Name: Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę ładowania płytek 96-well do ekstrakcji DNA, która znacząco zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Technika ta poprawia integralność próbek w badaniach mikrobiomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Microbial Ecology Collaborative z finansowaniem z nagrody NSF #EPS-1655726.

1. Stół laboratoryjny i przygotowanie narzędzi do załadunku płytki 96-dołkowej
<ol>
	<li>Przezroczysty blat przez zraszanie 70% etanolem. Wytrzyj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed spryskaniem blatu 10% wybielaczem. Wytrzyj blat do sucha.</li>
	<li>Wysterylizuj mikroczerpak, szpatułkę i nożyczki chirurgiczne (zakrzywione), zanurzając je w 95% etanolu, a następnie wystawij na działanie płomienia. Zanurz każdy z nich w 10% wybielaczu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. 
	UWAGA: Narzędzia powinny być sterylizowane między każdą próbką.</li>
</ol>
2. Podpróbkowanie i przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wysterylizuj rękawice przy użyciu etanolu przed pobraniem podpróbek.</li>
	<li>Dokładnie homogenizować próbki gleby przed pobraniem podpróbek.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych narzędzi załaduj oznakowaną probówkę wirówkową o pojemności 2 ml próbką do około połowy wypełnionej.</li>
	<li>Powtarzać krok 2.2 do momentu, gdy wszystkie 95 próbek zostanie podpobranych do oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml. Studzienka 96powinna być używana jako ślepa próba ekstrakcyjna. 
	UWAGA: Kroki 2.3 i 2.4 mają na celu zminimalizowanie wymaganej przestrzeni dyskowej i zapobieżenie nadmiernemu lub podwójnemu próbkowaniu.</li>
	<li>Przechowywać 2 ml probówek z podpróbkami na lodzie do czasu załadowania płytki.</li>
	<li>Etykieta 96 sterylnych probówek PCR z płaską nakrętką 200 μl A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Umieść te probówki w kolejności w 96-dołkowym stojaku.</li>
	<li>Przypisz identyfikator próbki do lokalizacji odwiertu (A1\u2012H12) i zapisz go.</li>
</ol>
3. Przygotowanie talerza
<ol>
	<li>Zdejmij gumową osłonę z płytki 96-dołkowej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A–1C) i umieść ją w sterylnej plastikowej torbie (patrz tabela materiałów). Zamknij plastikową torbę, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Przykryj 96-dołkową płytkę folią uszczelniającą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D–1E); na przykład użyj wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej (patrz Tabela materiałów). Zapewnić uszczelnienie, zwijając gumową rolkę. 
	UWAGA: Maty silikonowe do przekłuwania mogą potencjalnie stanowić opcję wielokrotnego użytku, pod warunkiem odpowiedniego czyszczenia między użyciami, ale testowane przez nas maty silikonowe łatwo pękają wzdłuż przekłuć i nie zapewniają równej ochrony żadnym następnym płytom.</li>
	<li>Umieść talerz w lodówce (4 °C), aby ostygł</li>.
</ol>
4. Transfer podpróbek
UWAGA: Zobacz krok 4.13, aby zapoznać się z modyfikacjami, gdy próbka gleby jest bardzo mała.
<ol>
	<li>Umieścić 24 z 2 ml podpróbek w bloku lodu do przechowywania w chłodni.</li>
	<li>Korzystając z nazwy próbki i arkusza lokalizacji studzienki, wybierz odpowiednią probówkę do PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Weź probówkę z podpróbką o pojemności 2 ml i wiruj przez ~5 s, aby zapewnić homogenizację.</li>
	<li>Używając narzędzi sterylizowanych płomieniem i wybielaczem, załaduj ~200 μL pierwszej próbki do odpowiedniej probówki PCR z płaską nakrętką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.2\u20124.4, aż wszystkie 24 próbki zostaną załadowane. Następnie przejdź do kroku 4.6.</li>
	<li>Za pomocą papierowej chusteczki nasączonej wybielaczem wyczyść zewnętrzną część probówki do PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Odwróć probówkę i postukaj w ławkę, aby przesunąć próbkę na górę probówki. Za pomocą wybielonych i wysterylizowanych płomieniowo nożyczek przypnij spód probówki do PCR, aby utworzyć otwór, przez który próbka wpadnie do 96-dołkowej płytki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G).</li>
	<li>Zlokalizuj właściwą studzienkę na 96-dołkowej płytce i przełóż rurkę w poprzek płytki z odciętym końcem skierowanym do góry, aż dotrze do tej studni. Lekko przechyl płytkę, aby ułatwić przebicie wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej, a tylko wtedy, gdy rurka znajduje się bezpośrednio nad właściwą studnią, ostrożnie odwróć ją tak, aby przycięta końcówka pasowała do studzienki. Za pomocą wysterylizowanych narzędzi postukaj w górną część probówki do PCR, aż cała ziemia spadnie z probówki do studzienki. Pozostaw probówkę w studni z zamkniętą pokrywą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H–1J).</li>
