Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)
19 grudnia 2025
Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.
Rozwijamy proteomikę pojedynczych komórek dzięki zautomatyzowanej metodzie multipleksowej do badania globalnej heterogeniczności chromatyny w posttranslacyjnych modyfikacjach. To, co utrudnia ten protokół, to przygotowanie proteomiczne na skalę pikogramową, znakowanie multipleksowe oraz rozdzielanie złożonych kombinatorycznych zmodyfikowanych peptydów histonowych. Na początek należy odtworzyć komórki raka Hep G2/C3A w końcowym stężeniu 200 do 500 komórek na mikrolitr w lodowatym PBS.
Ustaw szerokość impulsu i napięcie napędu każdej dyszy na wartości podane przez producenta. Aby uzyskać maksymalną efektywność odbioru, upewnij się, że przesunięcie Z między dwoma dyszami różni się o mniej niż 50 mikrometrów. Zidentyfikuj optymalną pozycję styku dla każdej dyszy i porównaj odczyty wysokości Z w zakładce ustawień dyszy.
W przypadku schematu multipleksowania tuplex załaduj pojedynczy zamek na uchwyt zamka w osłonie, a następnie przenosi go na instrument. Używając pipety, zaszczep 150 mikrolitrów DMSO klasy LCMS do nowej rurki PCR. Umieść go w pozycji drugiej na stanowisku myjniczym z pokrywką rury skierowaną w stronę drzwi przyrządu.
Rozpocznij bieg DMSO. Uzyskaj stabilny drop po zasysaniu DMSO. Zwróć uwagę na zmianę przezroczystości PDC.
Może być konieczne zwiększenie napięcia. Sprawdź stabilność, wykonując pomiar głośności dropów. Wykonaj konfigurację kreatora kamery na głowie, aby wyrównać kamerę.
Wydanie DMSO i pozwól instrumentowi na automatyczne płukanie dysz oraz rejestrowanie obrazów na wszystkich slajdach dla kontroli jakości. Przejrzyj te obrazy, aby zweryfikować jednolitą kroplę DMSO na każdym slajdzie oraz sprawdzić, czy nie ma brakujących lub nie trafiających do celu. Po aspiracji zawiesiny komórki otwórz komórkę w jednym module, wykonaj przechwyt tła, a następnie uruchom procedurę mapowania, aby zdefiniować strefę wyrzutu.
Przeprowadź analizę, a następnie przeprowadź cząstki, aby wybrać komórki na podstawie rozmiaru i wydłużenia. Teraz przygotuj świeżą mieszankę do trawienia w wodzie LCMS. Odgazuj roztwór pompą próżniową przez 10 minut na lodzie.
Po wylaniu mieszanki trawiennej na preparaty pozwól instrumentowi automatycznie przepłukać dysze i zrobić zdjęcia każdej preparatu. Przejrzyj obrazy, aby upewnić się, że każda kropla otrzymuje mieszankę trawienną w sposób równomierny. Inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez całą noc, aby przeprowadzić trawienie.
Po rozpoczęciu parowania i trawienia przez noc obejrzyj obrazy. Jeśli krople są wystarczająco suche, zatrzymaj bieg. Jeśli nie, kliknij kontynuuj i susz przez kolejne pięć minut.
Do etykietowania najpierw przygotuj roztwory do wielowarstwowej derywityzacji histonów. Po wydawaniu pozwól instrumentowi na automatyczne przepłukanie dysz i wykonaj zdjęcia każdego slajdu. Przejrzyj zdjęcia, aby potwierdzić równomierne rozmieszczenie i prawidłowe rozmieszczenie kropelek na wszystkich slajdach.
Po zakończeniu inkubacji podawaj roztwór hydroksylaminy do hartowania. Aby pobrać próbkę, wybierz run w głównej karcie, a następnie rozpocznij run w zakładce run. Po zakończeniu odbioru przejrzyj zdjęcia, aby sprawdzić, czy nie ma błędów.
Po zakończeniu przetwornika zdejmij pokrywę z płytki przetwornika. Następnie suszą próbki w niskim temperaturze w koncentratorze próżniowym. Do pozyskiwania danych należy zaprogramować metodę wysokowydajnej chromatografii cieczowej.
