Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez mikrokontaktowe drukowanie. Osiąga się to poprzez pierwsze mikrokontaktowe drukowanie fibronektyny na podłożach polidimetylosiloksanowych. W drugim kroku podwójnie transgeniczny.

Linie embrionalnych komórek macierzystych są różnicowane in vitro i izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, co pozwala na uzyskanie wysoce oczyszczonych populacji silnie kardiogennych komórek progenitorowych. Następnie izolowane komórki progenitorowe serca są wysiewane na mikro opatentowanych podłożach PDMS, aby uczynić je złośliwymi i przyjąć kształt przypominający pręcik miocytów serca. Uzyskano wyniki, które wskazują na udaną izolację i izotropowy wzrost komórek progenitorowych serca w oparciu o fakty i analizę immunofluorescencyjną.

Wygenerowanie izotropowej tkanki mięśnia sercowego może pomóc w postępie w dziedzinie biologii komórek macierzystych i bioinżynierii tkankowej, zwiększając możliwość opracowania specyficznych dla choroby komórek na potrzeby opracowywania i odkrywania leków. I kładąc podwaliny pod medycynę regeneracyjną serca. Pierwsza osłona IL, elastomer polidimetyloalanu 180 4 w stosunku 10 do jednego na bazie środka utwardzającego i dobrze wymieszaj.

Odgazuj zespół za pomocą osuszacza, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki powietrza. Wlej PDMS do wcześniej wyprodukowanego wzorca z grzbietami narzędzi o szerokości 20 mikronów i dwoma mikronami oddzielonymi odstępami 20 mikronów, a następnie utwardź przez dwa dni w osuszaczu w temperaturze pokojowej, aby uzyskać mikroteksturowane stemple PDMS. Po wyrenderowaniu stempla PDMS powierzchnie są hydrofilowe za pomocą myjki plazmowej.

Sterylizuj stemple 70% etanolem przez jedną minutę. W komorze bezpieczeństwa biologicznego szybko wysuszyć sprężonym powietrzem. Przykryj sterylne powierzchnie stempla roztworem fibronektyny do wchłonięcia przez co najmniej 10 minut po wchłonięciu.

Strząśnij roztwór fibronektyny ze stempli i szybko wysusz sprężonym powietrzem. Ustanowić konforemny kontakt między pieczęcią a wcześniej przygotowanymi szkiełkami nakrywkowymi ze szkła powlekanego PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przez dwie minuty i mocno dociskać. Spłucz podłoża z mikrowzorami wodą destylowaną.

Przechowuj je w wodzie destylowanej maksymalnie przez dwa tygodnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chyba że mają być użyte natychmiast. Pokryj sześciodołkowe płytki sterylną 0,1% żelatyną w wodzie destylowanej i pozwól jej wchłonąć się przez 15 minut 37 stopni Celsjusza W tym czasie przygotuj mysie fibroblasty embrionalne z podwielokrotności ahor, dodając je do 50 mililitrów PBS w stożkowej probówce. Odwiruj metamfetaminę z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesij ją w pożywce metamfetaminy.

Po upływie czasu inkubacji odessać nadmiar żelatyny i dodać mes do studzienek. Pozwól MES na jeden dzień na dołączenie. Przygotuj embrionalne komórki macierzyste lub komórki ES z porcji myśli, dodając je do 50 mililitrów PBS w wirówce ze stożkową probówką.

Ogniwa ES osiągają prędkość 1000 obr./min na pięć minut, a Resus zawiesza je w pożywce ESC. Dodaj komórki E ES do studzienek zawierających mity i utrzymuj w pożywce ESC, aż do osiągnięcia konfluencji, aby masować współpłynące komórki ES. Najpierw odessać pożywkę ESC i raz przemyć komórki sterylnym PBS.

Następnie odessaj PBS i dodaj 500 mikrolitrów wycieczek do studni. Inkubuj płytkę przez trzy i pół minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kilkakrotnie odpipetować roztwór TRIPSIN w górę i w dół.

Pierwszy, aby rozbić kolonie komórek Ees. Następnie zneutralizuj roztwór trypsyny, dodając do studzienki 500 mikrolitrów pożywki ESC. Masuj komórki ES zgodnie z wymaganym stosunkiem, tutaj komórki E ES są pasażowane w stosunku od jednego do 30, co pozwala im osiągnąć zbieg w ciągu trzech dni.

Różnicowanie in vitro należy rozpocząć, gdy komórki ES osiągną konfluencję. Najpierw pokryj 10-centymetrowe szalki hodowlane sterylną 0,1% żelatyną w wodzie destylowanej i pozostaw do wchłonięcia przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W tym czasie zbierz komórki ES tak jak poprzednio.

Po upływie 15 minut odessać nadmiar żelatyny i dodać około jednej trzeciej do połowy zawiesiny komórek E ES do szalek hodowlanych zawierających pożywkę adaptacyjną. Po wyhodowaniu komórek w pożywce adaptacyjnej przez dwa dni, zbierz przystosowane komórki ES do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej PBS, używając 1,5 mililitra trypsyny. Odwirować je z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesić w pożywce różnicującej.

