Name: Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Naucz się generować sferoidy z ludzkich komórek nabłonka nosa do badań funkcji CFTR. Ta metoda pozwala oceniać odpowiedź na leki modyfikujące CFTR w modelu ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numer CLANCY14XX0, oraz przez Cystic Fibrosis Foundation, grant numer CLANCY15R0. Autorzy pragną podziękować Kristinie Ray za jej pomoc w rekrutacji pacjentów i nadzorze regulacyjnym. Autorzy pragną również podziękować grupie roboczej HNE, wspieranej przez Fundację Mukowiscydozy, która pomogła w tworzeniu możliwości hodowli HNE: Prestonowi Bratcherowi, Calvinowi Cottonowi, Martinie Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michaelowi Myerburgowi, Dave'owi Nicholsowi, Scottowi Randellowi, Steve'owi Rowe'owi, G. Marty'emu Solomonowi i Katherine Tuggle.

<ol><li>Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra043184">Cystic fibrosis.</a> N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li>
<li>Anderson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+triphosphates+are+required+to+open+the+CFTR+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel.</a> Cell. 67 (4), 775-784 (1991).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+ion+transport.+Part+one%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Human airway ion transport. Part one.</a> Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).</li>
<li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+an+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).</li>
<li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Moss, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+an+Arg117His-CFTR+mutation%3A+a+double-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. , (2015).</li>
<li>Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor+alone+and+combined+with+ivacaftor%3A+preclinical+and+clinical+trial+experience+of+F508del+CFTR+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction.</a> Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CFTR2+Database%22">CFTR2 Database</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.cftr2.org">www.cftr2.org</a> (2017).</li>
<li>Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+for+cystic+fibrosis%3A+establishing+human+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems.</a> Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).</li>
<li>Worthington, E. N., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+ASL+measurements+and+mucus+transport+rates+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Hug, M. J., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurements+to+diagnose+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).</li>
<li>van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+biochemical+analysis+of+CFTR+in+human+rectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies.</a> Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+modulators+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Zomer-van Ommen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. , (2015).</li>
<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).</li>
<li>Di Lullo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%26%2334%3Bex+vivo+model%26%2334%3B+contributing+to+the+diagnosis+and+evaluation+of+new+drugs+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otorhinolaryngol+Ital%22%5BJournal%5D)">An &#34;ex vivo model&#34; contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis.</a> Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).</li>
<li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).</li>
<li>Devalia, J. L., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+in+culture%3A+an+overview+of+their+characteristics+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function.</a> Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).</li>
<li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).</li>
<li>Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+can+act+as+a+physiological+surrogate+for+paediatric+asthma+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies.</a> PLoS One. 9 (1), e85802(2014).</li>
<li>Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preservation+and+regeneration+of+cilia+on+human+nasal+epithelial+cells+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro.</a> Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> J Cyst Fibros. , (2017).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+downregulation+of+distinct+chloride+channels+in+cystic+fibrosis-affected+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia.</a> PLoS One. 9 (9), e106842(2014).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+airway+surface+dehydration+as+the+initiating+event+in+CF+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease.</a> J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje generowanie hodowli sferoidalnych komórek nosa pochodzących od pacjenta, które są w stanie wytworzyć zindywidualizowany, specyficzny model funkcji CFTR. Istnieje kilka kluczowych kroków w procesie, które należy uważnie obserwować, aby uniknąć trudności. Pierwszym z nich jest dobre pobranie próbki z nosa pacjenta. Dobra próbka powinna mieć >50 000 komórek, ograniczoną ilość śluzu/zanieczyszczeń i być gotowa do przetworzenia w ciągu 4 godzin (chociaż sukces jest również łatwy do osiągnięcia dzięki nocn...

