Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych
May 16th, 2020
Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.
Jest to pierwszy protokół generowania torbieli żółciowych, zapewniający systematyczną analizę, która pozwala ocenić powstawanie, wydajność i rozmiar torbieli w czasie. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę powstawania torbieli nabłonkowych i umożliwia ocenę tego procesu w funkcji rodzaju komórek nabłonkowych lub hydrożelu. Ponieważ możliwości terapeutyczne w zaburzeniach dróg żółciowych są ograniczone, protokół ten otwiera drzwi do standaryzacji badań nad lekami, identyfikacji normalnych celów terapeutycznych i zrozumienia mechanizmów choroby.
Ta prosta metoda pozwala odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące mechanizmów powstawania nowych informacji w dziedzinie bioinżynierii struktur rurowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przez noc rozmrozić odpowiedni roztwór hydrożelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wstępnie schłodzić końcówki pipet oraz szkiełko z ośmioma dostojnikami w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść hydrożel i szkiełko z ośmioma komorami na lodzie i dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, normalnego kompletnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 500 mikrolitrów 40% roztworu hydrożelu.
Następnie użyj zimnych końcówek pipet, aby dodać 50 mikrolitrów roztworu hydrożelu do środka każdej studzienki szkiełka komory i użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić roztwór na całej powierzchni dna studzienki tak równomiernie, jak to możliwe, bez pęcherzyków. Aby przygotować komórki do eksperymentu, podczas gdy hydrożel polimeryzuje, umyj komórki z 70% zlewającej się normalnej hodowli cholangiocytów szczura z wstępnie podgrzanym PBS i inkubuj komórki z pięcioma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego PBS przez 20 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąpić PBS jednym mililitrem wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć do 10 minut.
Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj reakcję za pomocą czterech mililitrów wstępnie podgrzanej, kompletnej, normalnej pożywki dla cholangiocytów szczura i przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Następnie ponownie zawiesić granulkę w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki w celu zliczenia. Aby wytworzyć torbiele, dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, kompletnego normalnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 1 600 mikrolitrów 80% roztworu hydrożelu na lodzie i rozcieńczyć komórki do pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr zimnego, kompletnego normalnego stężenia cholangiocytów szczura w 1 600 mikrolitrach pożywki.
Natychmiast wymieszaj roztwory komórek i hydrożelu i dodaj 400 mikrolitrów komórek do każdej studzienki szkiełka komorowego pokrytego hydrożelem, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Aby zapewnić uzyskanie powtarzalnych i znaczących wyników, należy ostrożnie obchodzić się z hydrożelem i dokładnie wymieszać początkowy roztwór wodoru w komórce, aby uzyskać jednorodny roztwór. Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, umieść szkiełko w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Po dwóch dniach w hodowli usunąć 250 mikrolitrów pożywki z jednego rogu każdej studzienki, uważając, aby nie wypłukać hydrożelu, i powoli zastąp odrzucony supernatant 250 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej. W przypadku obrazowania torbieli, w odpowiednim dniu posiewu, należy wybrać obiektyw 10 X w mikroskopie z kontrastem fazowym wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji obrazu, włączyć białą lampę i wybrać opcję obrazowania w jasnym polu. Wybierz odtwórz, aby włączyć kamerę i ustawić ostrość na polu torbieli.
Ustaw czas ekspozycji i otwórz okno folderu automatycznego przechwytywania, aby umożliwić automatyczne zapisywanie obrazów. Otwórz okno przechwytywania serii Z, zresetuj pozycję domyślną i użyj Z, aby zdefiniować górną i dolną płaszczyznę stosu Z, dostosowując krok Z w zależności od celu i poziomu rozdzielczości. Następnie kliknij przycisk Uruchom teraz, aby uruchomić pobieranie.
Po zobrazowaniu otwórz stos Z na Fidżi. Aby zduplikować stos, kliknij pozycję Obraz, Duplikuj i Zduplikuj stos. Aby utworzyć projekcję o minimalnej intensywności ze zduplikowanego stosu, w menu obrazu wybierz opcję Stosy i Projekt Z.
