Name: Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę generowania torbieli dróg żółciowych w hydrogelu do ilościowej analizy formowania i wielkości cyst. Protokół umożliwia standaryzację badań nad lekami i zrozumienie mechanizmów chorobowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Nicholasowi LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Stany Zjednoczone), który uprzejmie dostarczył linię komórkową NRC.
Ta praca otrzymała wsparcie finansowe zarówno od programu iLite RHU (grant ANR-16-RHUS-0005), jak i DHU Hepatinov.
Dziękujemy Isabelle Garcin i Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay za wsparcie w zakresie obrazowania.

<ol><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Martín-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArtym%2C+VV+%22Current+Procotols+in+Cell+Biology%22">Current Procotols in Cell Biology</a>. , Chapter 10 (Unit 10) (2010).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li>
<li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67(2015).</li>
<li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+GAG-matrices+to+promote+mammary+epithelial+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 112, 20-30 (2017).</li>
<li>Miroshnikova, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013(2011).</li>
<li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li>
<li>Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+3D+culture+in+Matrigel+microbeads+to+analyze+clonal+acinar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development.</a> Biomaterials. 52, 347-357 (2015).</li>
<li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads%3A+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (12), 70(2018).</li>
<li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiopathies+-+Towards+a+molecular+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Cholangiopathies - Towards a molecular understanding.</a> EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).</li>
<li>Loarca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+cholangioids+from+normal+and+diseased+human+cholangiocytes+as+an+in+vitro+model+to+study+primary+sclerosing+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis.</a> Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).</li>
<li>De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+and+the+biliary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine and the biliary tree.</a> Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).</li>
<li>Dianat, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+cholangiocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+and+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells.</a> Hepatology. 60, 700-714 (2014).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li>
<li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li>
<li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. 0 (0), (2019).</li>
<li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544(2019).</li>
<li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Annexin+V%2FPropidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).</li>
<li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li>
<li>Spirlì, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarity+of+Na%2B%2FH%2B+and+Cl-%2FHCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu zbadania organogenezy i utrzymania struktur komórkowych 3D modelowano różne tkanki, wykorzystując różne pochodzenie komórkowe, ale także różne rodzaje matryc zewnątrzkomórkowych, w tym syntetyczne hydrożele 8,9,10,21. Jednak ze względu na brak analizy ilościowej 3D, która pozwala na porównania metod pod względem tworzenia lub funkcjonalności organoidów ...

