Name: Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj technikę drukowania mikrokontaktowego do generowania wyrównanej tkanki mięśnia sercowego z progenitorów kardiogennych pochodzących z komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę kształtu komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została częściowo wykonana w Center for Nanoscale Systems (CNS), członku National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), który jest wspierany przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr. ECS-0335765. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda.

Protokół generowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego można podzielić na trzy główne części. Wytwarzanie wzorca z mikrowzorem przy użyciu technik miękkiej litografii nie jest uważane za część poniższego protokołu, ale może być wykonane w oparciu o ustaloną metodę6.
1. Mikrokontaktowy druk fibronektyny na podłożach PDMS
<ol>
	<li>Wymieszać elastomer Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS w stosunku 10:1 do utwardzacza i odgazować zespół za pomocą eksykatora, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Utwardź PDMS na wcześniej wyprodukowanym wzorcu z grzbietami o szerokości 20 μm i wysokości 2 μm, oddzielonymi odstępami 20 μm przez 2 dni w temperaturze pokojowej lub 4 godziny w temperaturze 65 °C, aby uzyskać stemple PDMS z mikroteksturą.</li>
</ol>
* Utwardzanie w eksykatorze jest wysoce zalecane w celu wyeliminowania wszelkich pęcherzyków powietrza.
<ol start="3">
	<li>Wirowanie PDMS na szklanych szkiełkach nakrywkowych (np. 22x22 mm) z prędkością 5 000 obr./min przez 2 minuty za pomocą powlekarki Headway Spin Coater w celu uzyskania cienkich i równych podłoży PDMS o grubości 15 μm.</li>
	<li>Wyczyść stemple 70% etanolem, aby usunąć cząsteczki kurzu i brudu. Pozwól im wyschnąć na powietrzu.</li>
</ol>
* Stemple mogą być używane kilka razy, jednak zaleca się regularne odnawianie znaczków PDMS ze względu na ścieranie powierzchni w miarę upływu czasu.
<ol start="5">
	<li>Umieść stemple w urządzeniu do czyszczenia plazmowego SPI Plasma-Prep II i przetwarzaj przez 1 minutę w temperaturze 275 mTorr, aby powierzchnie PDMS stały się hydrofilowe.</li>
</ol>
* Leczenie plazmą tlenową powinno być obserwowane. Dłuższy czas obróbki może spowodować pękanie elastomeru.
<ol start="6">
	<li>Sterylizuj stemple 70% etanolem przez 1 min. Szybko wysuszyć sprężonym powietrzem.</li>
</ol>
* Dalsze kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność.
<ol start="7">
	<li>Pokryć powierzchnie stempla roztworem fibronektyny (50 μg/ml w ddH2O). Niech się adsorbuje przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Strząśnij roztwór fibronektyny ze stempli i szybko wysusz sprężonym powietrzem.</li>
	<li>Nawiąż konforemny kontakt między stemplami a podłożami PDMS przez 2 minuty i mocno dociśnij.</li>
	<li>Przepłukać podłoża z mikrowzorami za pomocą ddH2O. Przechowywać je w ddH2O maksymalnie przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, chyba że zostały użyte po raz pierwszy. Przechowuj pieczątki PDMS w ddH2O.</li>
</ol>
2. Utrzymanie podwójnie transgenicznych linii embrionalnych komórek macierzystych
Najpierw przygotuj następujące podłoże do hodowli komórek ES myszy:
Mysi fibroblast embrionalny (MEF)-Medium: Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) ES komórka lub klasa różnicująca, 1% penicylina-streptomycyna (P/S)
Embrionalne komórki macierzyste (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES klasy komórkowej, 1% Aminokwasy endogenne (NEAA), 0,5% P/S, 0,2% Czynnik hamujący białaczkę (LIF), 0,0007% 2-merkaptoetanol (2-ME)
<ol>
	<li>Pokryj płytki 6-dołkowe sterylną 0,1% żelatyną wddH2Oi pozwól jej adsorbować się przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać MEF-y z rozmrożonej podwielokrotności do 50 ml PBS w stożkowej probówce i odwirować je z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Ponownie zawiesić MEF-y w pożywce MEF.</li>
	<li>Po adsorpcji odessać nadmiar żelatyny i dodać MEF-y do studzienek. Poczekaj 1 dzień na dołączenie MEF.</li>
</ol>
* Porcja 10 milionów MEFów wystarcza na 3 płytki 6-dołkowe.
