Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Protokoły te umożliwiają użytkownikowi wytworzenie dużej liczby strukturalnie mimetycznych i endokrynologicznych funkcjonalnych organoidów jąder zarówno w środowiskach wolnych od ECM, jak i DCM w warunkach hodowli 2D lub 3D. Techniki te są wysoce powtarzalne, łatwe do zastosowania w standardowych warunkach laboratoriów biologicznych i wykorzystują tylko powszechnie używane narzędzia i materiały. Organoidy jąder są nowym narzędziem do symulacji spermatogenezy i endokrynologii rozrodu in vitro, a pewnego dnia mogą umożliwić badanie gametogenezy in vitro.

Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy na wznak na macie preparacyjnej i wysterylizowania brzucha 70% etanolem. Owiń skórę dolnej części brzucha kleszczami i otwórz ją nożyczkami. Zlokalizuj jądra w dolnej lewej i prawej pachwinowej części brzucha i przetnij ich połączenia z nasieniowodami i zakotwiczoną tkanką łączną.

Następnie podnieś całe jądra ze zwierzęcia. Umieść go na szalce Petriego ze wstępnie zrównoważonym BM. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na jednym końcu każdego jądra za pomocą małych nożyczek do mikropreparacji lub delikatnie rozrywając dwoma cienkimi kleszczami. Trzymając jądro od przeciwnego końca nacięcia, delikatnie ściśnij je drobnymi kleszczami i pchnij zamaszystym ruchem w kierunku otworu w tunice, co uwolni tkankę jądra jako jeden spójny kawałek.

Pokrój tkankę na mniejsze kawałki. Umieść kawałki w jednym mililitrze wstępnie ciepłego roztworu dysocjacyjnego i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji delikatnie rozcierać kawałki jąder 50 razy za pomocą pipety P1000.

Upewnij się, że kanaliki oddzielają się od siebie i od tkanki śródmiąższowej. Jeśli pozostaną grudki, inkubuj przez dodatkowe pięć minut i ponownie rozcieraj. Dodać 33 mikrolitry roztworu podstawowego hialuronidazy na jeden mililitr mieszaniny dysocjacyjnej.

Następnie rozcierać 50 razy pipetą P1000 i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji należy go 50 razy rozcierać pipetą P200. Po upewnieniu się, że nie ma widocznych kanalików ani grudek komórek, należy wygasić enzymy dysocjacyjne, dodając FBS do 10% całkowitej objętości próbki i kilkakrotnie rozcierać ją pipetą P200.

Zwilż środek sitka o średnicy 40 mikrometrów pożywką i odessaj go, a następnie dodaj próbkę do wstępnie zwilżonego sitka i przefiltruj ją, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Odwirować zawiesinę w ilości 100 g przez siedem minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym BM. Policz żywe komórki na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego, a następnie odwiruj je ponownie i ponownie zawieś w świeżym BM. W przypadku hodowli 2D bez ECM zawiesiny jednokomórkowe należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach czterodołkowych i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza.

W przypadku hodowli 2D ECM należy dozować 100 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego jeden do jednego podłoża z matrycą zewnątrzkomórkową do czterodołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że żel zakrywa dno naczynia. Umieścić szkiełko w inkubatorze na co najmniej 30 minut, aby umożliwić ECM polimeryzację w żel, a następnie dodać zawiesinę komórek na wierzch. Aby uzyskać kulturę 3D wolną od ECM, umieść agarozowe szalki Petriego 3D w 24-dołkowej naczyniu hodowlanym i przykryj je jednym mililitrem BM. Pozwól szalkom zrównoważyć się w BM przez co najmniej 30 minut w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza, a następnie wyrzuć BM i powtórz równowagę jeszcze raz z jednym mililitrem świeżego BM. Usuń cały BM ze studzienki i dozuj 200 mikrolitrów świeżego BM wokół, ale nie wewnątrz środkowego wgłębienia szalki Petriego 3D, a następnie zbierz pozostały BM z wnętrza środkowego wgłębienia do wysiewu komórek wkładki mikrodołkowej.