W ciągu ostatnich trzech dekad dziedzina badań in vitro rozwinęła się w kierunku systemów hodowli 3D. Pojawiło się wiele protokołów hodowli komórek w 3D jako sferoid lub agregatów w obecności lub braku rusztowania/matrycy, w kropli, podczas mieszania, w urządzeniach mikroprzepływowych lub floating1. Zastosowanie metod hodowli 3D udowodniło swoje zalety w porównaniu z hodowlami dwuwymiarowymi (2D), szczególnie w przypadku komórek nabłonkowych, które wykazały samoorganizację w struktury 3D, zwane torbielami lub acini. W tym przypadku komórki tworzą monowarstwę otaczającą światło, w której komórki uzyskują pełny fenotyp nabłonka z ulepszonymi specyficznymi funkcjami fizjologicznymi2.
Liczne badania przyczyniły się do opracowania metod tworzenia tych organoidów nabłonkowych w naturalnych matrycach. Pozwoliło to na rekapitulację in vivo interakcji komórka-komórka i komórka-mikrośrodowisko, aby uzyskać ustalenie i stabilność fenotypu nabłonka3,4,5,6,7. Ostatnio, a w szczególności w celu opracowania organoidów nadających się do przeszczepu i rozszyfrowania wymagań mikrośrodowiska do orkiestracji programu nabłonkowego, opracowano syntetyczne hydrożele w celu zwiększenia tworzenia nabłonkowych acini8,9,10. Niestety, badania te opierają się na danych jakościowych lub prezentują metody obliczeń wykorzystujące wewnętrzne odniesienia, takie jak stosunek torbieli do nietorbieli w płaszczyźnie 2D8,9,10. Wyklucza to jakiekolwiek porównanie różnych badań pod względem skuteczności, stabilności lub charakterystyki morfologicznej i fizjologicznej organoidów nabłonkowych.
Mikrokapsułkowanie komórek nabłonka w koralikach za pomocą urządzeń mikroprzepływowych pozwoliło na uzyskanie bardziej realistycznych wyników ilościowych i porównawczych. Korzystając z tej technologii, organoidy z różnych typów komórek zostały utworzone i zróżnicowane na podstawie morfologii między różnymi strukturami komórkowymi 3D11,12. Jednak technologia ta nie jest łatwa w obsłudze i wymaga użycia czystych pomieszczeń do produkcji urządzeń mikroprzepływowych. Technologia ta została opracowana dla kilku rodzajów hydrożeli, ale wymaga dostosowania technicznego do zastosowania do innych hydrożeli, co ogranicza jej wszechstronność. Dlatego większość badań mających na celu opracowanie organoidów nabłonkowych opiera się na osadzaniu komórek nabłonkowych w masie hydrożelowej. W tych metodach często pomija się wysoką niejednorodność struktury żelu i rozmieszczenia komórek w całej kulturze 3D. W związku z tym większość analiz odnosi się do pojedynczych obrazów 2D, które tylko w przybliżeniu reprezentują rozkład różnych obiektów komórkowych w całej objętości 3D.
Choroby wpływające na drogi żółciowe, takie jak rak dróg żółciowych, atrezja dróg żółciowych, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, między innymi, są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności. Z wyjątkiem przeszczepu wątroby, nie ma skutecznych metod leczenia tych schorzeń13. Wysiłki mające na celu zbadanie powstawania dróg żółciowych, przyczyn choroby i progresji pozwolą na opracowanie nowych terapii14.
Organotypowe modele dróg żółciowych torbieli, sferoidów lub struktur rurkowatych wykorzystujących normalne lub pochodzące od pacjenta, zróżnicowane lub pochodzące od progenitorów linie komórek cholangiocytów zostały opracowane15,16,17,18,19,20. Różne badania podsumowały polarność cholangiocytów, ekspresję markerów cholangiocytów, obecność rzęsek, zdolność wydzielniczą i reabsorpcyjną cholangiocytów oraz tworzenie i niedrożność światła; Wszystkie z nich reprezentują ważne cechy fenotypu, morfologii i funkcji cholangiocytów15,17,19. Inni donosili o utrzymywaniu się organoidów dróg żółciowych pochodzących od pacjentów przez długi okres czasu20. Niedawno badaliśmy rolę sygnałów biochemicznych i biofizycznych w organogenezie torbieli dróg żółciowych21. Co ważne, badano patogenezę atrezji dróg żółciowych w sferoidach i rurkach żółciowych7,22. Ponadto kluczowe cechy pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych, takie jak starzenie się cholangiocytów, wydzielanie cytokin prozapalnych, a także rekrutacja makrofagów, zostały z powodzeniem zbadane za pomocą sferoidów żółciowych15,20. Jednak nadal potrzebne są powtarzalne modele ilościowe 3D in vitro, które fizjologicznie modulują fenotyp cholangiocytów, fizjologię i mikrośrodowisko, na które można odpowiedzieć tymi pytaniami. Co więcej, tylko kilka publikacji podało skuteczność tworzenia torbieli21,23. Jest to ważny punkt do ustalenia, szczególnie podczas badania organogenezy, przyczyny choroby i korelacji odpowiedzi na leki z funkcją cholangiocytów i polaryzacją. Ponadto, ze względu na różnice w stosowanych rusztowaniach/matrycach w zależności od protokołu, trudno jest porównywać systemy. Aby rozwiązać te problemy, proponujemy ilościową, wiarygodną i uniwersalną metodę generowania torbieli żółciowych naśladujących tworzenie światła, polaryzację cholangiocytów i funkcję wydzielniczą cholangiocytów. Co ważne, przedstawiamy systematyczną analizę przeprowadzoną wzdłuż osi Z w poprzek żelu 3D podczas oceny w czasie, skuteczności tworzenia torbieli, rozmiaru, żywotności, polaryzacji i funkcjonalności. Ponadto użyliśmy naturalnego hydrożelu i normalnych cholangiocytów szczura (NRC), jako przykładu dla protokołu, ale inne naturalne lub syntetyczne hydrożele, a także komórki nabłonkowe mogą być używane do tworzenia struktur torbielowatych 3D.

