Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Ogólna procedura polega na wygenerowaniu sferoid ludzkich komórek nosa, które ostatecznie mogą być wykorzystane jako test do funkcjonalnych badań CFTR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mukowiscydozy, takie jak ocena reakcji indywidualnego pacjenta na leki zmieniające CFTR w systemie modelowym ex vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba sferoid jest generowana w stosunkowo krótkim czasie z małej próbki komórek nosa, co pozwala na szeroko zakrojone testy.

Procedurę zademonstrują Lauren Strecker i Jessica Moncivaiz, technicy z mojego laboratorium. Po przetworzeniu i rozprężeniu komórek ludzkiego nabłonka nosa lub HNE na fibroblastach zasilających zgodnie z protokołem tekstowym, przynieś wcześniej przygotowaną pożywkę ekspandacyjną, pożywkę różnicującą, 0,1% roztwór trypsyny EDTA i sterylny PBS do temperatury pokojowej przez ponad 30 minut. Następnie użyj 70% etanolu do oczyszczenia pojemników i przenieś je do czystej szafki bezpieczeństwa biologicznego.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj pipety Pasteura podłączonej do linii próżniowej, aby odessać i wyrzucić pożywkę z hodowli HNE. Następnie za pomocą czystej pipety serologicznej użyj pięciu mililitrów PBS do umycia naczynia, dodając, mieszając i odsysając bufor. Dodaj pięć mililitrów 0,1% roztworu trypsyny EDTA do kultury i włóż ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na pięć minut.

Następnie pod odwróconym mikroskopem pod kątem od czterech do 10 razy sprawdź, czy komórki odłączają się od naczynia, stają się okrągłe i unoszą się na wodzie. Delikatnie postukaj w bok naczynia hodowlanego, aby usunąć komórki i, jeśli to konieczne, ponownie inkubuj naczynie przez dodatkowe pięć minut, aż większość komórek zostanie odłączona. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, dodaj pięć mililitrów pożywki ekspansyjnej do naczynia i zbierz cały płyn do oznakowanej sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Jeśli komórki pozostają przylegające do naczynia hodowlanego po trzech rundach trypsynizacji, użyj sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie uwolnić pozostałe komórki i za pomocą pięciu mililitrów pożywki ekspansyjnej umyj skrobak i naczynie i zbierz zawartość do tej samej oznakowanej stożkowej probówki. Odwirować probówkę o ciśnieniu 360 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i użyć jednego mililitra pożywki ekspansyjnej do ponownego zawieszenia osadu komórkowego.

Następnie użyj hemocytometru, aby policzyć komórki. Rozmrozić matrycę membrany podstawnej na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Oddzielić odpowiednią liczbę różnie trypsynizowanych komórek pasażowych do końcowego stężenia 500 000 komórek na mililitr matrycy.

W przypadku płytki czterodołkowej użyj 200 000 komórek i zbierz je do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwiruj mieszaninę komórek nie więcej niż 360 razy g przez pięć minut. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra całkowicie i ostrożnie odessać i wyrzucić pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.

Trzymaj probówkę z komórkami na lodzie, gdy nie obchodzisz się z nią aktywnie. Użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby dodać 100 mikrolitrów matrycy błony podstawnej na planowaną studnię do komórek. Nie opróżniając całkowicie końcówki pipety, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, pipetuj w górę i w dół, aby ostrożnie i dokładnie zawiesić komórki.

Poruszaj się szybko, aby uniknąć zestalenia się matrycy. Aby wysiać 100 mililitrowych podwielokrotności matrycy do każdej studzienki czterodołkowej płytki hodowlanej IVF, użyj czystych nożyczek, aby odciąć dystalną część o długości od trzech do czterech milimetrów od końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Ostrożnie i powoli odpipetować 100-mikrolitrową kroplę mieszaniny matrycy komórkowej do środka każdej studzienki, upewniając się, że kropla pozostaje kulista i nie dotyka boków dołka.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut, aż do zestalenia. Następnie ostrożnie odpipetować 500 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdego dołka, uważając, aby nie naruszyć kropli matrycy. Upewnij się, że podłoże zakrywa kroplę i dodaj więcej, jeśli to konieczne.

Aby wyhodować sferoidy HNE, za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, delikatnie zassaj całe podłoże ze studzienki, unikając matrycy, która zniszczy sferoidy. Następnie za pomocą świeżej jednomililitrowej końcówki pipety i unikając dotykania lub naruszania matrycy, delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki różnicującej do dołka wokół matrycy. Kontynuować inkubację sferoid, zastępując pożywkę różnicującą trzy razy w tygodniu, jak to właśnie pokazano.

Pod odwróconym mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu codziennie oceniaj morfologię sferoidów. Sferoidy powinny uformować się w ciągu trzech do pięciu dni od posiewu i osiągnąć dojrzałość w ciągu około 10 dni. HNE powinny przyczepić się do szalki hodowlanej i utworzyć małe wyspy w ciągu 72 godzin od wysiewu.

Przykłady dobrego i złego formowania się wysp w ciągu jednego tygodnia są pokazane tutaj. Wyspy powinny się rozszerzać, aby pokryć danie w ciągu 15 do 30 dni. W ciągu pierwszych trzech do czterech dni hodowli w macierzy powinny zacząć tworzyć się małe torbielowate struktury, które dojrzewają przez około 10 dni.

W przypadku posiewu z opisaną gęstością, udane kultury będą zawierały od 50 do 100 sferoid na kroplę matrycy. Światła mogą być stosunkowo czyste, jak w przypadku CFTR typu dzikiego, lub wypełnione szczątkami komórkowymi i śluzem, jak w sferoidach CF. Maskowanie w celu wyznaczenia obszaru świetlnego sferoid jest pokazane w tych dwóch panelach.

Pokazano tu przykłady słabo uformowanych, nieudanych kultur sferoidalnych. Jak pokazano na tych wykresach z testów funkcjonalnych, sferoidy od osób z CFTR typu dzikiego powinny pęcznieć przez ponad godzinę podczas stymulacji i powinny puchnąć mniej lub kurczyć się, jeśli są stymulowane w obecności inhibitora CFTR inh-172. Sferoidy od pacjenta homozygotycznego pod względem F508del-CFTR powinny albo kurczyć się, albo pęcznieć bardzo nieznacznie ze zwiększonym obrzękiem lub mniejszym kurczeniem się, gdy są korygowane farmakologicznie za pomocą modulatorów CFTR VX809 i VX770.

Po opanowaniu wysiewanie sferoid komórek nosa można wykonać w ciągu 15 do 20 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu czystości procedur operacyjnych w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia próbki i uniknąć wszelkich zagrożeń dla własnego zdrowia. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak utrwalanie, barwienie i mikroskopia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące morfologii i składu komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować pierwotne sferoidy ludzkich komórek nosa, które można wykorzystać jako spersonalizowany test funkcji CFTR. Nie zapominaj, że praca z pierwotnymi tkankami ludzkimi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak właściwe stosowanie środków ochrony osobistej.