Mukowiscydoza (CF) jest śmiertelną, autosomalną recesywną chorobą, która dotyka ponad 70 000 osób na całym świecie1. Ta skracająca życie choroba genetyczna jest spowodowana mutacjami w białku regulatora przewodnictwa transbłonowego mukowiscydozy (CFTR)<klasa sup="xref">2. CFTR należy do rodziny kaset wiążących trifosforan adenozyny i działa jako kanał jonowy umożliwiający ruch chlorków i wodorowęglanów przez błony wierzchołkowe wielu spolaryzowanych nabłonków, w tym między innymi przewodu pokarmowego, gruczołu potowego i drzewa oddechowego3,4. W związku z tym dysfunkcyjny CFTR prowadzi do dysfunkcji nabłonka wieloukładowego, przy czym większość śmiertelności wynika z choroby układu oddechowego1. W płucach z mukowiscydozą utrata regulacji powierzchni dróg oddechowych (ASL) i uwalnianie śluzu przez CFTR prowadzi do zagęszczenia śluzu, niedrożności dróg oddechowych, przewlekłej infekcji oraz postępującej przebudowy dróg oddechowych i utraty funkcji płuc1,5.
Pomimo identyfikacji dysfunkcji CFTR jako przyczyny choroby, terapie w CFTR tradycyjnie koncentrowały się na łagodzeniu objawów (np. terapia zastępcza enzymami trzustkowymi, terapie oczyszczające drogi oddechowe)1. Podejście to zostało niedawno zrewolucjonizowane przez pojawienie się nowych środków terapeutycznych, określanych jako "modulatory CFTR", które są bezpośrednio ukierunkowane na dysfunkcyjny CFTR. To podejście zmieniło krajobraz kliniczny z leczenia objawów na opiekę modyfikującą przebieg choroby, ale niesie ze sobą kilka ograniczeń6,7,8,9,10. Aktywność modulatora jest specyficzna dla defektu białka towarzyszącego każdej mutacji CFTR i ograniczona do wybranych populacji genetycznych11. Ograniczenie to wynika z niejednorodnego charakteru defektów białek, ale także z niepraktyczności badań klinicznych w grupach z rzadkimi mutacjami. Ponadto wśród osób o dobrze zbadanych genotypach (np. F508del/F508del CFTR, najczęstsza mutacja CFTR), występuje duża zmienność w obciążeniu chorobą i odpowiedzi modulatora6,7,8,9,11.
Aby przezwyciężyć oba te problemy, badacze zaproponowali użycie spersonalizowanych modeli do badań przedklinicznych12. Koncepcja ta wykorzystuje tkankę specyficzną dla pacjenta do wygenerowania zindywidualizowanego systemu modelowego ex vivo do testowania związków, przewidując reakcję pacjenta in vivo na terapie w spersonalizowany sposób. Po walidacji taki model może być wykorzystywany przez klinicystów do prowadzenia terapii precyzyjnej niezależnie od podstawowego genotypu CFTR pacjenta.
Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBE) uzyskane z tkanki eksplantacji w czasie przeszczepu płuc ustaliły możliwość takiego modelu dla CF13,14. HBE hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) pozwalają na funkcjonalną kwantyfikację CFTR bezpośrednio za pomocą testów elektrofizjologicznych lub pośrednio za pomocą pomiarów homeostazy ASL13,15. Model ten miał kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii CFTR i był kluczowym czynnikiem w rozwoju modulatorów CFTR16. Niestety, modele HBE nie są możliwe do utrzymania jako model spersonalizowany ze względu na inwazyjny charakter pozyskiwania (przeszczep płuc lub szczotkowanie oskrzeli) oraz brak próbek dla osób z rzadkimi mutacjami lub łagodną chorobą. I odwrotnie, tkanka jelitowa, uzyskana z próbek z biopsji odbytnicy lub dwunastnicy, może być wykorzystana do pomiaru prądu jelitowego (ICM) lub testu organoidowego opartego na obrzęku do badania zindywidualizowanej funkcji CFTR17,18,19. Testy organoidowe, w szczególności, są bardzo czułymi modelami aktywności CFTR20,21,22. Oba modele są ograniczone przez źródło tkankowe (tkanka jelitowa, podczas gdy większość patologii chorobowej ma charakter oddechowy) i półinwazyjną metodę pozyskiwania. Alternatywnie, kilku badaczy badało ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) w celu modelowania odbudowy CFTR23,24,25. HNE mogą być bezpiecznie zbierane za pomocą pędzla lub łyżeczkowania u osób w każdym wieku, a gdy są hodowane w ALI, podsumowują wiele cech HBEs25,26,27,28. Kultury jednowarstwowe HNE były tradycyjnie ograniczone transformacją płaskonabłonkową i długim czasem do dojrzałości29. Co więcej, zgłoszone pomiary prądu zwarciowego w HNE są mniejsze niż w HBE, co sugeruje mniejsze okno do wykrycia skuteczności terapeutycznej25.
Biorąc pod uwagę potrzebę spersonalizowanego, nieinwazyjnego modelu hodowli tkanek oddechowych funkcji CFTR, staraliśmy się połączyć czułość testu organoidowego opartego na obrzęku z nieinwazyjnym i oddechowym charakterem HNE. W tym miejscu opisujemy naszą metodę generowania trójwymiarowych "sferoidalnych" kultur HNE do zindywidualizowanego badania CFTR w teście opartym na pęcznieniu30. Sferoidy HNE polaryzują się niezawodnie z wierzchołkiem nabłonka w kierunku środka kuli lub światła. Model ten podsumowuje wiele cech nabłonka dolnych dróg oddechowych i dojrzewa szybciej niż kultury ALI. Jako test funkcjonalny, sferoidy HNE niezawodnie określają ilościowo zakres funkcji CFTR, a także modulacji w dobrze zbadanych grupach mutacji (np. F508del CFTR). Ten test oparty na pęcznieniu wykorzystuje właściwości transportowe jonów / soli CFTR, pośrednio mierząc napływ płynu do sferoidy, gdy woda podąża za wierzchołkowym wypływem soli. W ten sposób stymulowane sferoidy z w pełni funkcjonalnym CFTR silnie pęcznieją, podczas gdy te z dysfunkcyjnym CFTR puchną mniej lub kurczą się. Jest to określane ilościowo poprzez analizę obrazu sferoid przed i 1 godziną po stymulacji, mierząc powierzchnię światła i określając zmianę procentową. Pomiar ten można następnie porównać w różnych grupach eksperymentalnych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem bioaktywności leku w sposób specyficzny dla pacjenta.