Wykonaj ciała zarodkowe lub EBS z około 1000 komórek na 10 mikrolitrów kropli pożywki różnicującej w 15-centymetrowych szalkach hodowlanych. Za pomocą pipety wielokanałowej odwróć płytki i kulturę. EBS to wiszące kropelki przez dwa i pół dnia w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po dwóch i pół dniach przeciągnij EBS z sześciu do ośmiu 15-centymetrowych szalek do jednej za pomocą pożywki różnicującej i hoduj je przez kolejne trzy i pół dnia. Po kolejnych trzech i pół dniach zbierz EBS do 50-mililitrowej stożkowej probówki i umyj płytkę raz sterylnym PBS, aby zebrać wszystkie ebs. Następnie pozwól im opaść na dno na około pięć minut.

Następnie usuń supinat i umyj EBS sterylnym PBS. Pozwól EBS ponownie opaść na dno na około pięć minut. Oddziel EBS, dodając 2,5 mililitra trypsyny i delikatnie potrząsaj probówką w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Następnie dodaj 2,5 mililitra sterylnego PBS do roztworu trypiny i pipetuj w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej około 8 do 10 razy, aby rozbić skupiska komórek. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 mililitrów buforu faksowego zawierającego 7,5% komórki ES 7,5% E lub FBS klasy różnicowania i 0,01% DPI w wirówce PBS, zdysocjowany EBS przy 1000 obr./min przez pięć minut. Następnie usuń supinat i dodaj około jednego mililitra pipety buforowej faksu w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra około 8 do 10 razy, aby rozbić klastry komórek.

Przenieś komórki do sterylnej probówki z okrągłym dnem z sitkiem o wielkości 35 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Posortuj zróżnicowane komórki ES za pomocą cytometru przepływowego aria i uzyskaj oczyszczone populacje zaangażowanych komórek progenitorowych komorowych. Zapoznaj się z częścią tekstową protokołu, aby zapoznać się ze szczegółową strategią bramkowania.

Spożywaj substraty z mikrowzorem z 1%onic F1 27 w wodzie destylowanej przez 10 minut. Następnie umyj je trzykrotnie sterylnym PBS. Przymocuj uszczelki PDMS wokół obszaru wzoru i mocno dociśnij.

Następnie wysiewaj komórki progenitorowe serca na podłożach mikrowzoru fibronektyny. Poniższe obrazy pochodzą z reprezentatywnego wykresu cytometrii przepływowej komórek ES zróżnicowanych in vitro w szóstym dniu. Ten obraz przedstawia bramkowanie na amplitudzie rozproszenia do przodu FSCA i amplitudzie rozproszenia bocznego SSCA.

Pozwala to na oddzielenie całych komórek od resztek komórkowych. Tutaj widać bramkowanie na FSCA i szerokość rozproszenia do przodu FSCW. Pozwala to na izolację podkoszulków komórkowych od dubletów i innych agregatów komórkowych.

Ten obraz przedstawia bramkowanie na SSCA i rozproszenie za pomocą SSCW. Zwiększa to czystość singletów komórkowych. Ten obraz przedstawia bramkowanie na barwieniu FSCA i DPI, które pozwala na izolację żywotnych komórek DPI ujemnych od komórek niezdolnych do życia.

Tutaj widać bramkowanie dla fico, rine, PE i PE cyjan w DI siedem PE SI siedem. Pozwala to na uzyskanie prawdziwych czerwonych i prawdziwie czerwonych ujemnych komórek oraz wykluczenie autofluorescencyjnych czerwonych komórek ujemnych. Obrazy te pokazują bramkowanie dla dopasowania amplitudy izotiocyjanianu fluoresceiny CA i PEA, co umożliwia sortowanie prawdziwych zielonych i prawdziwie zielonych komórek ujemnych w populacjach czerwono-dodatnich i czerwono-ujemnych.

Faksowe oczyszczanie zróżnicowanych komórek ES in vitro ujawnia cztery odrębne populacje komórek progenitorowych, jak widać na tym wykresie cytometrii przepływowej. Cztery odrębne populacje przodków to czerwony, dodatni zielony, dodatni czerwony, dodatni zielony, ujemny czerwony, ujemny zielony dodatni i czerwony ujemny zielony ujemny. Ten reprezentatywny obraz z mikroskopii immunofluorescencyjnej pokazuje mikrowzorzyste substraty fibronektyny.

Pasek skali reprezentuje 80 mikronów. Obraz ten przedstawia reprezentatywną mikroskopię immunofluorescencyjną faktów pochodzących z embrionów, izolowanych przodków w górnych panelach i faktów pochodzących z ESL, izolowanych komórek progenitorowych w dolnych panelach po dodatkowych pięciu dniach hodowli na mikrowzorcach fibronektyny jądrach zabarwionych na niebiesko. S-M-M-H-C-A barwiona na czerwono sarkomeryczna alfa aktinina pojawia się na zielono.

Skala ma 40 mikronów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego z odnawialnego źródła komórkowego protusa sercowego.