<ol start="4">
	<li>Po przyłączeniu MEF, dodać komórki ES z rozmrożonej podwielokrotności do 50 ml PBS w stożkowej probówce i odwirować je z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki ES w pożywce ESC i dodać je do studzienek zawierających MEF. Hoduj komórki ES w pożywce ESC, aż do osiągnięcia konfluencji.</li>
</ol>
* Gdy komórki ES osiągną konfluencję, wymagane jest przechodzenie, aby uniknąć nadmiernego wzrostu i utrzymać kolonie komórek ES.
<ol start="5">
	<li>Przygotuj komórki ES do pasażu. Odessać pożywkę ESC i przemyć raz sterylnym PBS.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 500 μl trypsyny. Proces: 3,5 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Kilkakrotnie odpipetować roztwór trypsyny w górę i w dół, aby rozbić kolonie komórek ES i zneutralizować go 500 μl pożywki ESC.</li>
	<li>Pasażuj komórki ES zgodnie z pożądanym stosunkiem, np. przenieś 33 μl do innego dołka z wcześniej przygotowanymi MEFami do pasażu 1/30. Utrzymuj komórki ES w ESC-Medium.</li>
</ol>
* Współczynnik przejścia 1/30 pozwala komórkom ES osiągnąć konfluencję w ciągu 3 dni. Pasaż komórek ES zgodnie z harmonogramem różnicowania in vitro.
3. Różnicowanie in vitro podwójnych transgenicznych linii embrionalnych komórek macierzystych oraz izolacja i wysiewanie przodków serca
Najpierw przygotuj następujące podłoża niezbędne do różnicowania in vitro komórek ES:
Adaptacja-Medium: Zmodyfikowane Medium Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 15% FBS ES klasy komórkowej, 1% NEAA, 0,5% P/S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME
Differentiation-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiation-grade. 1% NEAA, 0.5% P/S, 0.35% 0.1M Kwas askorbinowy, 0.0007% 2-ME
<ol>
	<li>Różnicowanie in vitro rozpoczyna się, gdy komórki ES osiągną konfluencję. Pokryć 10-centymetrowe szalki hodowlane sterylną 0,1% żelatyną w ddH2O i pozostawić do adsorpcji przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
* Bądź świadomy czasu trwania procesu różnicowania in vitro. Potrzeba 8 dni, aby można było wyizolować komórki progenitorowe serca. Odpowiednio zaplanuj swoje eksperymenty.
<ol start="2">
	<li>Zbierz komórki ES tak jak poprzednio. Po adsorpcji odessać nadmiar żelatyny i dodać około 1/3-1/2 zawiesiny komórek ES do przygotowanych szalek hodowlanych zawierających pożywkę adaptacyjną. Hoduj komórki przez 2 dni.</li>
</ol>
* Wybierz ilość komórek ES do adaptacji zgodnie ze swoimi eksperymentami.