Ustaw eksperyment MS 2 tak, aby zawierał okna izolacji z przeładowaniem masy 50, dysocjacją kolizyjną o wysokiej energii 27% i automatycznym celem kontroli wzmocnienia na 1000%. Przykryj płytę gumową matą uszczelniającą i umieść ją wewnątrz automatycznego próbornika. Po uzyskaniu surowych plików krótko sprawdź chromatogram, a następnie uruchom surowe dane w EpiProfile wersji 2.1. Przejrzyj tabelę wyjściową znormalizowanych obserwacji histonów PTM i wykorzystaj ją do analiz dalszych.
Pierwsze 20 peptydoform histonowych H3 zostało zidentyfikowanych ilościowo, wykazując ich względne występowania w warunkach kontrolnych i butyranu sodu. Zarówno acetylacja H3 K9, jak i acetylacja H3 K 14 wykazały większą względną obfitość po leczeniu butyranem sodu. Podczas gdy acetylacja K14 przez H3 K9 wydawała się jeszcze bardziej wzbogacona w leczonych komórkach.
Całkowity poziom acetylacji wzrósł po leczeniu maślanu sodu u komórek objętych zabiegiem, wykazując szerszy rozkład błędu w porównaniu z grupami kontrolnymi, odzwierciedlając wyższą heterogeniczność wychwyconą na poziomie pojedynczych komórek. Ilościowe określenie pojedynczych i współwystępujących modyfikacji histonów wykazało, że stany acetylacji kombinatorycznej były najsilniej dotknięte przez butyran sodu. Szersze rozprzestrzenienie komórek poddanych butyranowi sodu wskazywało na zwiększoną heterogeniczność biologiczną pomiędzy pojedynczymi komórkami w obrębie sferoidów.
Protokół ten niweluje lukę w badaniach epigenetycznych, umożliwiając naukowcom badanie stanów chromatyny w roztworze pojedynczych komórek. Ten workflow umożliwia przygotowanie próbek o wysokiej przepustowości, multipleksowanie próbek oraz bezstronną spektrometrię mas, co pozwala na uzyskanie zarówno czułych, jak i ilościowych danych epigenetycznych pojedynczych komórek. Przyszłe badania będą analizować, jak regulacja chromatyny wpływa na stany chorobowe, takie jak nowotwory, choroby metaboliczne i starzenie się.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do automatyzacji analizy potranslacyjnych modyfikacji histonów w jednej komórce za pomocą strategii izotopowego dwukrotnego znakowań. Procedura umożliwia ilościowe i wysoce czułe profilowanie heterogeniczności chromatyny na poziomie pojedynczej komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Proteomika pojedynczej komórki
- Potranslacyjne modyfikacje histonów
- Analiza chromatyny
Tło
- Analiza pojedynczych komórek jest kluczowa dla zrozumienia heterogeniczności komórkowej.
- Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w regulacji struktury i funkcji chromatyny.
- Automatyzowane metody mogą zwiększyć powtarzalność i wrażliwość w badaniach proteomicznych.
- Wyzwania obejmują obsługę małych wielkości próbek i złożonych mieszanek peptydów.
Cel badania
- Opracowanie solidnego protokołu do analizy modyfikacji histonów na poziomie pojedynczej komórki.
- Poprawa wydajności wielokrotnego znakowań w procesach proteomicznych.
- Rozwiązanie wyzwań związanych z małym stężeniem peptydów histonowych.
Stosowane metody
- Rekonstytucja komórek Hep G2/C3A w PBS w określonym stężeniu.
- Dostosowanie parametrów dyszy dla optymalnego pobierania próbek.
- Zastosowanie izotopowego dwukrotnego znakowań do ilościowania.
- Zastosowanie trawienia ArgC do przygotowania peptydów.
Główne wyniki
- Sukces w automatyzacji analizy modyfikacji histonów w jednej komórce.
- Wysoka wrażliwość i powtarzalność w profilowaniu.
- Skuteczna rozdzielczość złożonych kombinacyjnie zmodyfikowanych peptydów histonowych.
- Wgląd w heterogeniczność chromatyny i odpowiedzi epigenetyczne.
Wnioski
- Opracowany protokół poprawia badanie dynamiki chromatyny na poziomie pojedynczej komórki.
- Automatyzacja znacząco poprawia wydajność analizy modyfikacji histonów.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych pytań biologicznych dotyczących epigenetyki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
