Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Badania te mają na celu wdrożenie bardziej szczegółowej kwantyfikacji w próbkach lipidemicznych przy użyciu znakowania stabilnymi izotopami. Pozwala nam to zrozumieć panele lipidowe w bardzo zróżnicowanych próbkach, od owadów po ludzi. Obecnie istnieje luka w tej dziedzinie dotycząca standaryzacji LC-TIMS-TOF MS/MS w badaniach lipidemicznych.

W tym celu podajemy metodę śledzenia szczątków biomasy. W przyszłości nasze badania będą obejmowały badanie epigenetyki i metabolomiki obecnych w procesie biologicznym z wykorzystaniem metod LC-TIMS-TOF MS/MS z wykorzystaniem metod DDA i DIA. Aby rozpocząć kalibrację spektrometru mas lub MS dla LC-TIMS-TOF MS/MS, otwórz oprogramowanie sterujące TIMS i na podkarcie kalibracji kliknij M over Z, wybierz mieszankę strojenia z pola rozwijanego i kliknij kalibruj w prawym dolnym rogu.

Kontynuuj klikanie kalibracji, aż zostanie osiągnięty wynik 100%. Teraz wybierz zakładkę mobilności i postępuj zgodnie z tymi samymi krokami, jak pokazano, aż zostanie osiągnięty 100% wynik kalibracji. Aby wygenerować każdy punkt kalibracji na krzywej kalibracyjnej, należy dodać do mieszaniny wewnętrznego wzorca lipidów 10 mikrolitrów zdeuterowanej mieszaniny wzorca wewnętrznego.

Przygotuj siedem takich wzbogaconych próbek dla siedmiu punktów kalibracji w żądanym zakresie. Korzystając z oprogramowania do analizy danych, ręcznie opisz łańcuchy kwasów tłuszczowych w oparciu o pasywne wzorce MS/MS. Aby określić znakowanie izotopów stabilnych lub wydajność SIL, należy obliczyć stosunek powierzchni izotopów zawierających SIL do powierzchni izotopów niezawierających SIL.

Oblicz wzór teoretyczny, określając prawdopodobieństwo znalezienia oznaczonego atomu w dowolnym miejscu. Oblicz wzbogacenie SIL, dopasowując eksperymentalne profile izotopowe do wzorca teoretycznego symulowanego w oprogramowaniu do analizy danych. Aby rozpocząć pracę, aktywuj piec kolumnowy, klikając przycisk termometru i aktywuj pompy, klikając przycisk zaworu.

Ustaw metodę MS na odpowiednią metodę zapisaną wcześniej. Sprawdzić, czy objętość wstrzyknięcia wynosi pięć mikrolitrów i linię pierwszą docelową fiolkę 20 do jednej i zapisać listę próbek. Rozpocznij sekwencję i potwierdź pomyślne wstrzyknięcie, wyświetlając w systemie komunikat informujący o wstrzyknięciu.

Skopiuj pierwszy wiersz i wklej go poniżej, aby wygenerować nowy wiersz drugi. Wypełnij drugi wiersz próbkami w zależności od eksperymentu, upewnij się, że używana jest właściwa pozycja w autosamplerze. Jeśli fazy ruchome są świeże, najpierw wykonaj test kształtu piku z wzorcami mieszaniny lipidowej producenta, aby porównać go z poprzednimi wynikami.

Mieszanina lipidów i normy są wyświetlane na ekranie. Upewnij się, że nowe linie mają prawidłową metodę separacji, a nie metodę kondycjonowania wstępnego zastosowaną w pierwszej linii. Upewnij się, że wprowadzona metoda MS jest poprawna.

Sprawdź, czy załadowano poprawną metodę przetwarzania i włączono uruchamianie procesu automatycznego. Zapisz listę próbek, aby upewnić się, że próbki są analizowane po zakończeniu bieżącego przebiegu. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie do analizy danych.

W lewym górnym rogu kliknij przycisk pliku i wybierz otwarty. Aby wybrać wybrane pliki, kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę pliku i wybierz właściwości. Następnie wybierz stan kalibracji.

Z listy rozwijanej wybierz kalibrację wewnętrzną spektrometru mas. Upewnij się, że wszystkie błędy są mniejsze niż jedna część na milion. Następnie wybierz kalibrację mobilności wewnętrznej i potwierdź, że błąd jest mniejszy niż jedna część na milion.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy chromatogram i wybierz edytuj chromatogram. Podczas wpisywania kliknij pole rozwijane i wybierz wyodrębniony chromatogram jonowy. W obszarze filtr wybierz wszystkie MS, a w trybie skanowania wybierz wszystko, aby wyświetlić piki interesującej cząsteczki, a nie tylko jej fragmenty.

Istnieją dwie opcje filtrowania do wyboru cząsteczek, mas lub wzoru. W przypadku wybrania mas należy wybrać teoretyczne M zamiast Z interesującej nas cząsteczki, która w tym przypadku wynosi 829,7985. Jeśli wybrano formułę, wybierz wzór dla cząsteczki i interesujących form jonów, którym w tym przypadku jest amon.

W polu Szerokość wybierz plus lub minus jeden. Aby uzyskać polaryzację, upewnij się, że utrzymuje tryb dodatni. W obszarze mobilność wybierz od 1,455 do 1,465, aby wyizolować cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania i odfiltrować cząsteczki, które nie mieszczą się w tych wartościach.

Po wybraniu parametrów kliknij zmień, a następnie OK w prawym górnym rogu. Po krótkim czasie oprogramowanie przetworzy selekcje i wygeneruje chromatogram. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii bazowej początku interesującego nas piku i przeciągnij, przytrzymując koniec szczytu, aby uzyskać żywe widmo masowe fragmentów w tym czasie przechowywania.

Kliknij prawym przyciskiem myszy po lewej stronie ekranu na mobilogramie i wybierz edytuj mobilogram. Pojawi się okno o nazwie edytuj ślady mobilogramu. Postępuj zgodnie z instrukcjami pokazanymi wcześniej.

W przypadku czasu przechowywania wprowadź czas przechowywania szczytu zainteresowania. Po wybraniu parametrów kliknij dodaj i OK w prawym górnym rogu. Poczekaj, aż oprogramowanie przetworzy selekcje i wyśle chromatogram.

W celu ekstrakcji jonów powtarzaj kroki pokazane wcześniej, aż utworzy się lista jonów. W dolnej części okna MS wybierz profil MS i fragment MS, aby umożliwić widok widma jonów z pełnego skanowania w trybie pasywnym. W widoku widma kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję kopiuj widmo złożone.

Dane widma, które pojawiają się po prawej stronie, mogą dostarczyć więcej informacji o związku, takich jak rozdzielczość, zdolność rozdzielcza, intensywność i stosunek sygnału do szumu. Aby przetworzyć dane, należy ręcznie zintegrować chromatogram i piki ruchliwości, aby uzyskać cenne informacje na temat cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy, znajdź i wybierz związki ręcznie, chromatogram lub mobilogram.

Kliknij lewym przyciskiem myszy i podświetl żądany szczyt. Uzyskane informacje obejmują czas retencji, powierzchnię, stosunek sygnału do szumu i mobilność.