	<li>Wyjmuj po jednej probówce PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl na raz i dodaj do niej 750 μl roztworu kulek (ryc. 1K). Wepchnij probówkę PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 μl do samego dołu do studzienki i zaznacz górę sharpie, aby wskazać, że ta studzienka została załadowana. Powtórzyć tę czynność dla każdej próbki.</li>
	<li>Po załadowaniu wszystkich 24 próbek i dodaniu roztworu kulek należy wyjąć probówki z podpróbkami o pojemności 2 ml i zastąpić je 24 probówkami bez próbek. </li>
	<li>Powtarzaj kroki 4.1\u20124.10, aż wszystkie 95 studzienek zostanie załadowanych próbką lub roztworem ślepej próby i kulek. Wyjmij probówki bez przepuszczania ich przez otwarte studzienki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1L).</li>
	<li>Ostrożnie usuń przebijalną folię i załóż gumową osłonę, aby chronić płytkę do momentu rozpoczęcia ekstrakcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1M–1O).</li>
	<li>W przypadku bardzo małych ilości gleby, które są również drobnoziarniste, dodaj 750 μl roztworu kulek do probówki z próbką i użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść całą zawartość do odpowiedniego dołka. Umieść probówkę PCR w otworze, aby zapobiec podwójnemu ładowaniu. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wdrażania tej modyfikacji, ponieważ cząstki materii organicznej lub małe fragmenty skał większe niż otwór końcówki pipety mogą zatkać pipetę i utrudnić przenoszenie zawiesiny próbki.</li>
	<li>W razie potrzeby zamrozić w temperaturze -20 °C i przechowywać płytki wypełnione próbką i roztworem kulek do czasu planowanej ekstrakcji.</li>
</ol>
5. Porównanie metod ładowania płyt
UWAGA: Aby zweryfikować naszą nowatorską metodę ładowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA, podzieliliśmy pojedynczą 96-dołkową płytkę na trzy sekcje. Użyliśmy trzech różnych metod obciążania płyt, aby porównać możliwość niezamierzonego obciążenia gleby i zanieczyszczenia krzyżowego. Trzy metody, których użyliśmy, to metody opisane w McPherson et al.9, domyślnym protokole ładowania Qiagen10, oraz protokole, który opisujemy w tej publikacji.
<ol>
	<li>Ładowanie ziemi do płyty
	<ol>
		<li>Przeciąć 96-dołkową płytkę na trzy czterokolumnowe bloki. Załaduj każdy blok za pomocą jednej z trzech metod wymienionych powyżej.</li>
		<li>Załaduj ziemię do każdej innej studzienki, tak aby próbka i puste studzienki były rozłożone naprzemiennie. Taki układ pozwala na maksymalne ryzyko niezamierzonego obciążenia próbki i zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
		<li>Zamrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA
	<ol>
		<li>Ekstrakcja DNA zgodnie z protokołem ekstrakcji płytki 96-dołkowej producenta10.</li>
		<li>Przechowywać ekstrakty DNA w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja DNA w ślepych studzienkach
	<ol>
		<li>Rozmrozić ekstrakty DNA w temperaturze pokojowej, odwirować i odwirować za pomocą wirówki do płytek.</li>
		<li>Mierzyć i rejestrować stężenia DNA w ślepych studzienkach za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Użyj ANVOA i testu post-hoc Tukey'a, aby przeanalizować różnice w średnim stężeniu DNA w ślepych studzienkach. 
		UWAGA: Istotne różnice odnotowano przy α = 0,05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+communal+catalogue+reveals+Earth%27s+multiscale+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li>
<li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li>
<li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li>
<li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618(2019).</li>
<li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Phytobiomes+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li>
<li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186(2019).</li>
<li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lot+on+your+plate%3F+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362(2019).</li>
<li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies%3A+issues+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li>
<li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere%2C+and+roots+in+perennial+grass+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932(2018).</li>
<li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQiagen%2C+DN+%22easy+PowerSoil+HTP+96+Kit+Handbook%22">easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook</a>. , Hilden, Germany. (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta zmniejsza możliwość zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami podczas ładowania płytek do ekstrakcji próbek o wysokiej przepustowości i oferuje bardziej kontrolowane sposoby ładowania płytek 96-dołkowych poza istniejącymi strategiami ładowania płytek 9,10. Zanieczyszczenie między odwiertami może być bardziej rozpowszechnione w przypadku ekstrakcji płytkowej 96-dołkowej niż w przypadku ekstrakcji jednoprobówkowej, zwłaszcza w przypadku zautomatyzowan...

Ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu społeczności mikroorganizmów zapewniają niezrównaną głębię sekwencjonowania, a co za tym idzie, bezprecedensowy wgląd w funkcjonowanie i różnorodność mikrobiomu Ziemi1. Wraz ze wzrostem możliwości multipleksowania coraz większej liczby próbek na jednym torze sekwencjonowania, ekstrakcja DNA z jednej probówki może stać się krokiem ograniczającym szybkość generowania danych ekologicznych. Jednak nowe metody wysokoprzepustowej ekstrakcji DNA dają nadzieję na przetwarzanie dużych ilości próbek środowiskowych z większą wydajnością niż było to wcześniej możliwe2. Metody te często polegają na użyciu płytek 96-dołkowych zamiast pojedynczych probówek, zwiększając w ten sposób możliwą liczbę ekstrakcji, które mogą odbywać się jednocześnie. W związku z tym praktyczność i wydajność wysokowydajnych metod ekstrakcji są oczywiste i zostały wdrożone do przetwarzania próbek środowiskowych od soil3,4 i plant tissues3,5 do ludzkiego kału class2.
Chociaż te metody mogą znacznie przyspieszyć proces przetwarzania próbek i ekstrakcji DNA, początkowy etap ładowania gleby i innych próbek ekologicznych do 96-dołkowych płytek jest podatny na zanieczyszczenie krzyżowe. Ten rodzaj zanieczyszczenia typu "od studni do studni" może wystąpić podczas ekstrakcji DNA6,7,8, a studnie są szczególnie wrażliwe w tym pierwszym etapie, zanim próbki zostaną zawieszone w roztworze buforowym. McPherson et al.9 demonstrują metodę ładowania gleb ryzosferowych do 96-dołkowych płytek za pomocą lejków i 8-dołkowych pokryw paskowych PCR, ale chociaż ich metoda jest bardziej kontrolowanym podejściem do ładowania płytek, nadal zapewnia wiele możliwości zanieczyszczenia sąsiednich studni podczas ładowania każdej próbki. Dodatkowo, otwarte studnie dają szansę rozproszonemu badaczowi na umieszczenie próbki w niewłaściwej studni lub dodanie próbki do studni, która została już załadowana. Ponadto różne typy próbek okazują się nieodpowiednie do ładowania tą metodą; Mokre próbki często przyklejają się do lejków, a suche próbki "przeskakują" między studzienkami z powodu elektryczności statycznej.
Aby zmniejszyć możliwości zanieczyszczenia między studniami w pierwszym etapie wysokoprzepustowej ekstrakcji DNA, opracowaliśmy nowe podejście do ładowania próbek gleby do 96-dołkowych płytek. Nasze metody zarówno chronią studzienki przed narażeniem na działanie środowiska, jak i zapobiegają przypadkowemu załadowaniu wielu próbek do jednej studzienki (podwójne ładowanie). Uważamy, że opisana poniżej metoda daje nadzieję na zmniejszenie potencjału zanieczyszczenia i jako taka zapewnia bardziej kontrolowany sposób ładowania 96-dołkowych płytek do późniejszej ekstrakcji DNA.

