Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Rozwój i optymalizacja biosensorów pod kątem zastosowań biotechnologicznych to zakres naszych badań. W szczególności naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób zoptymalizować i zaprojektować biosensory poprzez modulację ich elementów genetycznych. Wybory projektowe oparte na intuicji, takie jak klasyczna inżynieria promotorów i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, są technikami rutynowo stosowanymi w charakterystyce i projektowaniu bioczujników.

Projektowanie metodologii eksperymentów nie zostało jeszcze powszechnie przyjęte w projektowaniu obwodów genetycznych. Dzięki temu protokołowi staramy się zwiększyć wykorzystanie tego typu technik w projektowaniu obwodów genetycznych i bioczujników. Na początek określ teoretyczną wielkość biblioteki i oblicz liczbę indywidualnych wariantów potrzebnych do zapewnienia więcej niż 95% pokrycia biblioteki.

Obliczyć wymaganą objętość pożywki bulionowej z lizogenii uzupełnionej antybiotykiem w zależności od liczby kolonii, które mają być badane przesiewowo. Otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy i kliknij uruchom obok programu do przesyłania cieczy MTP. Umieść przygotowane podłoże w odpowiedniej pozycji zbiornika.

Następnie wypełnij pokład pustymi płytkami do mikromiareczkowania zgodnie z układem. Ustaw program tak, aby dozował 200 mikrolitrów pożywki. Kliknij OK, aby potwierdzić start programu.

Teraz przenieś wypełnione studzienki na płytkę mikromiareczkową na platformę zbieracza kolonii i rozszczelnij i przenieś kwadratowe płytki ślimakowe Pseudomonas putida przekształcone z DNA biblioteki wariantów plazmidowych na platformę zbieracza kolonii. Użyj selektora kolonii, aby zaszczepić każdą wstępnie napełnioną studzienkę pojedynczą kolonią z płytek transformujących. Ponownie zamknąć zaszczepione płytki i przenieść je do inkubatora z wytrząsaniem w trybie offline.

Po inkubacji włóż wyhodowane płytki z powrotem na platformę do obsługi cieczy i rozszczelnić. Kliknij uruchom obok protokołu dodaj glicerol do MTP. Upewnij się, że układ płyt na ekranie jest zgodny z układem dokującym do obsługi cieczy.

I sekwencyjnie kliknij OK, aby protokół został uruchomiony. Po zakończeniu uszczelnij płytki i krótko wymieszaj je w inkubatorze z wytrząsaniem offline z prędkością 800 obrotów na minutę przez pięć minut. Oznacz tabliczki kodami kreskowymi i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne.

Obliczyć wymaganą objętość pożywki uzupełnionej antybiotykiem dla bloków głębinowych. Kliknij przycisk Uruchom obok programu do przesyłania cieczy DWB. Upewnij się, że nośnik został dodany do właściwego zbiornika.

Puste bloki studni głębinowej znajdują się w prawidłowych pozycjach układu i czy dostępny jest odpowiedni zapas końcówek. Ustaw program tak, aby dozował 495 mikrolitrów pożywki. Gdy wszystko będzie gotowe, sekwencyjnie kliknij OK, aby uruchomić program.

Teraz uszczelnij wypełnione bloki studni głębinowej oddychającą membraną i przenieś do tymczasowego przechowywania w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie kliknij przycisk uruchom obok inokulatu z rozmrożonego programu MTP. Upewnij się, że zapasy kriogeniczne MTP i bloki głębokich studni są przenoszone na platformę zgodnie z układem i że załadowano wystarczającą ilość końcówek.

Sekwencyjnie kliknij OK, aby zainicjować. Po zakończeniu programu zamknij zaszczepione przez noc bloki studni głębinowej oddychającą membraną. Przenieś je do inkubatora z wytrząsarką płytkową offline na 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, 800 obrotach na minutę i wilgotności 75%.

Ponownie zamknij, wymieszaj i włóż płytki do mikromiareczkowania Cryostock do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza. Teraz oblicz wymaganą objętość pożywki uzupełnionej różnymi stężeniami efektorów i antybiotyków dla nocnych bloków studni głębinowych, które mają być przesiewane. Kliknij przycisk Uruchom obok programu do przesyłania cieczy DWB.