Dozuj zawiesinę jednokomórkową do środkowego wgłębienia i delikatnie rozcieraj w górę iw dół. Umieść naczynie w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia hodowli. Następnego dnia powoli i ostrożnie usuń istniejące pożywki z okolic agarozowej szalki Petriego 3D i zastąp ją jednym mililitrem świeżego BM. Organoidy powinny były zagęścić się przez noc, pozwalając im odpocząć na dnie.

W przypadku hodowli 3D ECM należy przygotować zawiesinę jednokomórkową, łącząc równe części zawiesiny komórek w BM z rozmrożonym na zimno ECM. Zmiksuj kilka razy, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszany. Następnie natychmiast dozuj mieszaninę do czterodołkowego szkiełka komorowego, upewniając się, że pokrywa ona całe dno płytki.

Inkubować szkiełka w komorze w temperaturze 35 stopni Celsjusza i pozostawić jej zawartość do polimeryzacji przez co najmniej 30 minut. Po polimeryzacji dodaj 500 mikrolitrów BM na wierzch kultury. Hodowla wszystkich typów modeli organoidów w temperaturze 35 stopni Celsjusza.

W przypadku wszystkich typów kultur należy wymieniać połowę pożywek na świeże BM co dwa dni. Protokół ten został wykorzystany do uzyskania generowania organoidów w ciągu 24 godzin przy użyciu młodzieńczych mysich komórek jąder. Pomyślnie wygenerowane tkanki były początkowo obserwowane jako klastry komórek 3D.

W środowiskach ECM klastry komórek posiadały wyraźne marginesy między klastrem a otaczającym je środowiskiem. Zaobserwowano również, że klastry komórek migrują przez ECM i łączą się ze sobą. Hodowla 3D ECM wymagała znacznie więcej czasu na złożenie struktur de novo niż wszystkie inne metody hodowli.

A kultura 3D wolna od ECM wytworzyła największe skupiska z pojedynczym dużym i zwartym skupiskiem w każdym dołku trójwymiarowej agarozowej szalki Petriego. Aby ocenić, czy modele organoidów przypominają tkankę natywną, konstrukty biologiczne zbadano pod kątem markerów specyficznych dla komórki i zwizualizowano za pomocą immunofluorescencji. Metody 2D ECM i 3D wolne od ECM pozwoliły uzyskać organoidy o wewnętrznej morfologii wysoce naśladującej podział jąder.

Przeprowadzono długoterminową analizę organoidów zmontowanych w 3D bez ECM. Organoidy hodowano przez 14 dni, a następnie badano pod kątem markerów specyficznych dla komórek i struktury. Zaobserwowano struktury kanalikowate.

Organoidy 3D wolne od ECM badano również pod kątem funkcji endokrynologicznych w 12-tygodniowej hodowli ze stymulacją gonadotropin. Testosteron i inhibina B zostały oznaczone ilościowo z pożywki kondycjonowanej organoidami. Po 12 tygodniach gonadotropiny zostały usunięte na 48 godzin, powodując zmniejszenie stężenia testosteronu i inhibiny B.

Kiedy gonadotropiny zostały zwrócone, stężenie obu hormonów znacznie wzrosło, wykazując prawidłową reakcję hormonalną. Montaż organoidów wykorzystuje autonomiczne zachowanie żywotnych niedojrzałych komórek jąder. Kreatywne eksperymenty można łatwo opracować przy użyciu niestandardowych sortowanych komórek lub hybrydowych mieszanek komórek.

Po wysiewie komórek, obrazowanie wideo na żywo lub obrazowanie poklatkowe może być wykorzystane do ilościowego określenia samoorganizacji organoidów. Z różnych kultur można pobrać organoidy i pożywkę do analiz histologicznych i testów aminowych.