<table><tbody><tr><td>10 &mikro; l- Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; l - Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro; l - Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l - Pipeta Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5-triiodo-L-tyroniny sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 3,4 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>VWR</td><td>20104-298</td><td>0,02N końcowy</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet barierowych aerozolowych 10 i mikro; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific 2707439</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 1000 i mikro; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707404</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet barierowych w aerozolu 200 i mikro; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific 2707430</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwmikotyczny (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie Ekstrakt</td></tr> z <tr><td>przysadki bydlęcej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13028-014</td><td>NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 30 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td>NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kolagen o wysokim stężeniu, ogon szczura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>354249</td><td>50 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 0,393 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331-020</td><td>NRC kompletne średnie stężenie końcowe = 1X</td></tr><tr><td>E-kadheryna Królik anty-Człowiek, Szczur, Poliklonalny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32178</td><td>Rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse TE300</td><td>Obrazowanie</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>NRC kompletny średni finał stężenie = 0,32 mM</td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>NRC complete medium stężenie końcowe = 5:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI (Podłoże montażowe)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 16% (W/V)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28906</td><td>4% (W/V)</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-064</td><td>1:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Aparat Hamamatsu (Aparat cyfrowy C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>obrazowanie</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155</td><td>5 &micro; g / ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowany krzyżowo kozi anty-królik, Alexa Fluor Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32733</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>ImageJ wersja 2.0.0-rc-69/1.52n</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51300-044</td><td>NRC pełne stężenie końcowe = rozcieńczenie</td></tr> <tr><td>1:100L-Glutamina (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>NRC kompletne stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Matrigel GFR (stężenie podstawowe 9,7 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>356231</td><td>4:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>NIS Elements wersja oprogramowania 4.50.00</td><td>Akwizycja i wyświetlanie obrazów</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Obiektywny Plan Fluor 10X/0,30 Ph1 DL (&infin;/1,2 WD 15,2)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>20 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Rodamina Phalloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>16,2 nM stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Zestaw Sir-Actin / Verapamil</td><td>Spirochrome</td><td>SC001</td><td>10 &micro; M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td>NRC pełne stężenie końcowe pożywki = 50 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Sterylne sitko komórkowe 40 i mikro; m (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety 10 ml (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety 5 ml (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 1,5 ml (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 15 ml (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7200886</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 50 ml (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>553913</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>5:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych 25cm2 (Falcon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>5:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%) czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>1X</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>5:10000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Witamina (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-037</td><td>NRC pełne średnie stężenie końcowe = 1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>&mu;-Slajd 8 Well ibiTreat, Ibidi</td><td>Clinisciences</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocyty, komórki nabłonkowe, które tworzą drogi żółciowe w wątrobie, nadzorują tworzenie i modyfikację żółci. W ciągu ostatnich dwudziestu lat, w kontekście chorób wątroby, pojawiły się trójwymiarowe (3D) modele oparte na cholangiocytach, takie jak torbiele, sferoidy lub struktury przypominające rurki, aby naśladować topologię tkanek w organogenezie, modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Struktury te uzyskano głównie poprzez zatopienie cholangiocytów w hydrożelu. Głównym celem było zbadanie samoorganizacji poprzez zajęcie się polaryzacją nabłonka, właściwościami funkcjonalnymi i morfologicznymi. Jednak bardzo niewiele badań koncentruje się na skuteczności tworzenia torbieli. W takim przypadku wydajność jest często określana ilościowo na podstawie obrazów pojedynczej płaszczyzny. Testy funkcjonalne i analiza strukturalna są wykonywane bez reprezentowania potencjalnej niejednorodności rozmieszczenia torbieli wynikającej z niejednorodności polimeryzacji hydrożelowej i skutków ubocznych. W związku z tym analiza ilościowa, gdy jest wykonywana, nie może być wykorzystywana do porównywania jednego artykułu z drugim. Co więcej, metodologia ta nie pozwala na porównanie potencjału wzrostu 3D różnych matryc i typów komórek. Ponadto nie ma wzmianki o eksperymentalnym rozwiązywaniu problemów związanych z torbielami immunologicznymi. W tym artykule przedstawiamy wiarygodną i uniwersalną metodę wykazania, że początkowa dystrybucja komórek jest związana z niejednorodną pionową dystrybucją powstawania torbieli. Komórki cholangiocytów osadzone w hydrożelu są poddawane analizie stosów Z wzdłuż głębokości hydrożelu w ciągu 10 dni. Dzięki tej metodzie uzyskuje się solidną kinetykę skuteczności tworzenia torbieli i wzrostu. Przedstawiono również metody oceny polarności torbieli i funkcji wydzielniczej. Na koniec podano dodatkowe wskazówki dotyczące optymalizacji protokołów barwienia immunologicznego w celu ograniczenia zapadania się torbieli do obrazowania. Podejście to można zastosować do innych badań 3D nad hodowlami komórkowymi, otwierając w ten sposób możliwości porównania jednego systemu z drugim.

