Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie wyrównanego funkcjonalnego tkanki mięśnia sercowego za pomocą mikrodośladu (micro contact printing). Osiąga się to poprzez najpierw naniesienie fibronektyny na podłoża z polidimetylosiloksanu za pomocą mikrodośladu. W drugim kroku, podwójnie transgeniczne.

Linie embrionalnych komórek macierzystych są różnicowane in vitro i izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, co pozwala na uzyskanie wysokiej czystości populacji silnie kardiogennych komórek progenitorowych. Następnie izolowane progenitory kardiologiczne są wysiewane na mikrowzorowane podłoża PDMS, aby nadać im charakterystyczny kształt pręcikowaty, przypominający kardiomiocyty. Uzyskane wyniki, oparte na analizie faktograficznej i immunofluorescencyjnej, potwierdzają pomyślną izolację oraz izotropowy wzrost progenitorów kardiologicznych.

Generowanie izotropowej tkanki mięśnia sercowego może przyczynić się do postępów w dziedzinie biologii komórek macierzystych i bioinżynierii tkankowej, zwiększając możliwość opracowania specyficznych dla danej choroby testów komórkowych do rozwoju i odkrywania leków oraz kładąc fundamenty pod regeneracyjną medycynę kardiologiczną. Najpierw odważić PDMS (polidimetylosiloksan) w stosunku do czynnika sieciującego wynoszącym 10:1 i dokładnie wymieszać.

Odpowietrz zestaw za pomocą desykatora, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wlej PDMS do wcześniej przygotowanej matrycy z wypustkami o szerokości 20 µm i wysokości 2 µm, oddalonymi od siebie o 20 µm, a następnie utwardzaj przez dwa dni w desykatorze w temperaturze pokojowej, aby uzyskać mikrostrukturalne stempla PDMS. Następnie spraw, aby powierzchnie stempli PDMS stały się hydrofilowe za pomocą oczyszczacza plazmowego.

Sterylizować stemplowanie 70% etanolem przez jedną minutę. W komorze z laminarnym przepływem powietrza szybko osuszyć sprężonym powietrzem. Przykryć sterylną powierzchnię stempla roztworem fibronektyny i pozostawić do absorpcji na co najmniej 10 minut.

Strząśnij roztwór fibronektyny ze stempli i szybko osusz je sprężonym powietrzem. Ustanów kontakt konformalny między stemplem a wcześniej przygotowanymi szkiełkami podstawowymi pokrytymi PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przez dwie minuty, mocno dociskając. Przepłucz podłoża z mikrowzorami wodą destylowaną.

Przechowywać je w wodzie destylowanej przez maksymalnie dwa tygodnie w temperaturze 4°C, chyba że mają zostać użyte natychmiast. Pokryć sześć płytek wielodołkowych sterylną 0,1% żelatyną w wodzie destylowanej i pozostawić do absorpcji na 15 minut w temperaturze 37°C. W tym czasie przygotować embrionalne fibroblasty mysie z alikwotu, dodając je do 50 ml PBS w probówce stożkowej. Wirować próbkę przy 1000 RPM przez pięć minut, a następnie zawiesić je ponownie w medium MET.

Po upływie czasu inkubacji odessać nadmiar żelatyny i dodać MES do dołków. Pozostawić MES na jeden dzień w celu przytwierdzenia. Przygotować embrionalne komórki macierzyste lub komórki ES z odpowiedniej aliquoty, dodając je do 50 mililitrów PBS w probówce stożkowej, a następnie odwirować.

Wirować komórki ES z prędkością 1000 RPM przez pięć minut, a następnie resuspender w pożywce ESC. Przenieść komórki ES do dołków zawierających mito i utrzymywać w pożywce ESC do momentu osiągnięcia konfluencji, aby uzyskać konfluentne komórki ES. W pierwszej kolejności odessać pożywkę ESC i raz przemyć komórki sterylnym PBS.

Następnie odessać PBS i dodać 500 µL trypsyny do dołka. Inkubować płytkę przez trzy i pół minuty w temperaturze 37 °C. Kilkukrotnie pipetować roztwór trypsyny w górę i w dół.

Najpierw należy rozbić kolonie komórek ES. Następnie zneutralizuj roztwór trypsyny, dodając do dołka 500 µL medium dla ESC. Rozdziel komórki ES zgodnie z wymaganym stosunkiem; w tym przypadku komórki ES są pasażowane w stosunku 1:30, co pozwala im osiągnąć konfluencję w ciągu trzech dni.

Rozpocznij różnicowanie in vitro, gdy komórki ES osiągną konfluencję. Najpierw pokryj 10 centymetrowe szalki hodowlane sterylną 0,1% żelatyną w wodzie destylowanej i pozostaw do absorpcji na 15 minut w temperaturze 37°C. W tym czasie zbierz komórki ES w sposób opisany wcześniej.

Po upływie 15 minut odessać nadmiar żelatyny i przenieść około jednej trzeciej do połowy zawiesiny komórek ES do naczyń hodowlanych zawierających medium adaptacyjne. Po dwudniowej hodowli komórek w medium adaptacyjnym, zebrać zaadaptowane komórki ES do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej PBS, używając 1,5 ml trypsyny. Wirować przez pięć minut przy 1000 RPM, a następnie zawiesić ponownie w medium różnicującym.

