Name: Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metody wytwarzania mysich organoidów jądrowych w warunkach 2D i 3D z ECM oraz bez ECM. Techniki te umożliwiają badanie spermatogenezy i endokrynologii rozrodczej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 i 4UH3ES029073-03, oraz Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.
Autorzy chcieliby podziękować Ericowi W. Rothowi za pomoc w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W pracach wykorzystano ośrodek BioCryo Centrum NUANCE Uniwersytetu Northwestern, który otrzymał wsparcie z Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); program MRSEC (NSF DMR-1720139) w Centrum Badań Materiałowych; Międzynarodowy Instytut Nanotechnologii (IIN); i stanu Illinois, za pośrednictwem IIN. Wykorzystano również sprzęt CryoCluster, który otrzymał wsparcie z programu MRI (NSF DMR-1229693). Grafiki w Rysunek 1 zostały zaprojektowane przy użyciu BioRender.com.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Northwestern, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC.
1. Przygotowanie enzymatycznych roztworów dysocjacji tkanek
<ol>
	<li>Użyć dwóch różnych roztworów enzymatycznych (roztwór 1 i roztwór 2), oba wykonane przy użyciu roztworu pożywki do hodowli podstawowej (BM).</li>
	<li>W celu przygotowania BM dodać surowicę i penicylinę-streptomycynę do minimalnych niezbędnych stężeń do końcowych stężeń odpowiednio 10% i 1% (patrz Tabela materiałów dla określonych odczynników). Następnie sterylnie przefiltruj BM przez filtr 0,22 μm. Przed użyciem z komórkami należy wstępnie zrównoważyć sterylny BM do neutralnego pH, dozując go do naczynia hodowlanego i umieszczając w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę 
	UWAGA: BM można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia, po czym należy przygotować świeży BM.</li>
	<li>Aby przygotować roztwory podstawowe kolagenazy I, należy najpierw rozpuścić 100 mg kolagenazy I w 1 ml sterylnego zarodka klasy H2O (końcowe stężenie 10% m/v), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia i przechowywać 20 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności należy rozmrażać tylko raz.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworów podstawowych dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) należy dodać 20 mg DNazy I do 1 ml sterylnego zarodka klasy H2O (stężenie końcowe 2% m/v), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia (nie wirować) i przechowywać 20 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności należy rozmrażać tylko raz.</li>
	<li>W przypadku roztworów podstawowych hialuronidazy dodać 30 mg do 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; końcowe stężenie 3% hialuronidazy m/v w PBS zawierającym Ca++/Mg++), odwrócić lub zawirować do rozpuszczenia i przechowywać 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Podwielokrotności można kilkakrotnie rozmrażać i ponownie zamrażać bez utraty aktywności enzymatycznej.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór dysocjacyjny 1, dodaj 10 μl kolagenazy I i 10 μl DNazy I do 1 ml sterylnego, wstępnie zrównoważonego BM (końcowe stężenia: 1 mg/ml kolagenazy I i 5 μg/ml DNazy I). Delikatnie rozetrzeć pipetą, aby wymieszać roztwór, a następnie podgrzać do temperatury 37 °C przed użyciem z chusteczką. 
	UWAGA: Roztwór 2 przygotowuje się przez dodanie 33 μl hialuronidazy (podgrzanej do 37 °C) na 1 ml roztworu 1 (do końcowego stężenia 1 mg/ml). Następuje to w połowie enzymatycznej dysocjacji tkanki jądra w kroku 2.5 poniżej.</li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanki jądra
UWAGA: Wszystkie myszy były trzymane w klatkach z polipropylenu i zaopatrywane w jedzenie i wodę ad libitum. Zwierzęta były karmione napromieniowaną karmą, która nie zawierała fitoestrogenów. Młode myszy CD-1, 5 dni po porodzie (dpp), były wykorzystywane do wszystkich eksperymentów i znieczulane przed eutanazją i pobraniem tkanek, w komorze anestezjologicznej podłączonej do parownika izofluranu (2,5 l / min w O2). U myszy potwierdzono pełne znieczulenie poprzez brak odpowiedzi na nakłucie palca u nogi, po czym myszy zostały poddane eutanazji poprzez dekapitację.
<ol>
	<li>Znieczulij myszy w komorze izofluranowej, zapewnij znieczulenie za pomocą nakłucia palca u nogi, a następnie odetnij głowę myszy ostrymi nożycami. Umieść uśpioną mysz na wznak na macie preparacyjnej i wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Owiń skórę dolnej części brzucha kleszczami i otwórz brzuch nożyczkami.</li>
	<li>Zlokalizuj jądra w dolnej lewej i prawej pachwinowej części brzucha. Przeciąć ich połączenia z nasieniowodami i wszelką zakotwiczoną tkanką łączną, a następnie podnieś całe jądro (z nadal przyczepionymi najądrzami) ze zwierzęcia. Umieścić jądra na szalce Petriego o wstępnie zrównoważonym BM.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym i w sterylnym polu wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na jednym końcu każdego jądra za pomocą małych nożyczek do mikrodysekcji lub delikatnie rozrywając za pomocą dwóch cienkich kleszczy.
