Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

Protokół ten zapewnia technikę zwiększania wydajności ładowania płytki do ekstrakcji DNA z 96 dołkami przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego próbki. Technika ta zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia podczas krytycznego pierwszego etapu ekstrakcji DNA poprzez indywidualne dodawanie próbek do każdego dołka w 96-dołkowej płytce. Metodologia ta może być stosowana w każdej z różnych dziedzin badań nad mikrobiomem.

Przed rozpoczęciem eksperymentu spryskaj blat stołu 70% etanolem. Po wytarciu pozostaw ławkę do wyschnięcia na powietrzu przed spryskaniem ławki 10% wybielaczem. Po wytarciu i wysuszeniu na powietrzu zanurz mikroskopijne, szpatułkowe i zakrzywione nożyczki chirurgiczne w 95% etanolu i wystaw narzędzia na działanie płomienia.

Następnie zanurz każde narzędzie w 10% wybielaczu i pozostaw narzędzia do wyschnięcia na powietrzu. Przed pobraniem podpróbki etanol wysterylizuj rękawice i dokładnie homogenizuj próbki gleby. Następnie przypisz identyfikator próbki z lokalizacją studni do każdej probówki.

Napełnij 95 oznaczonych dwiema mililitrowymi probówkami wirówkowymi jedną próbką na probówkę, aż każda probówka będzie w przybliżeniu wypełniona do połowy. 96. probówka powinna być używana jako półfabrykat ekstrakcyjny. Umieść probówki z podpróbkami na lodzie i oznacz 96 sterylnych probówek PCR z płaską nasadką o pojemności 200 mikrolitrów zgodnie z etykietami studzienek dla płytki 96-dołkowej, a następnie umieść probówki z etykietą o pojemności 200 mikrolitrów w kolejności w stojaku 96-dołkowym.

Aby przygotować 96-dołkową płytkę do eksperymentu, zdejmij pokrywę z płytki i umieść ją w sterylnej plastikowej torbie. Zamknij worek, aby zapobiec zanieczyszczeniu i przykryj płytkę wstępnie wyciętym kawałkiem przebijanej folii uszczelniającej. Następnie za pomocą gumowego wałka mocno przyklej uszczelkę do płytki i przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby przenieść podpróbki na płytkę, umieść 24 z dwóch mililitrowych probówek z podpróbkami w bloku lodu do przechowywania w chłodni i użyj nazwy próbki i arkusza lokalizacji studzienki, aby wybrać odpowiednie probówki z płaską nakrętką o pojemności 200 mikrolitrów. Wirować podpróbki pojedynczo przez pięć sekund na próbkę, aby zapewnić homogenizację i załadować około 200 mikrolitrów każdej próbki do odpowiedniej odpowiedniej probówki do PCR. Po załadowaniu wszystkich 24 próbek użyj bielonej chusteczki papierowej nasączonej wybielaczem, aby wyczyścić zewnętrzną część jednej probówki do PCR, a następnie odwróć i postukaj w probówkę na stole, aby przesunąć próbkę na górę probówki.

Za pomocą wysterylizowanych płomieniowo i wybielonych nożyczek przypnij spód probówki do PCR, aby utworzyć otwór dla próbki, a następnie przełóż probówkę nad płytką odciętym końcem skierowanym do góry, aż do osiągnięcia odpowiedniego dołka. Lekko przechyl płytkę, aby ułatwić przebicie wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej, a gdy rurka znajduje się bezpośrednio nad właściwą studzienką, szybko, ale ostrożnie odwróć płytkę, aby przycięta końcówka pasowała do studni. Użyj wysterylizowanego narzędzia, aby postukać w górną część rurki, aż cała ziemia spadnie z rurki do studni.

I pozostaw rurkę w studni z zamkniętym przewodem. Gdy wszystkie próbki zostaną załadowane w ten sam sposób, wyjmij jedną probówkę do PCR o pojemności 200 mikrolitrów z płaską nakrętką i dodaj 750 mikrolitrów roztworu kulek do dołka próbki. Umieść probówkę PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 mikrolitrów z powrotem do studzienki, wciskając ją do końca do studzienki.

I użyj Sharpie, aby zaznaczyć górną część rury, aby wskazać, że studnia została załadowana. Gdy wszystkie studzienki zostaną załadowane kulkami, umieść 24 probówki z próbkami w magazynie w temperaturze 20 stopni Celsjusza i dodaj 24 nowe probówki z podpróbkami do bloku lodu, aby umożliwić załadowanie następnego zestawu próbek do płytki 96-dołkowej, jak właśnie pokazano. Gdy wszystkie 95 studzienek zostanie załadowanych roztworem próbki i kulek, dodaj roztwór kulek tylko do 96. dołka.

Usuń wszystkie rurki, przepuszczając je tylko nad zakrytymi studzienkami i ostrożnie usuń przebijalną folię z płyty. Następnie ostrożnie przenieś pokrywę płytki z plastikowej torebki na płytkę i umieść płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza do planowanego ekstrakcji. Porównanie metod ładowania płytek pokazuje, że zademonstrowana metoda skutkuje najniższym stężeniem DNA w ślepych studzienkach.

Przy zastosowaniu tej metody stężenie DNA było znacznie niższe niż przy zastosowaniu metody zaproponowanej przez McPhersona i wsp. Chociaż stężenie DNA tą metodą nie różniło się statystycznie od metody domyślnej qiagen. Wszystkie trzy metody dają średnie stężenia DNA poniżej dwóch nanogramów na mikrolitr.

Chociaż tylko ta nowa metoda wytwarza studnie bez mierzalnego stężenia DNA. Aby zminimalizować ryzyko rozlania, trzymaj rurkę o pojemności 200 mikrolitrów pionowo podczas przesuwania jej po talerzu, przechyl płytkę i włóż rurkę do odpowiedniej studzienki.