Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Rozwijamy proteomikę pojedynczych komórek dzięki zautomatyzowanej metodzie multipleksowej do badania globalnej heterogeniczności chromatyny w posttranslacyjnych modyfikacjach. To, co utrudnia ten protokół, to przygotowanie proteomiczne na skalę pikogramową, znakowanie multipleksowe oraz rozdzielanie złożonych kombinatorycznych zmodyfikowanych peptydów histonowych. Na początek należy odtworzyć komórki raka Hep G2/C3A w końcowym stężeniu 200 do 500 komórek na mikrolitr w lodowatym PBS.

Ustaw szerokość impulsu i napięcie napędu każdej dyszy na wartości podane przez producenta. Aby uzyskać maksymalną efektywność odbioru, upewnij się, że przesunięcie Z między dwoma dyszami różni się o mniej niż 50 mikrometrów. Zidentyfikuj optymalną pozycję styku dla każdej dyszy i porównaj odczyty wysokości Z w zakładce ustawień dyszy.

W przypadku schematu multipleksowania tuplex załaduj pojedynczy zamek na uchwyt zamka w osłonie, a następnie przenosi go na instrument. Używając pipety, zaszczep 150 mikrolitrów DMSO klasy LCMS do nowej rurki PCR. Umieść go w pozycji drugiej na stanowisku myjniczym z pokrywką rury skierowaną w stronę drzwi przyrządu.

Rozpocznij bieg DMSO. Uzyskaj stabilny drop po zasysaniu DMSO. Zwróć uwagę na zmianę przezroczystości PDC.

Może być konieczne zwiększenie napięcia. Sprawdź stabilność, wykonując pomiar głośności dropów. Wykonaj konfigurację kreatora kamery na głowie, aby wyrównać kamerę.

Wydanie DMSO i pozwól instrumentowi na automatyczne płukanie dysz oraz rejestrowanie obrazów na wszystkich slajdach dla kontroli jakości. Przejrzyj te obrazy, aby zweryfikować jednolitą kroplę DMSO na każdym slajdzie oraz sprawdzić, czy nie ma brakujących lub nie trafiających do celu. Po aspiracji zawiesiny komórki otwórz komórkę w jednym module, wykonaj przechwyt tła, a następnie uruchom procedurę mapowania, aby zdefiniować strefę wyrzutu.

Przeprowadź analizę, a następnie przeprowadź cząstki, aby wybrać komórki na podstawie rozmiaru i wydłużenia. Teraz przygotuj świeżą mieszankę do trawienia w wodzie LCMS. Odgazuj roztwór pompą próżniową przez 10 minut na lodzie.

Po wylaniu mieszanki trawiennej na preparaty pozwól instrumentowi automatycznie przepłukać dysze i zrobić zdjęcia każdej preparatu. Przejrzyj obrazy, aby upewnić się, że każda kropla otrzymuje mieszankę trawienną w sposób równomierny. Inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez całą noc, aby przeprowadzić trawienie.

Po rozpoczęciu parowania i trawienia przez noc obejrzyj obrazy. Jeśli krople są wystarczająco suche, zatrzymaj bieg. Jeśli nie, kliknij kontynuuj i susz przez kolejne pięć minut.

Do etykietowania najpierw przygotuj roztwory do wielowarstwowej derywityzacji histonów. Po wydawaniu pozwól instrumentowi na automatyczne przepłukanie dysz i wykonaj zdjęcia każdego slajdu. Przejrzyj zdjęcia, aby potwierdzić równomierne rozmieszczenie i prawidłowe rozmieszczenie kropelek na wszystkich slajdach.

Po zakończeniu inkubacji podawaj roztwór hydroksylaminy do hartowania. Aby pobrać próbkę, wybierz run w głównej karcie, a następnie rozpocznij run w zakładce run. Po zakończeniu odbioru przejrzyj zdjęcia, aby sprawdzić, czy nie ma błędów.

Po zakończeniu przetwornika zdejmij pokrywę z płytki przetwornika. Następnie suszą próbki w niskim temperaturze w koncentratorze próżniowym. Do pozyskiwania danych należy zaprogramować metodę wysokowydajnej chromatografii cieczowej.

Ustaw eksperyment MS 2 tak, aby zawierał okna izolacji z przeładowaniem masy 50, dysocjacją kolizyjną o wysokiej energii 27% i automatycznym celem kontroli wzmocnienia na 1000%. Przykryj płytę gumową matą uszczelniającą i umieść ją wewnątrz automatycznego próbornika. Po uzyskaniu surowych plików krótko sprawdź chromatogram, a następnie uruchom surowe dane w EpiProfile wersji 2.1. Przejrzyj tabelę wyjściową znormalizowanych obserwacji histonów PTM i wykorzystaj ją do analiz dalszych.

Pierwsze 20 peptydoform histonowych H3 zostało zidentyfikowanych ilościowo, wykazując ich względne występowania w warunkach kontrolnych i butyranu sodu. Zarówno acetylacja H3 K9, jak i acetylacja H3 K 14 wykazały większą względną obfitość po leczeniu butyranem sodu. Podczas gdy acetylacja K14 przez H3 K9 wydawała się jeszcze bardziej wzbogacona w leczonych komórkach.

Całkowity poziom acetylacji wzrósł po leczeniu maślanu sodu u komórek objętych zabiegiem, wykazując szerszy rozkład błędu w porównaniu z grupami kontrolnymi, odzwierciedlając wyższą heterogeniczność wychwyconą na poziomie pojedynczych komórek. Ilościowe określenie pojedynczych i współwystępujących modyfikacji histonów wykazało, że stany acetylacji kombinatorycznej były najsilniej dotknięte przez butyran sodu. Szersze rozprzestrzenienie komórek poddanych butyranowi sodu wskazywało na zwiększoną heterogeniczność biologiczną pomiędzy pojedynczymi komórkami w obrębie sferoidów.

Protokół ten niweluje lukę w badaniach epigenetycznych, umożliwiając naukowcom badanie stanów chromatyny w roztworze pojedynczych komórek. Ten workflow umożliwia przygotowanie próbek o wysokiej przepustowości, multipleksowanie próbek oraz bezstronną spektrometrię mas, co pozwala na uzyskanie zarówno czułych, jak i ilościowych danych epigenetycznych pojedynczych komórek. Przyszłe badania będą analizować, jak regulacja chromatyny wpływa na stany chorobowe, takie jak nowotwory, choroby metaboliczne i starzenie się.