	<ol>
		<li>Następnie, trzymając jądro od przeciwnego końca nacięcia, delikatnie ściśnij jądro cienkimi kleszczami i pchnij delikatnym ruchem zamaszystym w kierunku otworu w tunice; spowoduje to uwolnienie tkanki jądra jako jednego spójnego kawałka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokrój jądra na mniejsze kawałki (≤ 2 mm3) i umieść je w 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) dysocjacji Roztwór 1.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>W przypadku więcej niż 10 jąder należy zwiększyć całkowitą objętość roztworu dysocjacyjnego o 1 ml, zapewniając co najmniej 1 ml roztworu dysocjacyjnego na 10 jąder (np. 2 ml na 20 jąder, 3 ml na 30 jąder itd.).</li>
		<li>Delikatnie rozcierać fragmenty jądra 50 razy (50x) w roztworze 1 za pomocą pipety P1000. Upewnij się, że kanaliki oddzielają się od siebie i od tkanki śródmiąższowej w tym miejscu. Jeśli pozostaną grudki, inkubować przez dodatkowe 5 minut i ponownie rozcierać (50x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 33 μl roztworu podstawowego hialuronidazy (wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C, od kroku 1.5) na 1 ml mieszaniny dysocjacyjnej roztwór 1 (zawierającej częściowo zdysocjowaną tkankę jądra i kanaliki). Po dodaniu hialuronidazy nazywa się to roztworem 2.
	<ol>
		<li>Rozcierać (50x) za pomocą P1000 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Rozcierać (50x) za pomocą pipety P200.</li>
		<li>Upewnij się, że w tym momencie nie ma widocznych kanalików ani grudek komórek. Jeśli grudki utrzymują się, inkubować do 5 minut, z dalszym rozcieraniem za pomocą pipety P200 (50x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ugasić enzymy dysocjacyjne, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do 10% całkowitej objętości roztworu 2. Kilkakrotnie rozcierać za pomocą pipety P200, aby upewnić się, że nie pozostały żadne grudki, a następnie przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Odwirować komórki w stężeniu 100 x g przez 7 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym BM.</li>
	<li>Policz całkowite i żywotne stężenia komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze. Dodać 10 μl rozcieńczonej w stosunku 1:1 zawiesiny komórek: roztwór błękitu trypanowego do komory zliczania komórek hemocytometru (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ponownie odwirować komórki przy 100 x g przez 7 minut i ponownie zawiesić w świeżym BM. 
		UWAGA: Do obliczania stężenia i liczby komórek należy używać wyłącznie żywotnych komórek. Do wytwarzania organoidów należy używać wyłącznie zawiesin komórkowych o ≥ 80% żywotności.</li>
		<li>Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki do stężeń komórek zgodnie z opisem, aby podzielić 280 000 komórek na objętości użyte w protokole Szczegółowe kroki poniżej w sekcji 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 komórek/ml, 2D ECM – 0,56 x 106 komórek/ml, 3D ECM-Free – 4,66 x 106 komórek/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 komórek/ml. 
		UWAGA: Wszystkie przedstawione tutaj eksperymenty z kulturami rozpoczynają się od 280 000 komórek wysianych na basenie. Liczby te są dopasowywane do reprezentatywnych danych w Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie naczyń z hodowli organoidów i wysiewanie komórek
UWAGA: Aby zapewnić jednorodność ECM, przed eksperymentem należy wstępnie rozmrozić zamrożone porcje ECM przez noc. Podwielokrotności ECM należy zanurzyć w wiadrze z lodem w lodówce lub chłodni o temperaturze 4 °C, aby zagwarantować powolny, stopniowy wzrost temperatury. Wszystkie ECM stosuje się w końcowym rozcieńczeniu 1:1 w BM do hodowli. Rozmrożony ECM i rozcieńczony w stosunku 1:1 ECM należy przechowywać na lodzie do momentu bezpośrednio przed użyciem, w przeciwnym razie ECM może dojść do przedwczesnej polimeryzacji.
<ol>
	<li>W przypadku hodowli 2D bez ECM nie jest konieczne specjalne przygotowanie, zawiesiny jednokomórkowe (500 μL 0,56 x 106 komórek/ml w BM) należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach 4-dołkowych i umieścić w inkubatorze do hodowli w temperaturze 35 °C. 
	UWAGA: Komórki powinny przylegać do dna szalki hodowlanej w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli i mogą w tym samym czasie wykazywać małe skupiska komórek 3D.</li>
	<li>W przypadku hodowli 2D ECM należy dozować 100 μl zimnego, rozcieńczonego w stosunku 1:1 zewnątrzkomórkowego podłoża macierzystego do 4-dołkowego szkiełka samochodowego, upewniając się, że żel pokrywa całe dno naczynia.