Następnie upewnij się, że zbiorniki na media uzupełnione efektorem są prawidłowo umieszczone. Dodaj puste bloki studni głębinowej do platformy obsługi cieczy. Gdy dostępna jest wystarczająca liczba końcówek, kliknij kolejno przycisk OK, aby uruchomić protokół generowania bloków głębokich odwiertów.

Po napełnieniu uszczelnij bloki studni testowej oddychającą membraną. Napełnij pojemnik na płyny pustymi talerzami. Powtarzaj inokulację, aż wszystkie bloki testowe zostaną wypełnione.

Następnie kliknij przycisk uruchom obok programu transfer to assay DWB. Po rozszczelnieniu testu bloki studni głębinowej z pożywką uzupełnioną efektorem są prawidłowo umieszczone, przenieść i rozpieczętować przez noc bloki studni głębinowej zawierające wyhodowany P. putida na układ. Sekwencyjnie kliknij OK, aby uruchomić protokół.

Po zakończeniu programu uszczelnij płytki testowe do inkubatora offline. Po zaszczepieniu wyrzuć bloki studni głębinowej na noc. Następnie przenieś bloki studni głębinowej do wirówki.

Granulki o masie 4 000 G w wirniku sterowanym lodem w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po wyrzuceniu supernatantu umieścić bloki wirówki na platformie urządzenia do obsługi cieczy. Oblicz objętość jednorazowego wymaganego PBS na podstawie liczby bloków studni głębinowych, które mają zostać przebadane.

Kliknij uruchom obok testu, ustaw program DWB do ponownego zawieszania PBS i ustaw objętość dozowania na 500 mikrolitrów. Następnie upewnij się, że PBS został dodany do odpowiedniego zbiornika i ułóż odwirowane płytki zgodnie z układem. Kliknij OK, aby uruchomić program po potwierdzeniu dostępności napiwku.

Ponownie uszczelnić i usunąć ponownie zawieszone bloki studni głębinowej z urządzenia do obsługi cieczy. Sprawdź spód płytki, aby upewnić się, że granulki są całkowicie zawieszone. Kliknij przycisk Uruchom obok komórek ustawień testu i programu MTP w edycji PBS.

Następnie przenieś zawieszone bloki studni głębinowej do urządzenia do obsługi cieczy zgodnie z układem. Załaduj puste płytki do mikromiareczkowania zgodnie z układem i ustaw objętość dozowania na 200 mikrolitrów przed kliknięciem OK. Przenieś napełnione płytki do mikromiareczkowania do wielotrybowego czytnika płytek offline i zmierz względną fluorescencję i OD600.

Zautomatyzowane badania przesiewowe 5 000 wariantów promotora zidentyfikowały najlepszych kandydatów wykazujących ponad 3,6-krotną aktywację. Wartości EC 50 dla 100 unikalnych wariantów zostały wykreślone w celu wizualizacji rozkładu czułości i zidentyfikowania solidnych kandydatów. Wartości EC 50 obliczono dla 226 wzbogaconych wariantów i uszeregowano za pomocą transformacji Lin-log w celu utworzenia biblioteki skalowanej czułości.

Ostateczny projekt przesiewania został skonstruowany przy użyciu wariancji 1, 0 i 1 poziomu z czterech modułów. Profile modelu miejsca wiązania rybosomów w transporcie, regulatorze, wyjściu i rybosomów ujawniły, w jaki sposób zmiany poziomów ekspresji czterech modułów nieliniowo wpłynęły na EC 50 i współczynnik Hilla. Identyfikacja optymalnych kombinacji ekspresji za pomocą RBS-Out, wykazująca silny pozytywny wpływ zarówno na czułość, jak i nachylenie.

Globalnie zoptymalizowany wariant biosensora, wykorzystujący moduły o idealnej wytrzymałości, wykazał zwiększoną czułość i współczynnik Hilla w porównaniu zarówno z wersją nadrzędną, jak i zoptymalizowaną pod kątem DSD.