<table><tbody><tr><td>18 uncji WhirlPak</td><td>Nasco</td><td>B01065</td><td></td></tr><tr><td>2 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L probówki do mikro-PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB 2000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy zestaw do ekstrakcji DNA PowerSoil</td><td>Qiagen</td><td>12955-4</td><td>Użyliśmy zestawu do ekstrakcji gleby, ale każdy zestaw do formatu 96-dołkowego będzie działał.</td></tr><tr><td>Blok lodu do probówek wirówkowych 2 ml</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Dowolna Dowolna blok lodu wykonany na probówki 2 ml będzie działać</td></tr><tr><td>Blok lodu na 200 i mikro; L probówki micro-PCR</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna dowolna blok lodu wykonana dla 200 i mikro; Rurki L będą działać</td></tr><tr><td>Micro scoopula</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td></td></tr><tr><td>wstępnie przycięta przebijalna folia uszczelniająca</td><td>Excel Scientific</td><td>XPS25</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Dowolne</td><td>Dowolne</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji dna zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

Techniki sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości znacząco przyczyniły się do postępu w naszym zrozumieniu relacji między społecznościami mikroorganizmów, charakterystyki gospodarzy i szerszych funkcji ekosystemu. Wraz z tym szybkim wzrostem zakresu i głębokości możliwości sekwencjonowania pojawiły się metody ekstrakcji, amplifikacji, analizy i interpretacji środowiskowego DNA z maksymalną wydajnością. Niestety, szybkie przeprowadzanie ekstrakcji DNA może odbywać się kosztem zwiększenia ryzyka zanieczyszczenia próbek. W szczególności ekstrakcje o wysokiej przepustowości, które opierają się na próbkach zawartych w 96-dołkowej płytce, oferują stosunkowo szybką metodę w porównaniu z ekstrakcjami jednoprobówkowymi, ale także zwiększają możliwości zanieczyszczenia krzyżowego między odwiertami. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami, przy jednoczesnym zachowaniu korzyści płynących z wysokoprzepustowych technik ekstrakcji, opracowaliśmy nową metodę ładowania próbek środowiskowych do 96-dołkowych płytek. Użyliśmy przebijalnych folii uszczelniających PCR, aby pokryć każdą płytkę podczas ładowania próbek i najpierw dodaliśmy próbki do probówek PCR przed przeniesieniem ich do studzienek; Łącznie praktyki te zmniejszają ryzyko dryftu próbki i niezamierzonego podwójnego załadunku studni. Metoda opisana w tym artykule zapewnia naukowcom podejście do maksymalizacji dostępnych technik ekstrakcji o wysokiej przepustowości przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego nieodłącznie związanego z płytkami 96-dołkowymi. Przedstawiamy szczegółowy opis krok po kroku, jak przejść od pobrania próbki do ekstrakcji DNA, jednocześnie minimalizując ryzyko niepożądanego zanieczyszczenia krzyżowego.