<ol start="3">
	<li>Zbierz przystosowane komórki ES do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej PBS, używając 1,5 ml trypsyny. Odwirować zdysocjowane komórki ES przy 1,000 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić je w pożywce różnicowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej należy przygotować ciała zarodkowe (EB) składające się z około 1000 komórek na 10 μl, które upuścić na 15-centymetrowych szalkach hodowlanych. Odwrócić płytki i EB kultury w postaci wiszących kropel przez 2,5 dnia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 2,5 dnia należy połączyć EB składające się z 6-8 15-centymetrowych szalek hodowlanych w jedno za pomocą pożywki różnicującej i hodować je przez kolejne 3,5 dnia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 3,5 dnia zebrać EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pozostawić je opaść na dno na około 5 minut. Zassać supernatant i przemyć EB sterylnym PBS. Pozwól EB ponownie opaść na dno na około 5 minut.</li>
	<li>Oddzielić EB, przetwarzając je z 2,5 ml trypsyny przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie potrząsając probówką. Następnie dodaj 2. 5 ml sterylnego PBS do roztworu trypsyny i pipetować w górę i w dół pipetą serologiczną o pojemności 10 ml około 8-10 razy w celu rozbicia skupisk komórek. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml buforu FACS zawierającego 7,5% komórek FBS ES lub klasy różnicowania i 0,01% DAPI w PBS.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane EB przy 1 000 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić je w około 1 ml buforu FACS. Pipetować w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml około 8-10 razy, aby rozbić skupiska komórek.</li>
</ol>
* Dodaj bufor FACS zgodnie z szacowaną ilością zdysocjowanych EBs. Zbyt mocno skoncentrowane komórki mogą zatkać się podczas FACS, a zbyt nisko skoncentrowane komórki mogą niepotrzebnie wydłużyć czas FACS.
<ol start="9">
	<li>Przenieś komórki do sterylnej probówki okrągłodennej z sitkiem o wielkości 35 μm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Posortuj zróżnicowane komórki ES za pomocą cytometru przepływowego FACSAria i uzyskaj oczyszczone populacje CVP.</li>
</ol>
*Opracowaliśmy wieloetapową strategię bramkowania, aby izolować wysoce oczyszczone kolorowe komórki. Krótko mówiąc, najpierw skupiamy się na amplitudzie rozproszenia do przodu (FSC-A) i amplitudzie rozproszenia bocznego (SSC-A) (rysunek 1A). Dzięki temu możemy oddzielić całe komórki od resztek komórkowych. Następnie bramkujemy FSC-A i Forward Scatter-Width (FSC-W) (Rysunek 1B). Dzięki temu możemy wyizolować singlety komórkowe z dubletów i innych agregatów komórkowych. Następnie bramkujemy na SSC-A i Side Scatter-Width (SSC-W) (Rysunek 1C). Zwiększa to czystość singletów komórkowych. Następnie wprowadzamy barwienie DAPI, aby wyizolować żywe komórki (DAPI-ujemne) od komórek niezdolnych do życia (ryc. 1D). Następnie skupiamy się na amplitudzie fikoeryhtryny (PE-A) i amplitudzie barwnika PE-cyjaniny 7 (PE-Cy7-A), aby uzyskać prawdziwe czerwono-dodatnie (R+) i prawdziwe czerwono-ujemne (R-) komórki i wykluczyć autofluorescencyjne komórki czerwono-ujemne (Figura 1E). Komórki R + i R- są następnie bramkowane oddzielnie na amplitudzie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC-A) i PE-A w celu sortowania prawdziwych komórek zielono-dodatnich (G+) i prawdziwych zielono-ujemnych (G-) w tych populacjach (ryc. 1F + 1G). Daje to 4 populacje komórek w następujący sposób: R + G +, R + G-, R-G + i R-G- (Figura 1H).
<ol start="11">
	<li>Pasywować podłoża mikrowzorzyste 1% Pluronem F-127 w ddH2O przez 10 min. Następnie umyj je 3x sterylnym PBS.</li>
</ol>
* Pluronic F-127 to środek powierzchniowo czynny, który blokuje adhezję komórek. Wspomaga ograniczenie adhezji komórek do obszaru z mikrowzorami.