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 35 °C na co najmniej 30 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM do postaci żelu.</li>
		<li>Dodaj zawiesinę komórek (500 μl 0,56 x 106 komórek/ml w BM) bezpośrednio na wierzchu żelu 2D po jego polimeryzacji. 
		UWAGA: Komórki powinny grupować się razem, tworząc małe klastry 3D w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku hodowli 3D bez ECM, przed rozpoczęciem hodowli komórkowej należy przygotować wkładki do szalki Petriego 3D z agarozy.
	<ol>
		<li>Najpierw autoklaw 1,5 g proszku agarozy w zlewce o pojemności 100 ml, a następnie dodaj 75 ml sterylnej, destylowanej wody i kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać stopioną 2% agarozę do odlewania szalki Petriego 3D.</li>
		<li>W sterylnym obszarze roboczym dozuj stopioną agarozę do formy 3D na szalkę Petriego, aż menisk zrówna się z bokami formy.</li>
		<li>Pozwól agarozie ostygnąć i stężeć. Gdy forma stwardnieje, odwróć ją do góry nogami i delikatnie zginaj kilkakrotnie, aż szalka Petriego 3D z agarozy wypadnie z formy. 
		UWAGA: W tym momencie można przygotować wiele agarozowych szalek Petriego 3D i przechowywać je w sterylnymH2Olub DPBS w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
		<li>Przed hodowlą umieść agarozowe szalki Petriego 3D w 24-dołkowej naczyniu hodowlanym i przykryj je 1 ml BM. Pozostawić trójwymiarowe szalki Petriego w równowadze w BM przez co najmniej 30 minut w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C. Odrzucić BM i powtórzyć równoważenie jeszcze raz z 1 ml świeżego BM. Po zrównoważeniu 3D szalek Petriego w BM, będą one miały ten sam kolor co BM (tj. różowy).</li>
		<li>Aby przygotować się do wysiewu komórek, usuń cały BM ze studzienki i dozuj 200 μl świeżego BM wokół, ale nie wewnątrz środkowego wgłębienia szalki Petriego 3D. Zbierz również pozostały BM z wnętrza środkowego wgłębienia do wysiewu komórek wkładki mikrostudzienki.</li>
		<li>Dozować zawiesinę jednokomórkową (4,66 komórek/ml w 60 μl BM) do środkowego wgłębienia agarozowej szalki Petriego 3D. Delikatnie rozcieraj w górę iw dół, aby wymieszać komórki i zagwarantować zawiesinę pojedynczej komórki na początku hodowli.</li>
		<li>Umieścić w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 35 °C w celu przeprowadzenia hodowli. Następnego dnia usuń 200 μl BM z okolic wkładki mikrostudzienki i zastąp 1 ml świeżego BM. Spowoduje to przeniesienie poziomu cieczy powyżej płaszczyzny wkładki, zanurzając całą kulturę.</li>
		<li>Powoli i ostrożnie wyjmij/dodaj pożywkę z zewnątrz agarozowej szalki Petriego 3D. Organoidy powinny były zagęścić się przez noc, pozwalając im spocząć na dnie i umożliwiając zmiany pożywek pozostawienie organoidów w spokoju.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku hodowli 3D ECM należy przygotować zawiesinę pojedynczej komórki, łącząc w równych częściach zawiesinę komórek w BM z zimnym, wstępnie rozmrożonym ECM (stężenie końcowe = 2,8 x 106 komórek/ml).
	<ol>
		<li>Natychmiast dozuj mieszaninę komórka-ECM do 4-dołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że mieszanina pokrywa całe dno płytki.</li>
		<li>Umieścić szkiełka z komory w temperaturze 35 °C w inkubatorze i pozwolić na polimeryzację ich zawartości. Powinno to zająć co najmniej 30 minut. Po polimeryzacji dodać 500 μl BM na wierzch kultury. 