Wybierz minimalną intensywność dla typu projekcji i kliknij przycisk OK. Aby odjąć tło od projekcji, w menu procesu wybierz opcję odejmij tło i wybierz 500 pikseli promienia toczącej się kuli i jasnego tła, aby torbiele były bardziej skontrastowane niż tło. Aby zmierzyć przybliżoną średnicę torbieli, powiększ docelową torbiel, wybierz narzędzie linii prostej i naciśnij przycisk T na klawiaturze.
Narysuj linię w poprzek średnicy każdej torbieli na końcowej projekcji. Następny obszar zainteresowania utworzony dla każdej torbieli zostanie dodany do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli kliknij okno Z-stack, aby je zaznaczyć, a następnie kliknij pokaż wszystko, aby zobaczyć zliczone torbiele.
Przesuń kursor wzdłuż stosu Z, aby sprawdzić, czy wszystkie torbiele zostały policzone na każdym obrazie, dodając w razie potrzeby nowe torbiele do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli wybierz zestaw interesujących Cię regionów, a następnie kliknij więcej i zapisz, aby zapisać dane. Aby określić rozmiar każdej torbieli, przy jednoczesnym wybraniu obszarów zainteresowania, kliknij przycisk Zmierz.
Pojawi się okno z listą każdej torbieli i jej szacowanym rozmiarem. Następnie zapisz dane w formacie CSV. Jak wykazano, rejestrowanie liczby torbieli i ich odpowiednich rozmiarów w czasie pozwala na analizę ewolucji powstawania i wzrostu torbieli.
Żywotność początkowej populacji komórek i 10-dniowych torbieli można ocenić za pomocą barwienia żywych/martwych. Martwe komórki stanowią mniej niż 3% populacji komórek w dniu 10 i są w większości zlokalizowane poza torbielą jako izolowane komórki lub jako część małych agregatów, chociaż w niektórych dużych torbielach obserwuje się nagromadzenie martwiczych szczątków komórek. Inkubacja z dioctanem fluoresceiny i Hoechstem pozwala na ocenę powstawania i wydzielania fluoresceiny od podstawy do wierzchołkowej przestrzeni świetlnej.
Warto zauważyć, że wydzielanie fluoresceiny jest hamowane przez wstępne traktowanie inhibitorem oporności wielolekowej, co wskazuje, że akumulacja fluorescencyjnej fluoresceiny w świetle jest spowodowana wydzielaniem przez transporter wielolekooporny, a nie wyciekiem z przestrzeni międzykomórkowej. Barwienie pod kątem ekspresji E-kadheryny ujawnia, że normalne cholangiocyty szczura utrzymują swój fenotyp nabłonkowy w hydrożelu przez co najmniej 10 dni. Podczas przygotowywania torbieli do oceny immunofluorescencji, utrzymanie albuminy surowicy bydlęcej na poziomie 0,1% lub mniej podczas nasycenia jest kluczem do utrzymania integralności torbieli, ponieważ wyższe stężenia powodują retrakcję torbieli i zapadnięcie się światła.
Hydrożel przez noc, rozmrażanie, zapis końcówki pipety i szkiełka komory, praca na lodzie i równomierne rozprowadzanie mieszaniny hydrożelu o jednorodnych komórkach na szkiełku z hodowlą mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Metoda ta może być stosowana do generowania torbieli z innych komórek nabłonka lub hydrożeli, co pozwala na porównania w celu lepszego zrozumienia polaryzacji nabłonka. Ta metoda ilościowa może być stosowana do badania wpływu leków lub mutacji genetycznych na czynność dróg żółciowych i organogenezę.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę opartą na hydrożelu do generowania torbieli dróg żółciowych, ułatwiającą badanie organogenezy w trójwymiarowych systemach komórkowych. Umożliwia systematyczną analizę formowania się torbieli, wydajności i wielkości w czasie.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Bioinżynieria
- Biologia komórki
Tło
- Zaburzenia dróg żółciowych mają ograniczone opcje terapeutyczne.
- Rozumienie formowania się torbieli może pomóc w identyfikacji celów terapeutycznych.
- 3D systemy komórkowe są istotne dla badania organogenezy.