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka Eppendorf</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Kolba filtracyjna 150 ml Midsci</td><td>&nbsp;</td><td>TP99150</td><td>Do filtrowania mediów</td></tr><tr><td>15 ml Rurka stożkowa</td><td>Midsci&nbsp;</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>1 L Kolba filtracyjna Midsci</td><td>&nbsp;</td><td>TP99950</td><td>Do filtrowania mediów</td></tr><tr><td>35 mm Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy 22,0 mg w 1 ml DMSO</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml Midsci</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Zobacz tabelę 1</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Zobacz tabelę 1</td></tr><tr><td>Ekstrakt z mózgu bydlęcego (9 mg / ml)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Hydrat ceftazydymu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Patrz Tabela 1</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek 20 cm&nbsp;</td><td>Średnia&nbsp;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Przygotuj 10 mM roztwór podstawowy 4,0 mg w 1 ml DMSO</td></tr><tr><td>Toksyna B (z Vibrio cholerae)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Zobacz tabelę 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Pędzel do cytologii</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>Podłoże podstawowe; Zobacz tabele 1 i 2</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (rekombinowane białko ludzkie, wolne od pochodzenia zwierzęcego)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045</td><td>Patrz Tabela 1</td></tr><tr><td>Epinefryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM roztwór; Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (wysokowydajny FBS)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>Patrz Tabela 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Przygotuj 10 mM roztwór podstawowy 4,1 mg w 1 ml</td></tr><tr><td>DMSO Growth Factor-Reduced Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Matryca błony podstawnej Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), bez czerwieni fenolu, bez LDEV, 10 ml.</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu ludzkiego, typ I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Zaawansowany BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Roztwór kolagenu</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Zobacz Tabelę 2</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Technologie StemCell</td><td>07904</td><td>Zobacz Tabele 1 i 2</td></tr><tr><td>Insulina, ludzka rekombinant, roztwór</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>roztwór o stężeniu 4 mg/ml; patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>4-dołkowe naczynie IVF, NUNC bez obróbki</td><td>(za pośrednictwem Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>4-dołkowa płytka do sferoid; wielkość studzienki zbliżona do płytki 24-dołkowej</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Napromieniowane mysie fibroblasty embrionalne</td></tr><tr><td>Urządzenia</td><td></td><td></td> <td>molekularne Metamorph 7.7Oprogramowanie analityczne; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software na wycenę</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX51</td><td>Firma Olympus Corporation</td><td>zaprzestała</td><td>produkcji mikroskopu do obrazowania. Zamiennik: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; za wycenę</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Fsophoryletheanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>Łyżeczka do nosa</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>Wycofane</td><td>oprogramowanie do obrazowania. Wymiana: Zeszyt slajdów 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook do wyceny</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych do</td></tr><tr><td>ekspansji Tobramycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Zobacz tabelę 1</td></tr><tr><td>Transferyna (transferyna ludzka 0,5 ml)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>Zobacz tabelę 2</td></tr><tr><td>Sól</td> sodowa 3,3&prime;,5-trijodo-L-tyroniny trójjodo-Aldricha <td></td><td>T6397-1G</td><td> [T3]; Zobacz tabelę 2</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (przez Fisher Scientific)</td> <td>NC0393024</td><td>20 ml lipofilizowanego proszku; Patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Chlorowodorek wankomycyny ze Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Patrz Tabela 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy 0,4 mg w 1 ml</td></tr><tr><td>DMSO VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Kupić lub przygotować 10 mM roztwór podstawowy 4,5 mg w 1 ml</td></tr><tr><td>dichlorowodorku DMSO Y-27632&nbsp; Inhibitor ROCK&nbsp;</td><td>Enzo Nauki Przyrodnicze&nbsp;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>Patrz tabela 1</td></tr></tbody></table>

generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Podczas gdy wprowadzenie leków modulujących CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) zrewolucjonizowało opiekę nad pacjentami z mukowiscydozą (CF), obecnie stosowany model terapii ukierunkowanej na genotyp ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, rzadkie lub niedostatecznie zbadane grupy mutacji są wykluczone z ostatecznych badań klinicznych. Co więcej, w miarę pojawiania się na rynku kolejnych leków modulujących, trudno będzie zoptymalizować wybór modulatorów dla poszczególnych pacjentów. Oba te zagadnienia są rozwiązywane za pomocą opracowanych przez pacjenta, zindywidualizowanych modeli przedklinicznych funkcji i modulacji CFTR. Ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) są łatwo dostępnym źródłem tkanki oddechowej dla takiego modelu. W niniejszym artykule opisano generowanie trójwymiarowego modelu sferoidalnego funkcji i modulacji CFTR przy użyciu pierwotnych HNE. HNE są izolowane od badanych w minimalnie inwazyjny sposób, namnażane w warunkach warunkowego przeprogramowania i zasiewane do kultury sferoidalnej. W ciągu 2 tygodni od wysiewu kultury sferoidalne wytwarzają sferoidy HNE, które mogą być stymulowane przez agonistów wytwarzających 3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) w celu aktywacji funkcji CFTR. Obrzęk sferoidalny jest następnie określany ilościowo jako wskaźnik aktywności CFTR. Sferoidy HNE wykorzystują minimalnie inwazyjne, ale oddechowe pochodzenie komórek nosa, aby wygenerować dostępny, spersonalizowany model odpowiedni dla nabłonka odzwierciedlającego zachorowalność i śmiertelność choroby. W porównaniu z kulturami HNE na granicy faz powietrze-ciecz, sferoidy dojrzewają stosunkowo szybko, co zmniejsza ogólny wskaźnik zanieczyszczenia. W swojej obecnej formie model jest ograniczony niską przepustowością, choć jest to równoważone przez względną łatwość pozyskiwania tkanek. Sferoidy HNE mogą być wykorzystywane do wiarygodnego ilościowego określania i charakteryzowania aktywności CFTR na poziomie indywidualnym. Trwające badanie mające na celu powiązanie tej kwantyfikacji z odpowiedzią na leki in vivo określi, czy sferoidy HNE są prawdziwym przedklinicznym predyktorem odpowiedzi pacjenta na modulację CFTR.