		UWAGA: Komórki powinny się zgrupować, tworząc małe agregaty 3D w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrzymanie organoidów
<ol>
	<li>Hodowla wszystkich typów modeli organoidów w temperaturze 35 °C. Dla wszystkich typów kultur co 2 dni wymieniaj połowę swoich pożywek na świeże BM. Aby upewnić się, że organoidy nie zostaną przypadkowo zebrane podczas wymiany pożywki, zawsze powoli pobieraj pożywkę z rogu szkiełka komory oraz z zewnętrznego punktu poza agarozowymi szalkami Petriego 3D. Wszystkie pożywki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu wykorzystania ich do późniejszych testów immunologicznych lub innych analiz (tj. oznaczania ilościowego wydzielanych hormonów rozrodczych lub cytokin).</li>
	<li>Po 7 dniach w hodowli należy zastosować BM zawierający hormon folikulotropowy (końcowe stężenie 20 mIU/ml) i ludzką gonadotropinę kosmówkową (końcowe stężenie 4,5 IU/ml). Dotyczy to wszystkich typów kultur organoidowych.</li>
	<li>Rutynowo obrazuj wszystkie kultury organoidów (tj. obrazowanie poklatkowe) w celu scharakteryzowania powstawania organoidów i ilościowego określenia wskaźników samoorganizacji, rozwoju i wzrostu w czasie.</li>
</ol>
5. Kolekcja organoidów
UWAGA: Wszystkie organoidy mogą być utrwalone za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS do dalszego znakowania immunologicznego i analiz histologicznych. Utrwalać na 2 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją lub przez noc w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>W przypadku kultur 2D wolnych od ECM, najpierw przepłucz próbkę świeżym PBS, a następnie dodaj utrwalacz bezpośrednio na przylegające konstrukcje.</li>
	<li>W przypadku metod hodowli ECM (2D i 3D) należy przepłukać raz PBS, a następnie dodać utrwalacz bezpośrednio na wierzchu próbki organoidu ECM (aby połączyć żel ECM i organoidy razem) lub alternatywnie, delikatnie pipetować organoidy w górę i w dół, aby uwolnić je od otaczającego ECM, i przenieść do oddzielnej probówki w celu utrwalenia.</li>
	<li>W przypadku hodowli 3D bez ECM, delikatnie pipetuj organoidy w górę i w dół w środkowym wgłębieniu agarozowej szalki Petriego 3D; spowoduje to wypłukanie organoidów, ułatwiając ich łatwe pobranie za pomocą pipety. Następnie przenieś organoidy do osobnej probówki w celu utrwalenia.</li>
	<li>Przed przetworzeniem na parafinę należy osadzić wiele organoidów (≥ 20) w małej objętości (~ 30 μl) żelu do przetwarzania tkanek; pomaga to zorientować i skoncentrować organoidy na małym obszarze w blokach parafinowych, ułatwiając obserwację podczas cięcia i łatwiejszą identyfikację wizualną w obrębie skrawków parafiny. 
	UWAGA: Organoidy mogą być trudne do zidentyfikowania po zatopieniu parafiny i podziale na mikrotomie.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z ukończeniem tego protokołu generowania organoidów, użytkownik będzie miał do dyspozycji cztery różne techniki hodowli do składania konstruktów jąder i organoidów w środowiskach ECM lub wolnych od ECM. Co ważne, wszystkie cztery metody pozwalają badaczowi na nieinwazyjną obserwację samoorganizacji organoidów w czasie poprzez obrazowanie poklatkowe lub zapis wideo, a także na nieinwazyjne zbieranie kondycjonowanych pożywek do analizy wydzielanych hormonów i cytokin, bez naruszania tkanek podczas hodowli. We wszystki...

Organoidy jąder to pionierska technika badania rozwoju jąder, spermatogenezy i fizjologii in vitro1,2,3,4. Zbadano kilka metod generowania organoidów; Obejmują one różnorodne systemy hodowli bez macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ECM, zarówno w orientacji dwuwymiarowej (2D), jak i trójwymiarowej (3D). Różne metody generowania mogą promować różne strategie składania komórek; Skutkuje to wysokim poziomem zmienności morfologicznej i funkcjonalnej między opublikowanymi modelami organoidów. Celem tego artykułu jest omówienie obecnego stanu modeli jąder in vitro i posłużenie jako szablon dla przyszłych badaczy podczas projektowania eksperymentów z organoidami jąder. W ramach niniejszego badania zdefiniowano i scharakteryzowano cztery różne archetypy systemu hodowlanego w procesie eksperymentalnym i wyniku biologicznym. Należą do nich: metody hodowli 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free i 3D ECM. Przedstawione w niniejszym dokumencie strategie mają być proste, dostępne i wysoce powtarzalne dla różnych laboratoriów i grup badawczych.
Historycznie dla jądra, nazwa "in vitro", była używana dla kilku różnych metod hodowli tkanek i komórek jąder. Należą do nich metody organotypowej hodowli tkanek/narządów (tj. hodowla eksplantatów)5, izolowana hodowla kanalików nasiennych6, hodowla komórek jądra7, oraz metody morfogenezy tkanek de novo (tj. konstrukty biologiczne i organoidy)1. Pierwsze badania nad spermatogenezą in vitro przeprowadzono około 100 lat temu, z hodowlą eksplantatów jąder królika w 1920 roku8, a później w 1937 roku z eksplantatami myszy9. W ramach tych wstępnych eksperymentów zaobserwowano, że spermatogonia w znacznym stopniu degeneruje się w pierwszym tygodniu hodowli, chociaż zidentyfikowano pewne komórki różnicujące się mejotycznie. Przypominając te historyczne doniesienia, hodowla eksplantatów jądra została ożywiona i zoptymalizowana w 2011 roku, aby stać się wykonalną techniką badania klasy testis<sup="xref">10. Od 2011 r. hodowla eksplantatów wytworzyła plemniki kompetentne w płodności w wielu raportach11,12,13. Jednak ze względu na zależność hodowli eksplantatów od wcześniej istniejących natywnych kanalików jądrowych, te ostatnie postępy są dokładniej opisywane jako przykłady funkcji jąder i spermatogenezy "ex vivo", funkcji tkanek, która została utrzymana lub wznowiona po usunięciu z organizmu. Pomimo rozpowszechnienia w literaturze, długoterminowe utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych w eksplantatach jąder jest trudne do odtworzenia14,15,16,17,18, zwłaszcza w ramach czasowych wystarczająco długich, aby w pełni zaobserwować spermatogenezę in vitro (~35 dni u myszy19 i 74 u ludzi20). Intrygujące jest zrozumienie, że wiele z tych samych wyzwań, których doświadczyliśmy 100 lat temu, jest nadal doświadczanych w spermatogenezie ex vivo.