- Ten protokół zwalcza bariery w 3D charakteryzacji.
Cel badania
- Aby ustalić standard badań nad lekami związanych z torbielami dróg żółciowych.
- Aby ocenić formowanie się torbieli jako funkcję komórek nabłonkowych lub typu hydrożelu.
- Aby zrozumieć mechanizmy chorobowe związane z zaburzeniami dróg żółciowych.
Stosowane metody
- Odtapianie roztworu hydrożelu w 4°C.
- Wstępne chłodzenie końcówek pipet i szkieletów komorowych do -20°C na noc.
- Łączenie hydrożelu z medium cholangiocytów w celu stworzenia 40% roztworu hydrożelu.
- Ocenianie formowania się torbieli ilościowo w czasie.
Główne wyniki
- Skuteczna generacja torbieli dróg żółciowych przy użyciu metody hydrożelu.
- Ilościowa ocena wydajności i wielkości formowania się torbieli.
- Wgląd w funkcjonalność torbieli w oparciu o typ komórek i hydrożel.
- Potencjał do rozwiązywania ważnych pytań w bioinżynierii.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę do generowania torbieli.
- Otwiera drogi dla badań nad zaburzeniami dróg żółciowych i rozwoju terapii.
- Standaryzacja metod może poprawić zrozumienie mechanizmów chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized, quantitative assessment of cyst formation efficiency and growth kinetics in 3D cholangiocyte cultures, addressing a critical gap in reproducible biliary organoid modeling. By capturing vertical heterogeneity and functional readouts over time, it supports mechanistic de-risking in biliary target validation and preclinical disease modeling. The method enhances predictive confidence for evaluating epithelial polarity and secretory function, facilitating cross-system comparisons in drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying cyst formation as a function of epithelial cell type or hydrogel composition.
- Operational Value: Provides reproducible kinetics data to support functional target validation and pathway clarification in biliary biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating comparable efficiency metrics across matrices and cell lines for de-risking mechanistic assumptions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems with quantifiable outputs for downstream compound screening in biliary disease models.
- Reproducibility: Uses Z-stack analysis to minimize heterogeneity from hydrogel polymerization, improving data consistency across experiments.
- Scalability: Compatible with multi-well chamber slides, enabling parallel testing of drug or genetic perturbations on cyst formation and size.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cholangiocyte polarization and secretory function, aligning with pathophysiological mechanisms in biliary disorders.
- Translational Continuity: Links discovery-stage cyst formation metrics to preclinical validation via functional assays like Fluorescein secretion and E-cadherin staining.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables evaluation of drug effects on biliary function and organogenesis, supporting go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, providing standardized 3D readouts for biliary epithelial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying cyst formation efficiency over a 10-day time course.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cyst populations with measurable size and polarity outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables comparison of cyst number, diameter, and secretory function across conditions using Z-stack imaging and minimum intensity projections.
- Translational Research: Connects in vitro cyst maturation to preclinical relevance through functional readouts like apical-basal Fluorescein transport.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing epithelial cell behaviors across hydrogels, cell types, and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial polarization and cyst formation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled hydrogel handling, Z-stack quantification, and optimized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage go/no-go decisions based on quantitative biliary organoid performance.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of biliary targets through comparable, time-resolved cyst formation and growth data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, hydrogel handling, and confocal or widefield microscopy with Z-stacking capability.
- Dependent on temperature-controlled equipment for hydrogel polymerization and pre-cooled tools to ensure uniformity.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (Z-step, exposure, projection type) for consistent cyst quantification.
- Requires adaptation of immunostaining protocols, particularly limiting BSA to 0.1% or less to prevent cyst collapse during fluorescence labeling.
- Limited by the need for careful medium exchange to avoid hydrogel disruption during long-term culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
Chamber Slide Preparation
1:59
Normal Rat Cholangiocyte Preparation
3:05
Cyst Generation
4:29
Cyst Imaging
5:29
Image Processing
6:14
Cyst Quantification
7:20
Results: Representative Cyst Formation, Viability, Functionality, and Polarity Analyses
9:03
Conclusion