<ol start="12">
	<li>Przymocuj uszczelki PDMS wokół wzorzystego obszaru i mocno dociśnij. Następnie wysiewaj CVP na podłożach z mikrowzorzyskami fibronektyny.</li>
</ol>

<ol><li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
<li>Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiogenesis+and+the+complex+biology+of+regenerative+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine.</a> Science. 322, 1494-1497 (2008).</li>
<li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326, 426-429 (2009).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).</li>
<li>Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+aspects+of+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological aspects of cardiac tissue engineering.</a> Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+regulates+collagen+type+I+expression+in+human+tendon+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).</li>
<li>Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+microtextured+scaffold+templates+to+control+organization+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).</li>
<li>Isenberg, B. C., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+structure+into+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Building structure into engineered tissues.</a> Materials Today. 9, 54-60 (2006).</li>
<li>Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+biomechanics+in+tissue+engineering+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+contractile+strength+of+engineered+cardiac+muscle+by+hierarchal+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture.</a> Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).</li>
<li>Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).</li>
<li>Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+approach+to+micropattern+cells+on+common+culture+substrates+by+tuning+substrate+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability.</a> Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).</li>
<li>Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+postnatal+growth+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Characterisation of postnatal growth of the murine heart.</a> Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).</li>
<li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+pathologic+cardiac+hypertrophy+in+adulthood+is+preceded+by+neonatal+cardiac+growth+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Ohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+of+the+transverse-axial+tubule+system+in+ventricular+cardiomyocytes+from+failing+and+non-failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts.</a> Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373(2009).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+cell+sheets+for+constructing+three-dimensional+tissue+with+well-organized+cell+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation.</a> Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).</li>
<li>Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+of+aligned+cell+sheets+for+layer-by-layer+control+of+complex+tissue+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure.</a> Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole przedstawiliśmy metodę izolowania oczyszczonych populacji kardiogennych komórek progenitorowych i wysiewania ich na mikrowzorcowych substratach fibronektyny, co pozwala im wyrównać się i przyjąć kształt pręcika przypominający miocyty serca. Prawidłowa organizacja komórkowa ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania tkanek8,10 , w szczególności dla tkanki mięśnia sercowego. Wykazano, że miocyty serca rozwijają ulepszone właściwości mechaniczne11,12 i elektrofizjologiczne<s...

Pomimo ostatnich postępów w terapii medycznej, zaawansowana niewydolność serca pozostaje główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności w krajach rozwiniętych. Zespół kliniczny wynika z utraty funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego, a następnie niezdolności niewydolnego serca do zaspokojenia potrzeb metabolicznych osób dotkniętych chorobą. Ponieważ serce ma ograniczoną zdolność regeneracyjną, autologiczny przeszczep serca jest jedyną obecnie klinicznie akceptowaną terapią bezpośrednio mającą na celu uzupełnienie utraconej funkcjonalnej tkanki serca. Istotne wady transplantacji serca, w tym ograniczona liczba serc dawców i konieczność długotrwałego leczenia immunosupresyjnego, wykluczają szerokie zastosowanie tej terapii. W rezultacie terapia medyczna stała się podstawą leczenia pacjentów z chorobami serca. Głównym wyzwaniem w opracowywaniu leków jest identyfikacja testów komórkowych, które dokładnie podsumowują prawidłową i chorą fizjologię mięśnia sercowego in vitro.
Niedawna konwergencja technologii biologii komórek macierzystych i inżynierii tkankowej otwiera nowe, obiecujące możliwości regeneracji serca. Wygenerowanie funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego z odnawialnego źródła specyficznego dla pacjenta byłoby dużym postępem w tej dziedzinie. Pozwoliłoby to na opracowanie specyficznych dla choroby testów komórkowych do opracowywania i odkrywania leków oraz położyłoby podwaliny pod medycynę regeneracyjną serca. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ES) i, co ważniejsze, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) stanowią potencjalnie odnawialne, specyficzne dla pacjenta źródło komorowych komórek progenitorowych i dojrzałych miocytów komorowych. Połączenie biologii komórek macierzystych i strategii inżynierii tkankowej rozwiązuje ten problem poprzez generowanie funkcjonalnej tkanki serca in vitro, która może być wykorzystana w opracowywaniu testów komórkowych do odkrywania leków lub w podejściach regeneracyjnych serca w leczeniu zaawansowanej niewydolności serca.