W przeciwieństwie do metod ex vivo, organoidy jąder to de novo złożone mikrotkanki generowane całkowicie in vitro ze źródeł komórkowych (tj. pierwotnych komórek jąder). Organoidy jąder zapewniają kreatywną strategię pozwalającą obejść historyczną zależność tej dziedziny od wcześniej istniejących tkanek rodzimych i całkowicie podsumować biologię jąder in vitro. Istnieje wiele wymagań wspólnych dla większości modeli tkanek organoidowych; Obejmują one (1) morfologię lub architekturę tkanek in vivo-mimetycznych, (2) wiele głównych typów komórek reprezentowanej tkanki, (3) samoorganizację lub samoorganizację w ich generowaniu oraz (4) zdolność do symulowania pewnego poziomu funkcji i fizjologii reprezentowanej tkanki21,22,23,24. W przypadku jądra można to uchwycić w czterech głównych cechach rozpoznawczych: (1) włączenie głównych typów komórek jądra, zarodka, Sertoliego, Leydiga, komórek okołorurkowych i innych komórek śródmiąższowych, (2) składanie tkanek skierowanych na komórki, (3) odpowiednio podzielone typy komórek na oddzielne przedziały rurkowe (zarodek i Sertoli) i regiony śródmiąższowe (wszystkie inne typy komórek) oraz (4) pewien stopień funkcji tkanek (np. wydzielanie hormonów rozrodczych lub reakcje tkanek oraz utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych). Biorąc pod uwagę historyczne wyzwania związane z utrzymaniem różnicowania komórek rozrodczych ex vivo i in vitro, rekapitulacja in vivo-mimetycznych architektur jąder (tj. struktur przypominających kanaliki nasienne) z dodatkowymi markerami sugerującymi symulację fizjologii jąder (np. funkcji hormonalnej), są priorytetowymi kamieniami milowymi w kierunku generowania organoidów, które pewnego dnia mogą utrzymać spermatogenezę in vitro.
Większość opublikowanych metod organoidów jąder korzysta z dostępnych na rynku ECM (np. kolagenu lub zastrzeżonych preparatów ECM)25,26,27 lub ECM pozyskiwane na zamówienie (np. decelularizowane hydrożele pochodzące z ECM z jądrami)28,29,30. Egzogenny ECM wspomaga tworzenie tkanek de novo poprzez zapewnienie rusztowania wspomagającego montaż do generowania tkanek. Metody ECM pozwoliły na imponujący poziom tworzenia tkanek, w tym pewną obecność komórek rozrodczych i morfologię mimetyczną tkanki25,28. Jednak ECM, z których korzystają, nie zawsze są powszechnie dostępne (tj. decelularizowane hydrożele pochodzące z ECM), a niektóre metody wymagają wyrafinowanych orientacji wysiewu żeli i komórek (np. 3-warstwowe gradienty ECM i druk 3D)25,31,32. Metody wolne od rusztowań (np. wiszące płytki hodowlane i nieprzyległe)33,34,35 również wygenerowały solidne i wysoce powtarzalne organoidy bez potrzeby stosowania żeli lub rusztowań ECM. Jednak morfologia tkanek tych organoidów wolnych od rusztowań jest często niepodobna do jąder in vivo, a większość tych doniesień zawiera biochemiczny dodatek ECM w celu promowania tworzenia tkanek33,34,36, lub alternatywnie, polegać na wirowaniu w celu wymuszonej agregacji i zagęszczenia komórek34, co czyni je mniej idealnymi do badania migracji kierowanej przez komórki i samoorganizacji.
