Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Jest to pierwszy protokół generowania torbieli żółciowych, zapewniający systematyczną analizę, która pozwala ocenić powstawanie, wydajność i rozmiar torbieli w czasie. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę powstawania torbieli nabłonkowych i umożliwia ocenę tego procesu w funkcji rodzaju komórek nabłonkowych lub hydrożelu. Ponieważ możliwości terapeutyczne w zaburzeniach dróg żółciowych są ograniczone, protokół ten otwiera drzwi do standaryzacji badań nad lekami, identyfikacji normalnych celów terapeutycznych i zrozumienia mechanizmów choroby.

Ta prosta metoda pozwala odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące mechanizmów powstawania nowych informacji w dziedzinie bioinżynierii struktur rurowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przez noc rozmrozić odpowiedni roztwór hydrożelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wstępnie schłodzić końcówki pipet oraz szkiełko z ośmioma dostojnikami w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść hydrożel i szkiełko z ośmioma komorami na lodzie i dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, normalnego kompletnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 500 mikrolitrów 40% roztworu hydrożelu.

Następnie użyj zimnych końcówek pipet, aby dodać 50 mikrolitrów roztworu hydrożelu do środka każdej studzienki szkiełka komory i użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić roztwór na całej powierzchni dna studzienki tak równomiernie, jak to możliwe, bez pęcherzyków. Aby przygotować komórki do eksperymentu, podczas gdy hydrożel polimeryzuje, umyj komórki z 70% zlewającej się normalnej hodowli cholangiocytów szczura z wstępnie podgrzanym PBS i inkubuj komórki z pięcioma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego PBS przez 20 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąpić PBS jednym mililitrem wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć do 10 minut.

Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj reakcję za pomocą czterech mililitrów wstępnie podgrzanej, kompletnej, normalnej pożywki dla cholangiocytów szczura i przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Następnie ponownie zawiesić granulkę w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki w celu zliczenia. Aby wytworzyć torbiele, dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, kompletnego normalnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 1 600 mikrolitrów 80% roztworu hydrożelu na lodzie i rozcieńczyć komórki do pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr zimnego, kompletnego normalnego stężenia cholangiocytów szczura w 1 600 mikrolitrach pożywki.

Natychmiast wymieszaj roztwory komórek i hydrożelu i dodaj 400 mikrolitrów komórek do każdej studzienki szkiełka komorowego pokrytego hydrożelem, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Aby zapewnić uzyskanie powtarzalnych i znaczących wyników, należy ostrożnie obchodzić się z hydrożelem i dokładnie wymieszać początkowy roztwór wodoru w komórce, aby uzyskać jednorodny roztwór. Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, umieść szkiełko w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po dwóch dniach w hodowli usunąć 250 mikrolitrów pożywki z jednego rogu każdej studzienki, uważając, aby nie wypłukać hydrożelu, i powoli zastąp odrzucony supernatant 250 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej. W przypadku obrazowania torbieli, w odpowiednim dniu posiewu, należy wybrać obiektyw 10 X w mikroskopie z kontrastem fazowym wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji obrazu, włączyć białą lampę i wybrać opcję obrazowania w jasnym polu. Wybierz odtwórz, aby włączyć kamerę i ustawić ostrość na polu torbieli.

Ustaw czas ekspozycji i otwórz okno folderu automatycznego przechwytywania, aby umożliwić automatyczne zapisywanie obrazów. Otwórz okno przechwytywania serii Z, zresetuj pozycję domyślną i użyj Z, aby zdefiniować górną i dolną płaszczyznę stosu Z, dostosowując krok Z w zależności od celu i poziomu rozdzielczości. Następnie kliknij przycisk Uruchom teraz, aby uruchomić pobieranie.

Po zobrazowaniu otwórz stos Z na Fidżi. Aby zduplikować stos, kliknij pozycję Obraz, Duplikuj i Zduplikuj stos. Aby utworzyć projekcję o minimalnej intensywności ze zduplikowanego stosu, w menu obrazu wybierz opcję Stosy i Projekt Z.

Wybierz minimalną intensywność dla typu projekcji i kliknij przycisk OK. Aby odjąć tło od projekcji, w menu procesu wybierz opcję odejmij tło i wybierz 500 pikseli promienia toczącej się kuli i jasnego tła, aby torbiele były bardziej skontrastowane niż tło. Aby zmierzyć przybliżoną średnicę torbieli, powiększ docelową torbiel, wybierz narzędzie linii prostej i naciśnij przycisk T na klawiaturze.

Narysuj linię w poprzek średnicy każdej torbieli na końcowej projekcji. Następny obszar zainteresowania utworzony dla każdej torbieli zostanie dodany do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli kliknij okno Z-stack, aby je zaznaczyć, a następnie kliknij pokaż wszystko, aby zobaczyć zliczone torbiele.

Przesuń kursor wzdłuż stosu Z, aby sprawdzić, czy wszystkie torbiele zostały policzone na każdym obrazie, dodając w razie potrzeby nowe torbiele do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli wybierz zestaw interesujących Cię regionów, a następnie kliknij więcej i zapisz, aby zapisać dane. Aby określić rozmiar każdej torbieli, przy jednoczesnym wybraniu obszarów zainteresowania, kliknij przycisk Zmierz.

Pojawi się okno z listą każdej torbieli i jej szacowanym rozmiarem. Następnie zapisz dane w formacie CSV. Jak wykazano, rejestrowanie liczby torbieli i ich odpowiednich rozmiarów w czasie pozwala na analizę ewolucji powstawania i wzrostu torbieli.

Żywotność początkowej populacji komórek i 10-dniowych torbieli można ocenić za pomocą barwienia żywych/martwych. Martwe komórki stanowią mniej niż 3% populacji komórek w dniu 10 i są w większości zlokalizowane poza torbielą jako izolowane komórki lub jako część małych agregatów, chociaż w niektórych dużych torbielach obserwuje się nagromadzenie martwiczych szczątków komórek. Inkubacja z dioctanem fluoresceiny i Hoechstem pozwala na ocenę powstawania i wydzielania fluoresceiny od podstawy do wierzchołkowej przestrzeni świetlnej.

Warto zauważyć, że wydzielanie fluoresceiny jest hamowane przez wstępne traktowanie inhibitorem oporności wielolekowej, co wskazuje, że akumulacja fluorescencyjnej fluoresceiny w świetle jest spowodowana wydzielaniem przez transporter wielolekooporny, a nie wyciekiem z przestrzeni międzykomórkowej. Barwienie pod kątem ekspresji E-kadheryny ujawnia, że normalne cholangiocyty szczura utrzymują swój fenotyp nabłonkowy w hydrożelu przez co najmniej 10 dni. Podczas przygotowywania torbieli do oceny immunofluorescencji, utrzymanie albuminy surowicy bydlęcej na poziomie 0,1% lub mniej podczas nasycenia jest kluczem do utrzymania integralności torbieli, ponieważ wyższe stężenia powodują retrakcję torbieli i zapadnięcie się światła.

Hydrożel przez noc, rozmrażanie, zapis końcówki pipety i szkiełka komory, praca na lodzie i równomierne rozprowadzanie mieszaniny hydrożelu o jednorodnych komórkach na szkiełku z hodowlą mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Metoda ta może być stosowana do generowania torbieli z innych komórek nabłonka lub hydrożeli, co pozwala na porównania w celu lepszego zrozumienia polaryzacji nabłonka. Ta metoda ilościowa może być stosowana do badania wpływu leków lub mutacji genetycznych na czynność dróg żółciowych i organogenezę.