Głównym wyzwaniem w regeneracji serca było zidentyfikowanie optymalnego typu komórek. Badano szeroki wachlarz komórek1, jednak do tej pory, chociaż odkryto różne multipotencjalne prekursory kardiogenne z różnych źródeł, identyfikacja źródła komórek, które spełnia krytyczne wymagania, takie jak zaangażowanie w los komórek miogennych, utrzymanie zdolności do ekspansji in vivo lub in vitro i skład do funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego okazało się głównym problemem2. Wcześniej opisaliśmy podwójny transgeniczny system mysi, który umożliwia izolację wysoce oczyszczonych populacji zaangażowanych komórek progenitorowych komorowych (CVP) z komórek ES różnicujących się in vitro. Wyhodowaliśmy nową podwójnie transgeniczną mysz, która wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed pod kontrolą zależnego od Isl1 wzmacniacza genu MEF2c i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji pod kontrolą specyficznego dla serca wzmacniacza Nkx2,5. W oparciu o ten dwukolorowy fluorescencyjny system reporterowy, pierwsze i drugie komórki progenitorowe pola serca z rozwijających się komórek ES można wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zgodnie z ich ekspresją genów MEF2c i Nkx2,5. CVP przypominają miocyty serca w oparciu o wzorce ekspresji markerów mięśnia sercowego oraz cechy strukturalne i funkcjonalne3, co jest bardzo obiecujące dla celów regeneracji tkanki serca.
Chociaż w dziedzinie inżynierii tkankowej dokonano wielu postępów, naśladowanie natywnej architektury komórkowej pozostaje kluczowym wyzwaniem. Konwencjonalne metody radzenia sobie z tym wyzwaniem obejmują sadzenie biologicznych lub syntetycznych rusztowań z komórkami in vitro. Ze względu na szereg wad rusztowań, w tym szybką degradację, ograniczoną stabilność fizyczną i mechaniczną oraz niską gęstość komórek1,4,5 , podjęliśmy próbę inżynierii tkanki bez rusztowań. Chociaż komórki serca mogą modyfikować swoje lokalne mikrośrodowisko poprzez wydzielanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej, mają bardziej ograniczoną zdolność do organizowania się w miocyty serca w kształcie pręcików przy braku sygnałów zewnątrzkomórkowych. W związku z tym wymagany jest szablon, który zapewnia komórkom odpowiednie wskazówki przestrzenne i biologiczne do skomponowania funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. Druk mikrokontaktowy rozwiązuje to wyzwanie, zapewniając prostą i niedrogą technikę precyzyjnej kontroli kształtu, organizacji i funkcji komórek6-8, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla generowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. Polega ona na zastosowaniu mikroteksturowanych stempli polidimetylosiloksanu (PDMS) o rozmiarach elementów do 2 μm9, które umożliwiają osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej na podłożach PDMS w precyzyjnych wzorach, a tym samym wpływają na adhezję komórkową w przestrzeni.
Proponujemy połączenie technologii bioinżynierii tkankowej z biologią komórek macierzystych w celu wygenerowania anizotropowej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego. W związku z tym demonstrujemy tutaj nasze niedawno opublikowane podejście do następujących elementów: (1) generowania mikrowzorów powierzchni białek na podłożach PDMS za pomocą drukowania mikrokontaktowego w celu wygenerowania matrycy dla wyrównanej tkanki mięśnia sercowego, (2) izolacji wysoce oczyszczonych komórek progenitorowych serca z komórek ES różnicujących się in vitro oraz (3) połączenia obu technik w celu wygenerowania wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego.