Cztery metody generowania organoidów przedstawione w tym manuskrypcie obejmują zarówno zależne od ECM, jak i niezależne strategie, z których każda wykorzystuje proste rozsiewanie komórek, które umożliwia obserwację samoorganizacji organoidów sterowanych przez komórki. Wszystkie cztery techniki mogą być wykonywane z tych samych zawiesin komórkowych lub mogą wykorzystywać niestandardowe i wzbogacone o typ komórki populacje. Mocną stroną tych metod jest możliwość obserwacji samoorganizacji organoidów w czasie rzeczywistym oraz bezpośredniego porównania, w jaki sposób struktury jąder samoorganizują się w różnych mikrośrodowiskach kulturowych. Różnice fenotypowe między tymi czterema metodami hodowli powinny być brane pod uwagę pod kątem ich wpływu na pytanie badawcze lub temat badawczy badacza. Każda metoda pozwala na uzyskanie konstruktów biologicznych lub organoidów w ciągu 24 godzin lub krócej. Podsumowując, przedstawione tutaj metody zapewniają zestaw technik składania organoidów do badania składania organoidów jąder, rozwoju tkanek i fizjologii jąder in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 um Media Sterylne filtry</td><td>Millipore Sigma</td><td>scgpu05re</td><td>Do sterylnych mediów filtracyjnych</td></tr><tr><td>3 i beta; Przeciwciało pierwszorzędowe HSD</td><td>Cosmo Bio Co</td><td>K0607</td><td>Marker komórek Leydiga, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &alpha;-Mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &alpha;-Rabbit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td><td>Przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorescencją</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-095-080</td><td>Baza pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej Kolagenaza I</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td>Do roztworu dysocjacyjnego 1</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Matrix, wolna od LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa używana do odlewania żeli hodowlanych 2D i 3D ECM</td></tr><tr><td>Countess Licznik komórek Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Automatyczny licznik komórek (maszyna do hemacytometru)</td></tr><tr><td>Szkiełka z komory do liczenia komórek Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Szkiełko hemacytometryczne do użytku z automatycznym licznikiem Countess</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe DDX4</td><td>Abcam</td><td>138540</td><td>Marker spermatogonii, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (2,280 u/mgDW)</td><td>Worthington Bio</td><td>LS002140</td><td>Do roztworu dysocjacyjnego 1</td></tr><tr><td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040182</td><td>Do odtwarzania hialuronidazy</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Embryo Grade H2O</td><td>MIllipore Sigma</td><td>W1503</td><td>Do odtwarzania kolagenazy I i Dnazy I</td></tr><tr><td>Płodowej surowicy bydlęcej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Do tłumienia roztworów dysowitacyjnych enzymów</td></tr><tr><td>Pęcherzyk hormon stymulujący</td><td>Abcam</td><td>ab51888</td><td>Do długotrwałej hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1063</td><td>Do długotrwałej hodowli organoidów</td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td>Do roztworu dysocjacyjnego 2</td></tr><tr><td>Test immunoenzymatyczny inhibiny B</td><td>Ansh Labs</td><td>AL-107</td><td>Zestaw</td></tr> <tr><td>ELISA inhibiny BKnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>Źródło surowicy do podłoża podstawowego</td></tr><tr><td>Mikrotkanki 3D Sferoidy mikropleśni Petriego (matryca 24-35, 5x7)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z764051</td><td>Do produkcji organoidów 3D bez ECM</td></tr><tr><td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-dołkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-7</td><td>Do hodowli 2D ECM bez ECM i 2D, 3D ECM</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>Antybiotyk dla pożywki</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Żel do przetwarzania próbek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Do wspomagania zatapiania parafiny</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne SOX9</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5535</td><td>Marker Sertoli, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Tedklad Global Mouse Chow (Hodowca)</td><td>Teklad Global</td><td>2920</td><td>Karma dla myszy bez fitoestrogenów</td></tr><tr><td>Tedklad Global Mouse Chow (konserwacja)</td><td>Teklad Global</td><td>2916</td><td>Pokarm dla myszy bez fitoestrogenów</td></tr><tr><td>Test immunoenzymatyczny</td><td>testosteronu Calbiotech</td><td>TE373S</td><td>Zestaw ELISA</td></tr><tr><td>testosteronu Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Do liczenia komórek</td></tr> <tr><td>i przeciwciała pierwszorzędowego alfa SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>Marker okołokanalikowy, rozcieńczenie 1:500</td></tr> <tr><td>i beta; Przeciwciało pierwotne kateniny</td><td>BD Biosciences</td><td>610154</td><td>Marker cytoplazmy Sertoliego, rozcieńczenie 1:100</td></tr></tbody></table>

pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Organoidy jąder dostarczają narzędzia do badania rozwoju jąder, spermatogenezy i endokrynologii in vitro. Opracowano kilka metod w celu stworzenia organoidów jąder. Wiele z tych metod opiera się na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu promowania składania tkanek de novo, jednak istnieją różnice między metodami pod względem morfologii biomimetycznej i funkcji tkanek. Co więcej, istnieje niewiele bezpośrednich porównań opublikowanych metod. W tym przypadku dokonuje się bezpośredniego porównania, badając różnice w protokołach generowania organoidów z dostarczonymi wynikami. Opisano cztery archetypowe metody generowania: (1) 2D ECM, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM free i (4) 3D ECM culture. Do oceny wytwarzania organoidów jąder wykorzystano trzy podstawowe punkty odniesienia. Są to samoorganizacja komórkowa, włączenie głównych typów komórek (Sertoli, Leydig, komórki rozrodcze i okołorurkowe) oraz odpowiednio podzielona architektura tkankowa. Spośród czterech badanych środowisk, hodowle 2D ECM i 3D wolne od ECM wygenerowały organoidy o wewnętrznej morfologii najbardziej zbliżonej do rodzimych jąder, w tym de novo podział komórek rurkowych i śródmiąższowych, rozwój struktur podobnych do kanalików i ustaloną długoterminową funkcję endokrynologiczną. We wszystkich badanych metodach wykorzystano niesortowane, pierwotne zawiesiny mysich komórek jąder i wykorzystano powszechnie dostępne zasoby hodowlane. Te techniki generowania organoidów jąder zapewniają wysoce dostępny i powtarzalny zestaw narzędzi dla inicjatyw badawczych dotyczących organogenezy i fizjologii jąder in vitro.