HNE powinny przytwierdzić się do naczynia hodowlanego i utworzyć małe wyspy komórek w ciągu 72 h od wysiania; przykłady prawidłowego i nieprawidłowego tworzenia wysp po jednym tygodniu przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1A i 1B. Wyspy te powinny rozszerzać się, pokrywając naczynie w ciągu 15–30 dni. Małe lub suboptimalne próbki mogą wymagać więcej czasu i często nie pozwalają na uzyskanie użytecznych sferoidów. Skażenie czynnikami zakaźnymi...

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Ogólna procedura polega na wygenerowaniu sferoid ludzkich komórek nosa, które ostatecznie mogą być wykorzystane jako test do funkcjonalnych badań CFTR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mukowiscydozy, takie jak ocena reakcji indywidualnego pacjenta na leki zmieniające CFTR w systemie modelowym ex vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba sferoid jest generowana w stosunkowo krótkim czasie z małej próbki komórek nosa, co pozwala na szeroko zakrojone testy.Procedurę zademonstrują Lauren Strecker i Jessica Moncivaiz, technicy z mojego laboratorium. Po przetworzeniu i rozprężeniu komórek ludzkiego nabłonka nosa lub HNE na fibroblastach zasilających zgodnie z protokołem tekstowym, przynieś wcześniej przygotowaną pożywkę ekspandacyjną, pożywkę różnicującą, 0,1% roztwór trypsyny EDTA i sterylny PBS do temperatury pokojowej przez ponad 30 minut. Następnie użyj 70% etanolu do oczyszczenia pojemników i przenieś je do czystej szafki bezpieczeństwa biologicznego.W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety Pasteura podłączonej do linii próżniowej, aby odessać i wyrzucić pożywkę z hodowli HNE. Następnie za pomocą czystej pipety serologicznej

generation-human-nasal-epithelial-cell-spheroids-for-individualized

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ten protokół opisuje test do pomiaru funkcji CFTR i odpowiedzi modulatora CFTR w hodowanej tkance od osób z mukowiscydozą (CF). Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji pęcznieją w sposób napędzany przez cAMP, odpowiedź ta jest wadliwa (lub silnie zmniejszona) w organoidach CF i może zostać przywrócona przez ekspozycję na modulatory CFTR.

Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Rehabilitacja oddechowa jest powszechnie uznawana w leczeniu chorób układu oddechowego. Kluczowym elementem udanej rehabilitacji oddechowej jest przestrzeganie zalecanego treningu fizycznego. Celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu, w jaki technologia ciągłego śledzenia danych może być wykorzystana do precyzyjnego pomiaru przestrzegania zalecanej intensywności treningu aerobowego.

Wykorzystanie technologii ciągłego śledzenia danych do badania przestrzegania zaleceń dotyczących ćwiczeń w rehabilitacji pulmonologicznej

Naucz się generować sferoidy z ludzkich komórek nabłonka nosa do badań funkcji CFTR. Ta metoda pozwala oceniać odpowiedź na leki modyfikujące CFTR w modelu ex vivo.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Przeglądaj więcej filmów