<table><tbody><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Przygotuj roztwór 0,1 M w dezykatorze ddH2O</td></tr><tr><td>, próżnia 10 cali</td><td>Nova-Tech International, Inc.</td><td>55206</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca ES klasy komórkowej</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Klasa różnicująca</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>Rozpuszczać do 1 mg/ml w ddH2O</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Szkło nakrywkowe 22x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Przygotuj 0,1% roztwór w ddH2O</td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc.</td><td>PWM32-PS-CB15</td><td></td></tr> Zmodyfikowany czynnik hamujący białaczkę <tr><td>Silbecco's Medium Thermo</td><td>Scientific</td><td>SH30228.01</td><td></td>Iscove</tr><tr><td></td><td>Samodzielnie przygotowany z linii</td><td></td> komórkowych wydzielających LIF <td>Przygotuj 500x roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne</td><td>Zbierane od 12 do 15 dnia zarodki myszy</td> Penicylina-Streptomycyna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Przygotuj 1% roztwór w ddH2O </td></tr><tr><td>Probówka okrągłodenna z 35 &mu; m Sitko do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>SPI Plasma-Prep II Środek do czyszczenia plazmy </td><td>SPI Supplies</td><td>11005-AB</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Wakuometr</td><td>SPI Supplies</td><td>11019-AB</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Zaawansowana niewydolność serca stanowi główne niespełnione wyzwanie kliniczne, wynikające z utraty zdolnych do życia i/lub w pełni funkcjonalnych komórek mięśnia sercowego. Pomimo optymalnej terapii farmakologicznej, niewydolność serca stanowi główną przyczynę śmiertelności i zachorowalności w krajach rozwiniętych. Głównym wyzwaniem w opracowywaniu leków jest identyfikacja testów komórkowych, które dokładnie podsumowują prawidłową i chorą fizjologię mięśnia sercowego u ludzi in vitro. Podobnie, główne wyzwania w biologii serca regeneracyjnego koncentrują się wokół identyfikacji i izolacji specyficznych dla pacjenta komórek progenitorowych serca w klinicznie istotnych ilościach. Komórki te muszą następnie zostać złożone w funkcjonalną tkankę, która przypomina natywną architekturę tkanki serca. Druk mikrokontaktowy pozwala na tworzenie precyzyjnych mikrowzorów białek, które przypominają strukturalną organizację serca, dostarczając w ten sposób geometrycznych wskazówek do przestrzennej kontroli adhezji komórek. W niniejszym artykule opisujemy nasze podejście do izolacji wysoce oczyszczonych komórek mięśnia sercowego z pluripotencjalnych komórek macierzystych różnicujących się in vitro, generowania powierzchni wzrostu komórek z mikrowzorem z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz składania komórek mięśnia sercowego pochodzących z komórek macierzystych w anizotropową tkankę mięśnia sercowego.

Oczyszczanie metodą FACS zróżnicowanych in vitro komórek ES ujawniło cztery odrębne populacje progenitorów (Rysunek 1). Obecność mikrowzorców fibronektyny potwierdzono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, która wykazała całkowity transfer ciągłych linii fibronektyny (Rysunek 2). Wysianie wyizolowanych metodą FACS progenitorów na mikrowzorce fibronektyny doprowadziło do wyrównania populacji R+G+ oraz części populacji R-G+. Mimo...

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie wyrównanego funkcjonalnego tkanki mięśnia sercowego za pomocą mikrodośladu (micro contact printing). Osiąga się to poprzez najpierw naniesienie fibronektyny na podłoża z polidimetylosiloksanu za pomocą mikrodośladu. W drugim kroku, podwójnie transgeniczne.Linie embrionalnych komórek macierzystych są różnicowane in vitro i izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, co pozwala na uzyskanie wysokiej czystości populacji silnie kardiogennych komórek progenitorowych. Następnie izolowane progenitory kardiologiczne są wysiewane na mikrowzorowane podłoża PDMS, aby nadać im charakterystyczny kształt pręcikowaty, przypominający kardiomiocyty. Uzyskane wyniki, oparte na analizie faktograficznej i immunofluorescencyjnej, potwierdzają pomyślną izolację oraz izotropowy wzrost progenitorów kardiologicznych.Generowanie izotropowej tkanki mięśnia sercowego może przyczynić się do postępów w dziedzinie biologii komórek macierzystych i bioinżynierii tkankowej, zwiększając możliwość opracowania specyficznych dla danej choroby testów komórkowych do rozwoju i odkrywania leków oraz kładąc fundamenty pod regeneracyjną medycynę kardiologi

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanwne tkanki mięśnia sercowego za pomocą druku mikrokontaktowego

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj technikę drukowania mikrokontaktowego do generowania wyrównanej tkanki mięśnia sercowego z progenitorów kardiogennych pochodzących z komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę kształtu komórek.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Przeglądaj więcej filmów