Tworzenie organoidów uznano za nieudane, jeśli komórki jądr nie zorganizowały się samoistnie w ciągu 72 h hodowli; jednak wszystkie przedstawione tutaj metody prowadzą do samoorganizacji w ciągu 24 h przy użyciu komórek mysich od osobników młodocianych (5 dpp). Niepowodzenie w generowaniu konstruktu biologicznego objawiało się utrzymywaniem komórek w stanie wolnej zawiesiny (kolumna 0 h na Rysunku 1) nawet po przedłużonej hodowli (72 h). W przypadku braku samoorganizacji tkankowej wszelkie w...

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Protokoły te umożliwiają użytkownikowi wytworzenie dużej liczby strukturalnie mimetycznych i endokrynologicznych funkcjonalnych organoidów jąder zarówno w środowiskach wolnych od ECM, jak i DCM w warunkach hodowli 2D lub 3D. Techniki te są wysoce powtarzalne, łatwe do zastosowania w standardowych warunkach laboratoriów biologicznych i wykorzystują tylko powszechnie używane narzędzia i materiały. Organoidy jąder są nowym narzędziem do symulacji spermatogenezy i endokrynologii rozrodu in vitro, a pewnego dnia mogą umożliwić badanie gametogenezy in vitro.Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy na wznak na macie preparacyjnej i wysterylizowania brzucha 70% etanolem. Owiń skórę dolnej części brzucha kleszczami i otwórz ją nożyczkami. Zlokalizuj jądra w dolnej lewej i prawej pachwinowej części brzucha i przetnij ich połączenia z nasieniowodami i zakotwiczoną tkanką łączną.Następnie podnieś całe jądra ze zwierzęcia. Umieść go na szalce Petriego ze wstępnie zrównoważonym BM. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na jednym końcu każdego jądra za pomocą małych nożyczek do mikropreparacji lub delikatnie rozrywając dwoma cienkimi kleszczami. Trzymając jądro od przeciwnego końca nacięcia, delikatnie ściśnij je drobnymi kleszczami i pchnij zamaszystym ruchem w kierunku otworu w tunice, co uwolni tkankę jądra jako jeden spójny kawałek.Pokrój tkankę na mniejsze kawałki. Umieść kawałki w jednym mililitrze wstępnie ciepłego roztworu dysocjacyjnego i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji delikatnie rozcierać kawałki jąder 50 razy za pomocą pipety P1000.Upewnij się, że kanaliki oddzielają się od siebie i od tkanki śródmiąższowej. Jeśli pozostaną grudki, inkubuj przez dodatkowe pięć minut i ponownie rozcieraj. Dodać 33 mikrolitry roztworu podstawowego hialuronidazy na jeden mililitr mieszaniny dysocjacyjnej.Następnie rozcierać 50 razy pipetą P1000 i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji należy go 50 razy rozcierać pipetą P200. Po upewnieniu się, że nie ma widocznych kanalików ani grudek komórek, należy wygasić enzymy dysocjacyjne, dodając FBS do 10% całkowitej objętości próbki i kilkakrotnie rozcierać ją pipetą P200.Zwilż środek sitka o średnicy 40 mikrometrów pożywką i odessaj go, a następnie dodaj próbkę do wstępnie zwilżonego sitka i przefiltruj ją, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Odwirować zawiesinę w ilości 100 g przez siedem minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym BM. Policz żywe komórki na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego, a następnie odwiruj je ponownie i ponownie zawieś w świeżym BM. W przypadku hodowli 2D bez ECM zawiesiny jednokomórkowe należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach czterodołkowych i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza.W przypadku hodowli 2D ECM należy dozować 100 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego jeden do jednego podłoża z matrycą zewnątrzkomórkową do czterodołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że żel zakrywa dno naczynia. Umieścić szkiełko w inkubatorze na co najmniej 30 minut, aby umożliwić ECM polimeryzację w żel, a następnie dodać zawiesinę komórek na wierzch. Aby uzyskać kulturę 3D wolną od ECM, umieść agarozowe szalki Petriego 3D w 24-dołkowej naczyniu hodowlanym i przykryj je jednym mililitrem BM. Pozwól szalkom zrównoważyć się w BM przez co najmniej 30 minut w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć BM i powtórz równowagę jeszcze raz z jednym mililitrem świeżego BM. Usuń cały BM ze studzienki i dozuj 200 mikrolitrów świeżego BM wokół, ale nie wewnątrz środkowego wgłębienia szalki Petriego 3D, a następnie zbierz pozostały BM z wnętrza środkowego