Tę nową metodę zastosowano pomyślnie do napełniania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Porównanie metod napełniania płytek wykazało, że nasza metoda zapewnia najniższe stężenie DNA w dołkach kontrolnych (blank). Stężenie DNA w dołkach kontrolnych było znacząco niższe niż w metodzie zaproponowanej przez McPherson i wsp.9 (p &lt; 0.05), choć stężenia DNA w naszej metodzie nie różniły się statystycznie od domyślnej metody firmy Qiagen (Rysunek 2). Wszystkie trzy meto...

Obecne metody ładowania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA mogą być podatne na zanieczyszczenie. Szczegółowo opisujemy nową metodę załadunku płytek 96-dołkowych, która zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między studniami. Nasza metoda pomoże innym badaczom wykorzystać skuteczność wysokoprzepustowych technik ekstrakcji DNA i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Protokół ten zapewnia technikę zwiększania wydajności ładowania płytki do ekstrakcji DNA z 96 dołkami przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego próbki. Technika ta zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia podczas krytycznego pierwszego etapu ekstrakcji DNA poprzez indywidualne dodawanie próbek do każdego dołka w 96-dołkowej płytce. Metodologia ta może być stosowana w każdej z różnych dziedzin badań nad mikrobiomem.Przed rozpoczęciem eksperymentu spryskaj blat stołu 70% etanolem. Po wytarciu pozostaw ławkę do wyschnięcia na powietrzu przed spryskaniem ławki 10% wybielaczem. Po wytarciu i wysuszeniu na powietrzu zanurz mikroskopijne, szpatułkowe i zakrzywione nożyczki chirurgiczne w 95% etanolu i wystaw narzędzia na działanie płomienia.Następnie zanurz każde narzędzie w 10% wybielaczu i pozostaw narzędzia do wyschnięcia na powietrzu. Przed pobraniem podpróbki etanol wysterylizuj rękawice i dokładnie homogenizuj próbki gleby. Następnie przypisz identyfikator próbki z lokalizacją studni do każdej probówki.Napełnij 95 oznaczonych dwiema mililitrowymi probówkami wirówkowymi jedną próbką na probówkę, aż każda probówka będzie w przybliżeniu wypełniona do połowy. 96. probówka powinna być używana jako półfabrykat ekstrakcyjny. Umieść probówki z podpróbkami na lodzie i oznacz 96 sterylnych probówek PCR z płaską nasadką o pojemności 200 mikrolitrów zgodnie z etykietami studzienek dla płytki 96-dołkowej, a następnie umieść probówki z etykietą o pojemności 200 mikrolitrów w kolejności w stojaku 96-dołkowym.Aby przygotować 96-dołkową płytkę do eksperymentu, zdejmij pokrywę z płytki i umieść ją w sterylnej plastikowej torbie. Zamknij worek, aby zapobiec zanieczyszczeniu i przykryj płytkę wstępnie wyciętym kawałkiem przebijanej folii uszczelniającej. Następnie za pomocą gumowego wałka mocno przyklej uszczelkę do płytki i przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby przenieść podpróbki na płytkę, umieść 24 z dwóch mililitrowych probówek z podpróbkami w bloku lodu do przechowywania w chłodni i użyj nazwy próbki i arkusza lokalizacji studzienki, aby wybrać odpowiednie probówki z płaską nakrętką o pojemności 200 mikrolitrów. Wirować podpróbki pojedynczo przez pięć sekund na próbkę, aby zapewnić homogenizację i załadować około 200 mikrolitrów każdej próbki do odpowiedniej odpowiedniej probówki do PCR. Po załadowaniu wszystkich 24 próbek użyj bielonej chusteczki papierowej nasączonej wybielaczem, aby wyczyścić zewnętrzną część jednej probówki do PCR, a następnie odwróć i postukaj