Tworzenie i charakterystyka cyst 
Trójwymiarowe systemy hodowli komórkowej stanowią istotne narzędzie w badaniach nad organogenezą i modelowaniem chorób25. Niestety większość tych metod ma charakter jakościowy lub opiera się na wewnętrznej kwantyfikacji przeprowadzanej w jednej płaszczyźnie poprzez porównanie liczby cyst do liczby struktur niebędących cystami, w zmiennych i często nieokreślonych objętościach, co uniemożliwia porównanie wydajności tworzenia cyst pomiędzy różnymi...

Trójwymiarowe (3D) systemy komórkowe są istotnymi modelami do badania organogenezy. Zaproponowano metodę wytwarzania torbieli żółciowych opartą na hydrożelu i ich charakterystykę. Protokół ten odkrywa bariery w charakteryzacji 3D, dzięki prostej i niezawodnej metodzie oceny wydajności tworzenia torbieli, rozmiarów i testowania ich funkcjonalności.

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Jest to pierwszy protokół generowania torbieli żółciowych, zapewniający systematyczną analizę, która pozwala ocenić powstawanie, wydajność i rozmiar torbieli w czasie. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę powstawania torbieli nabłonkowych i umożliwia ocenę tego procesu w funkcji rodzaju komórek nabłonkowych lub hydrożelu. Ponieważ możliwości terapeutyczne w zaburzeniach dróg żółciowych są ograniczone, protokół ten otwiera drzwi do standaryzacji badań nad lekami, identyfikacji normalnych celów terapeutycznych i zrozumienia mechanizmów choroby.Ta prosta metoda pozwala odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące mechanizmów powstawania nowych informacji w dziedzinie bioinżynierii struktur rurowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przez noc rozmrozić odpowiedni roztwór hydrożelu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wstępnie schłodzić końcówki pipet oraz szkiełko z ośmioma dostojnikami w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść hydrożel i szkiełko z ośmioma komorami na lodzie i dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, normalnego kompletnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 500 mikrolitrów 40% roztworu hydrożelu.Następnie użyj zimnych końcówek pipet, aby dodać 50 mikrolitrów roztworu hydrożelu do środka każdej studzienki szkiełka komory i użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić roztwór na całej powierzchni dna studzienki tak równomiernie, jak to możliwe, bez pęcherzyków. Aby przygotować komórki do eksperymentu, podczas gdy hydrożel polimeryzuje, umyj komórki z 70% zlewającej się normalnej hodowli cholangiocytów szczura z wstępnie podgrzanym PBS i inkubuj komórki z pięcioma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego PBS przez 20 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąpić PBS jednym mililitrem wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć do 10 minut.Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj reakcję za pomocą czterech mililitrów wstępnie podgrzanej, kompletnej, normalnej pożywki dla cholangiocytów szczura i przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Następnie ponownie zawiesić granulkę w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki w celu zliczenia. Aby wytworzyć torbiele, dodaj odpowiednią objętość hydrożelu do zimnego, kompletnego normalnego podłoża cholangiocytów szczura, aby uzyskać 1 600 mikrolitrów 80% roztworu hydrożelu na lodzie i rozcieńczyć komórki do pięć razy 10 do piątych komórek na mililitr zimnego, kompletnego normalnego stężenia cholangiocytów szczura w 1 600 mikrolitrach pożywki.Natychmiast wymieszaj roztwory komórek i hydrożelu i dodaj 400 mikrolitrów komórek do każdej studzienki szkiełka komorowego pokrytego hydrożelem, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Aby zapewnić uzyskanie powtarzalnych i znaczących wyników, należy ostrożnie obchodzić się z hydrożelem i dokładnie wymieszać początkowy roztwór wodoru w komórce, aby uzyskać jednorodny roztwór. Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, umieść szkiełko w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po dwóch dniach w hodowli usunąć 250 mikrolitrów pożywki z jednego rogu każdej studzienki, uważając, aby nie wypłukać hydrożelu, i powoli zastąp odrzucony supernatant 250 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej. W przypadku obrazowania torbieli, w odpowiednim dniu posiewu, należy wybrać obiektyw 10 X w mikroskopie z kontrastem fazowym wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji obrazu, włączyć białą lampę i wybrać opcję obrazowania w jasnym polu. Wybierz odtwórz, aby włączyć kamerę i ustawić ostrość na polu torbieli.Ustaw czas ekspozycji i otwórz okno folderu automatycznego przechwytywania, aby umożliwić automatyczne zapisywanie obrazów. Otwórz okno przechwytywania serii Z, zresetuj pozycję domyślną i użyj Z, aby zdefiniować górną i dolną płaszczyznę stosu Z, dostosowując krok Z w zależności od celu i poziomu rozdzielczości. Następnie kliknij przycisk Uruchom teraz, aby uruchomić pobieranie.Po zobrazowaniu otwórz stos Z na Fidżi. Aby zduplikować stos, kliknij pozycję Obraz, Duplikuj i Zduplikuj stos. Aby utworzyć projekcję o minimalnej intensywności ze zduplikowanego stosu, w menu obrazu wybierz opcję Stosy i Projekt Z.Wybierz minimalną intensywność dla typu projekcji i kliknij przycisk OK. Aby odjąć tło od projekcji, w menu procesu wybierz opcję odejmij tło i wybierz 500 pikseli promienia toczącej się kuli i jasnego tła, aby torbiele były bardziej skontrastowane niż tło. Aby zmierzyć przybliżoną średnicę torbieli, powiększ docelową torbiel, wybierz narzędzie linii prostej i naciśnij przycisk T na klawiaturze.Narysuj linię w poprzek średnicy każdej torbieli na końcowej projekcji. Następny obszar zainteresowania utworzony dla każdej torbieli zostanie dodany do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli kliknij okno Z-stack, aby je zaznaczyć, a następnie kliknij pokaż wszystko, aby zobaczyć zliczone torbiele.Przesuń kursor wzdłuż stosu Z, aby sprawdzić, czy wszystkie torbiele zostały policzone na każdym obrazie, dodając w razie potrzeby nowe torbiele do menedżera obszaru zainteresowania. Po zliczeniu wszystkich torbieli wybierz zestaw interesujących Cię regionów, a następnie kliknij więcej i zapisz, aby zapisać dane. Aby określić rozmiar każdej torbieli, przy jednoczesnym wybraniu obszarów zainteresowania, kliknij przycisk Zmierz.Pojawi się okno z listą każdej torbieli i jej szacowanym rozmiarem. Następnie zapisz dane w formacie CSV. Jak wykazano, rejestrowanie liczby torbieli i ich odpowiednich rozmiarów w czasie pozwala na analizę ewolucji powstawania i wzrostu torbieli.Żywotność początkowej populacji komórek i 10-dniowych torbieli można ocenić za pomocą barwienia żywych/martwych. Martwe komórki stanowią mniej niż 3% populacji komórek w dniu 10 i są w większości zlokalizowane poza torbielą jako izolowane komórki lub jako część małych agregatów, chociaż w niektórych dużych torbielach obserwuje się nagromadzenie martwiczych szczątków komórek. Inkubacja z dioctanem fluoresceiny i Hoechstem pozwala na ocenę powstawania i wydzielania fluoresceiny od podstawy do wierzchołkowej przestrzeni świetlnej.Warto zauważyć, że wydzielanie fluoresceiny jest hamowane przez wstępne traktowanie inhibitorem oporności wielolekowej, co wskazuje, że akumulacja fluorescencyjnej fluoresceiny w świetle jest spowodowana wydzielaniem przez transporter wielolekooporny, a nie wyciekiem z przestrzeni międzykomórkowej. Barwienie pod kątem ekspresji E-kadheryny ujawnia, że normalne cholangiocyty szczura utrzymują swój fenotyp nabłonkowy w hydrożelu przez co najmniej 10 dni. Podczas przygotowywania torbieli do oceny immunofluorescencji, utrzymanie albuminy surowicy bydlęcej na poziomie 0,1% lub mniej podczas nasycenia jest kluczem do utrzymania integralności torbieli, ponieważ wyższe stężenia powodują retrakcję torbieli i zapadnięcie się światła.Hydrożel przez noc, rozmrażanie, zapis końcówki pipety i szkiełka komory, praca na lodzie i równomierne rozprowadzanie mieszaniny hydrożelu o jednorodnych komórkach na szkiełku z hodowlą mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Metoda ta może być stosowana do generowania torbieli z innych komórek nabłonka lub hydrożeli, co pozwala na porównania w celu lepszego zrozumienia polaryzacji nabłonka. Ta metoda ilościowa może być stosowana do badania wpływu leków lub mutacji genetycznych na czynność dróg żółciowych i organogenezę.