Przygotować ciała embrionalne lub EBS składające się z około 1000 komórek na każdą kroplę 10 µL medium różnicującego w szalkach hodowlanych o średnicy 15 cm. Przy użyciu pipety wielokanałowej odwrócić szalki i inkubować. EBS są hodowane w kroplach wiszących przez dwa i pół dnia w temperaturze 37 °C.

Po dwóch i pół dniach przenieść EBS z sześciu do ośmiu szalek o średnicy 15 cm do jednej szalki z pożywką różnicującą i hodować przez kolejne trzy i pół dnia. Po kolejnych trzech i pół dniach zebrać EBS do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i raz wypłukać szalkę sterylnym PBS, aby zebrać wszystkie EBS. Następnie pozostawić je na około pięć minut, aż opadną na dno.

Następnie usunąć nadsącz i przemyć EBS sterylnym PBS. Pozostawić EBS do ponownego osadzenia się na dnie przez około pięć minut. Rozwiązać EBS, dodając 2,5 ml trypsyny, a następnie delikatnie wstrząsać probówką w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez dwie minuty.

Następnie do roztworu trypsyny dodaje się 2,5 mililitrów sterylnego PBS i pipetuje w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej 10 mililitrów około 8–10 razy, aby rozbić skupiska komórek. Trypsynę neutralizuje się 10 mililitrami buforu fax zawierającego 7,5% FBS klasy komórek ES lub różnicowania oraz 0,01% DPI w PBS, a następnie dysocjowane EBS wiruje przy 1000 RPM przez pięć minut. Po tym czasie usuwa się nadsącz i dodaje około jeden mililitr buforu fax, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety 1 mililitr około 8–10 razy, aby rozbić skupiska komórek.

Przenieś komórki do sterylnej probówki z okrągłym dnem wyposażonej w sitko komórkowe o oczkach 35 µm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Posortuj zróżnicowane komórki ES za pomocą cytometru przepływowego Aria, aby uzyskać oczyszczone populacje zdeterminowanych progenitorów komór komory. Szczegółową strategię bramkowania przedstawiono w części tekstowej protokołu.

Poddać podłoża z mikrostrukturami działaniu 1% roztworu F1 27 w wodzie destylowanej przez 10 minut. Następnie przemyć je trzykrotnie sterylnym PBS. Przymocować uszczelki z PDMS wokół obszaru wzoru i mocno docisnąć.

Następnie wysiej progenitory kardiomiocytów na podłoża z mikrowzorcem fibronektyny. Poniższe obrazy pochodzą z reprezentacyjnego wykresu cytometrii przepływowej komórek ES po sześciu dniach różnicowania in vitro. Ten obraz przedstawia bramkowanie na podstawie amplitudy rozpraszania przedniego FSCA oraz amplitudy rozpraszania bocznego SSCA.

Umożliwia to oddzielenie całych komórek od debris komórkowego. Przedstawiono tutaj bramkowanie według powierzchni rozproszenia światła (FSCA) oraz szerokości rozproszenia światła przedniego (FSCW). Pozwala to na wyizolowanie singletów komórkowych z dubletów i innych agregatów komórkowych.

Na tym obrazie przedstawiono bramkowanie w funkcji SSCA oraz rozproszenia z SSCW. Pozwala to na zwiększenie czystości populacji singletów komórkowych. Obraz ten pokazuje również bramkowanie w funkcji FSCA i barwienia DPI, co umożliwia wyizolowanie żywych komórek DPI-ujemnych od komórek nieżyjących.

Tutaj przedstawiono bramkowanie dla FITC, rybonukleazy, PE oraz PE cyan w DI 7 PE SI 7. Pozwala to na wyodrębnienie komórek prawdziwie czerwonych pozytywnych i prawdziwie czerwonych negatywnych oraz wykluczenie autofluorescencyjnych komórek czerwonych negatywnych. Obrazy te pokazują bramkowanie dla amplitudy fluoresceiny izotiocyjanianu FITC oraz PE, co umożliwia sortowanie komórek prawdziwie zielonych pozytywnych i prawdziwie zielonych negatywnych w obrębie populacji czerwonych pozytywnych i czerwonych negatywnych.

Oczyszczanie metodą FACS komórek ES zróżnicowanych in vitro ujawnia cztery odrębne populacje progenitorów, co widać na tym wykresie cytometrii przepływowej. Cztery odrębne populacje progenitorów to: czerwone dodatnie i zielone dodatnie, czerwone dodatnie i zielone ujemne, czerwone ujemne i zielone dodatnie oraz czerwone ujemne i zielone ujemne. To reprezentatywne zdjęcie z mikroskopii immunofluorescencyjnej przedstawia mikrowzorowane podłoża z fibronektyny.

Pasek skali reprezentuje 80 mikronów. Na obrazie przedstawiono reprezentatywną mikroskopię immunofluorescencyjną komórek facts pochodzenia zarodkowego, izolowanych progenitorów w górnych panelach oraz komórek facts pochodzenia ESL, izolowanych progenitorów w dolnych panelach po dodatkowych pięciu dniach hodowli na mikrowzorach z fibronektyny; jądra barwione na niebiesko. S-M-M-H-C-A barwione na czerwono, a aktynina alfa sarkomeryczna pojawia się na zielono.

Pasek skali wynosi 40 mikronów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego z odnawialnego źródła komórek progenitorowych serca.