w probówkę na stole, aby przesunąć próbkę na górę probówki.Za pomocą wysterylizowanych płomieniowo i wybielonych nożyczek przypnij spód probówki do PCR, aby utworzyć otwór dla próbki, a następnie przełóż probówkę nad płytką odciętym końcem skierowanym do góry, aż do osiągnięcia odpowiedniego dołka. Lekko przechyl płytkę, aby ułatwić przebicie wstępnie przyciętej przebijalnej folii uszczelniającej, a gdy rurka znajduje się bezpośrednio nad właściwą studzienką, szybko, ale ostrożnie odwróć płytkę, aby przycięta końcówka pasowała do studni. Użyj wysterylizowanego narzędzia, aby postukać w górną część rurki, aż cała ziemia spadnie z rurki do studni.I pozostaw rurkę w studni z zamkniętym przewodem. Gdy wszystkie próbki zostaną załadowane w ten sam sposób, wyjmij jedną probówkę do PCR o pojemności 200 mikrolitrów z płaską nakrętką i dodaj 750 mikrolitrów roztworu kulek do dołka próbki. Umieść probówkę PCR z płaską nakrętką o pojemności 200 mikrolitrów z powrotem do studzienki, wciskając ją do końca do studzienki.I użyj Sharpie, aby zaznaczyć górną część rury, aby wskazać, że studnia została załadowana. Gdy wszystkie studzienki zostaną załadowane kulkami, umieść 24 probówki z próbkami w magazynie w temperaturze 20 stopni Celsjusza i dodaj 24 nowe probówki z podpróbkami do bloku lodu, aby umożliwić załadowanie następnego zestawu próbek do płytki 96-dołkowej, jak właśnie pokazano. Gdy wszystkie 95 studzienek zostanie załadowanych roztworem próbki i kulek, dodaj roztwór kulek tylko do 96. dołka.Usuń wszystkie rurki, przepuszczając je tylko nad zakrytymi studzienkami i ostrożnie usuń przebijalną folię z płyty. Następnie ostrożnie przenieś pokrywę płytki z plastikowej torebki na płytkę i umieść płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza do planowanego ekstrakcji. Porównanie metod ładowania płytek pokazuje, że zademonstrowana metoda skutkuje najniższym stężeniem DNA w ślepych studzienkach.Przy zastosowaniu tej metody stężenie DNA było znacznie niższe niż przy zastosowaniu metody zaproponowanej przez McPhersona i wsp. Chociaż stężenie DNA tą metodą nie różniło się statystycznie od metody domyślnej qiagen. Wszystkie trzy metody dają średnie stężenia DNA poniżej dwóch nanogramów na mikrolitr.Chociaż tylko ta nowa metoda wytwarza studnie bez mierzalnego stężenia DNA. Aby zminimalizować ryzyko rozlania, trzymaj rurkę o pojemności 200 mikrolitrów pionowo podczas przesuwania jej po talerzu, przechyl płytkę i włóż rurkę do odpowiedniej studzienki.

modified-methods-for-loading-high-throughput-dna-extraction-plates

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla wydajnego równoległego klarowania i oczyszczania plazmidowego DNA z kultur E. coli. Proces AcroPrep Advance rozpoczyna się od zoptymalizowanej płyty filtracyjnej do klarowania lizatu, a następnie obejmuje oczyszczanie na płycie filtracyjnej do wiązania DNA o wysokiej pojemności wiązania.

Uproszczone oczyszczanie plazmidowego DNA z kultur prokariotycznych

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety.  W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Poznaj zmodyfikowaną metodę ładowania płytek 96-well do ekstrakcji DNA, która znacząco zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Technika ta poprawia integralność próbek w badaniach mikrobiomowych.

Zmodyfikowane metody ładowania wysokoprzepustowych płytek do ekstrakcji DNA zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia

Przeglądaj więcej filmów