wgłębienia do wysiewu komórek wkładki mikrodołkowej.Dozuj zawiesinę jednokomórkową do środkowego wgłębienia i delikatnie rozcieraj w górę iw dół. Umieść naczynie w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia hodowli. Następnego dnia powoli i ostrożnie usuń istniejące pożywki z okolic agarozowej szalki Petriego 3D i zastąp ją jednym mililitrem świeżego BM. Organoidy powinny były zagęścić się przez noc, pozwalając im odpocząć na dnie.W przypadku hodowli 3D ECM należy przygotować zawiesinę jednokomórkową, łącząc równe części zawiesiny komórek w BM z rozmrożonym na zimno ECM. Zmiksuj kilka razy, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszany. Następnie natychmiast dozuj mieszaninę do czterodołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że pokrywa ona całe dno płytki.Inkubować szkiełka w komorze w temperaturze 35 stopni Celsjusza i pozostawić jej zawartość do polimeryzacji przez co najmniej 30 minut. Po polimeryzacji dodaj 500 mikrolitrów BM na wierzch kultury. Hodowla wszystkich typów modeli organoidów w temperaturze 35 stopni Celsjusza.W przypadku wszystkich typów kultur należy wymieniać połowę pożywek na świeże BM co dwa dni. Protokół ten został wykorzystany do uzyskania generowania organoidów w ciągu 24 godzin przy użyciu młodzieńczych mysich komórek jąder. Pomyślnie wygenerowane tkanki były początkowo obserwowane jako klastry komórek 3D.W środowiskach ECM klastry komórek posiadały wyraźne marginesy między klastrem a otaczającym je środowiskiem. Zaobserwowano również, że klastry komórek migrują przez ECM i łączą się ze sobą. Hodowla 3D ECM wymagała znacznie więcej czasu na złożenie struktur de novo niż wszystkie inne metody hodowli.A kultura 3D wolna od ECM wytworzyła największe skupiska z pojedynczym dużym i zwartym skupiskiem w każdym dołku trójwymiarowej agarozowej szalki Petriego. Aby ocenić, czy modele organoidów przypominają tkankę natywną, konstrukty biologiczne zbadano pod kątem markerów specyficznych dla komórki i zwizualizowano za pomocą immunofluorescencji. Metody 2D ECM i 3D wolne od ECM pozwoliły uzyskać organoidy o wewnętrznej morfologii wysoce naśladującej podział jąder.Przeprowadzono długoterminową analizę organoidów zmontowanych w 3D bez ECM. Organoidy hodowano przez 14 dni, a następnie badano pod kątem markerów specyficznych dla komórek i struktury. Zaobserwowano struktury kanalikowate.Organoidy 3D wolne od ECM badano również pod kątem funkcji endokrynologicznych w 12-tygodniowej hodowli ze stymulacją gonadotropin. Testosteron i inhibina B zostały oznaczone ilościowo z pożywki kondycjonowanej organoidami. Po 12 tygodniach gonadotropiny zostały usunięte na 48 godzin, powodując zmniejszenie stężenia testosteronu i inhibiny B.Kiedy gonadotropiny zostały zwrócone, stężenie obu hormonów znacznie wzrosło, wykazując prawidłową reakcję hormonalną. Montaż organoidów wykorzystuje autonomiczne zachowanie żywotnych niedojrzałych komórek jąder. Kreatywne eksperymenty można łatwo opracować przy użyciu niestandardowych sortowanych komórek lub hybrydowych mieszanek komórek.Po wysiewie komórek, obrazowanie wideo na żywo lub obrazowanie poklatkowe może być wykorzystane do ilościowego określenia samoorganizacji organoidów. Z różnych kultur można pobrać organoidy i pożywkę do analiz histologicznych i testów aminowych.

extra-cellular-matrix-based-extra-cellular-matrix-free-generation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Tutaj prezentujemy protokół powtarzalnego generowania organoidów jąder świń z architekturą tkanek specyficzną dla jąder przy użyciu dostępnego na rynku systemu hodowli mikrostudzienek.

Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Fibroblasty wyizolowane z serca dorosłego człowieka zostały wyhodowane do zbiegu na naczyniach pokrytych żelatyną, aby wytworzyć specyficzną dla mięśnia sercowego matrycę zewnątrzkomórkową. Po decelularyzacji substrat ten może być wykorzystany do hodowli i badania innych komórek serca oraz interakcji komórka-macierz.

Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Poznaj metody wytwarzania mysich organoidów jądrowych w warunkach 2D i 3D z ECM oraz bez ECM. Techniki te umożliwiają badanie spermatogenezy i endokrynologii rozrodczej in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Przeglądaj więcej filmów