pobrać próbkę, wybierz run w głównej karcie, a następnie rozpocznij run w zakładce run. Po zakończeniu odbioru przejrzyj zdjęcia, aby sprawdzić, czy nie ma błędów.Po zakończeniu przetwornika zdejmij pokrywę z płytki przetwornika. Następnie suszą próbki w niskim temperaturze w koncentratorze próżniowym. Do pozyskiwania danych należy zaprogramować metodę wysokowydajnej chromatografii cieczowej.Ustaw eksperyment MS 2 tak, aby zawierał okna izolacji z przeładowaniem masy 50, dysocjacją kolizyjną o wysokiej energii 27% i automatycznym celem kontroli wzmocnienia na 1000%. Przykryj płytę gumową matą uszczelniającą i umieść ją wewnątrz automatycznego próbornika. Po uzyskaniu surowych plików krótko sprawdź chromatogram, a następnie uruchom surowe dane w EpiProfile wersji 2.1. Przejrzyj tabelę wyjściową znormalizowanych obserwacji histonów PTM i wykorzystaj ją do analiz dalszych.Pierwsze 20 peptydoform histonowych H3 zostało zidentyfikowanych ilościowo, wykazując ich względne występowania w warunkach kontrolnych i butyranu sodu. Zarówno acetylacja H3 K9, jak i acetylacja H3 K 14 wykazały większą względną obfitość po leczeniu butyranem sodu. Podczas gdy acetylacja K14 przez H3 K9 wydawała się jeszcze bardziej wzbogacona w leczonych komórkach.Całkowity poziom acetylacji wzrósł po leczeniu maślanu sodu u komórek objętych zabiegiem, wykazując szerszy rozkład błędu w porównaniu z grupami kontrolnymi, odzwierciedlając wyższą heterogeniczność wychwyconą na poziomie pojedynczych komórek. Ilościowe określenie pojedynczych i współwystępujących modyfikacji histonów wykazało, że stany acetylacji kombinatorycznej były najsilniej dotknięte przez butyran sodu. Szersze rozprzestrzenienie komórek poddanych butyranowi sodu wskazywało na zwiększoną heterogeniczność biologiczną pomiędzy pojedynczymi komórkami w obrębie sferoidów.Protokół ten niweluje lukę w badaniach epigenetycznych, umożliwiając naukowcom badanie stanów chromatyny w roztworze pojedynczych komórek. Ten workflow umożliwia przygotowanie próbek o wysokiej przepustowości, multipleksowanie próbek oraz bezstronną spektrometrię mas, co pozwala na uzyskanie zarówno czułych, jak i ilościowych danych epigenetycznych pojedynczych komórek. Przyszłe badania będą analizować, jak regulacja chromatyny wpływa na stany chorobowe, takie jak nowotwory, choroby metaboliczne i starzenie się.

automated-sample-preparation-for-multiplexed-analysis-single-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj zautomatyzowaną metodę multipleksowej analizy modyfikacji histonów w pojedynczych komórkach. Protokół ten umożliwia wysokoczułą i ilościową charakterystykę heterogeniczności chromatyny w komórkach Hep G2/C3A.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2) (Wideo) | JoVE Journal

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Przeglądaj więcej filmów