generation-quantitative-characterization-functional-polarized-biliary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano technikę izolowania cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych u noworodków myszy. Kanaliki są skrupulatnie preparowane, a następnie komórki są izolowane przez wyrost w gęstych żelach kolagenowych. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie do badania rozwoju i patologii pozawątrobowych dróg żółciowych.

Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Kanał wydalniczy C. elegans jest unikalnym modelem jednokomórkowym do wizualnej analizy in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo. Protokół ten opisuje połączenie standardowych podejść genetycznych/RNAi i obrazowania, które można dostosować do identyfikacji i charakterystyki cząsteczek kierujących jednokomórkową tubulingenezą oraz biogenezą błony wierzchołkowej i światła.

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Do obserwacji zaburzeń dróg żółciowych u noworodków u myszy, niezbędny jest nienaruszony przewód żółciowy i skuteczne przygotowanie. W związku z tym z powodzeniem opracowano nowe podejście do izolowania całego pozawątrobowego układu dróg żółciowych u mysich noworodków przy zachowaniu integralności przewodu żółciowego.

Rozwarstwienie pozawątrobowego przewodu żółciowego i pęcherzyka żółciowego u dziewięciodniowych noworodków myszy

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Poznaj metodę generowania torbieli dróg żółciowych w hydrogelu do ilościowej analizy formowania i wielkości cyst. Protokół umożliwia standaryzację badań nad lekami i zrozumienie mechanizmów chorobowych.

Generowanie i charakterystyka ilościowa funkcjonalnych i spolaryzowanych torbieli nabłonka dróg żółciowych

Przeglądaj więcej filmów