Name: Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę automatycznej optymalizacji genetycznie zakodowanych biosensorów z wykorzystaniem projektowania eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy. Protokół umożliwia efektywne pobieranie próbek z przestrzeni projektowej bibliotek genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GAG i PLR otrzymały wsparcie w ramach grantu BBSRC DTP (BB/M011208/1). MC był wspierany przez grant BBSRC Responsive mode (BB/P01738X/1). Chcielibyśmy również podziękować The Henry Royce Institute for Advanced Materials (finansowany z grantów EPSRC nr 1). EP/R00661X/1, EP/S019367/1, EP/P025021/1 i EP/P025498/1) za dostęp do swoich obiektów oraz nagrodę MBEC UKRI Engineering Biology Mission (BB/Y00812X/1) za wsparcie techniczne i szkolenia.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Biblioteki elementów genetycznych obejmujące szeroką zmienność genetyczną mają kluczowe znaczenie dla powodzenia metodologii opartej na DoE. Jak pokazano na rysunku 2A, liczba wariantów teoretycznych wzrasta wraz z liczbą pozycji, które mają być celem mutagenezy, a także stopniem randomizacji, przy czym ten stale rosnący rozmiar biblioteki tworzy znaczące wąskie gardła w badaniach przesiewowych. Zmniejszenie liczby docelowych pozycji lub stopnia randomizacji może zmniejszyć liczbę wariantów, które muszą zostać przebadane i jest atrakcyjnym podejściem, jeśli wymagane jest bardziej ukierunkowane podejście do dostrajania lub jeśli jako przewodnik istnieje znacząca wiedza a priori na temat systemu. Jednak w przypadku systemów takich jak biosensory, które mają wiele nakładających się na siebie cech lub mogą nie mieć dobrze scharakteryzowanych elementów genetycznych, trudno jest obejść wymóg rozmiaru biblioteki. Wykorzystanie zautomatyzowanych urządzeń do obsługi cieczy może trywializować pracę związaną z zbieraniem kolonii i wariantami hodowli, szczególnie gdy wymagane jest zwiększone gromadzenie punktów danych do wykreślania bardziej zaawansowanych funkcji, takich jak krzywe dawka-odpowiedź w porównaniu z dwoma komparatorami punktów danych, takimi jak ON/OFF. Chociaż trudno jest dokładnie określić ilościowo czas zaoszczędzony dzięki włączeniu zautomatyzowanych przepływów pracy, Główną korzyścią z jego wdrożenia jest czas, który można poświęcić na inne równoległe eksperymenty38.
Mimo to, w wielu przypadkach, gdy rozmiary bibliotek przekraczają 104, nawet metodologie wspomagane płynami stają się niepraktyczne39. W takich przypadkach wstępne badanie przesiewowe wariantów za pomocą cytometrów przepływowych jest bardzo atrakcyjnym podejściem, ze znacznie większą zdolnością sortowania do 107 komórek na godzinę40. Stosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) z dwiema rundami selekcji pozytywnej i co najmniej jedną rundą selekcji negatywnej było rutynowo stosowane w klasyfikacji najbardziej wydajnych wariantów bioczujników przed bardziej obszerną charakterystyką 16,26,42. Opracowywanie i wykonywanie takich protokołów wykorzystujących FACS zostało szczegółowo omówione w innym miejscu31. Wstępne badania przesiewowe są możliwe przy użyciu testów z użyciem płytek do obsługi cieczy, jak opisano w powyższym protokole; porównując dane ON/OFF przy użyciu stężenia pojedynczego efektora, jak pokazano na rysunku 3D, do dalszej szczegółowej charakterystyki można wybrać tylko wariantowe bioczujniki o znaczącym wzmocnieniu funkcji (3,6-krotnym, jak podano w metodach), usprawniając rozwój biblioteki i czas trwania eksperymentów. Zarówno platformy FACS, jak i do obsługi cieczy wiążą się jednak ze znacznymi inwestycjami kapitałowymi dla laboratorium i często wymagają pewnego poziomu wiedzy technicznej do obsługi i konserwacji. Sita na płytkach agarowych zapewniają niższą techniczną i finansową barierę wejścia i były stosowane w połączeniu z gfp lub niebiesko-białymi badaniami przesiewowymi kolonii w celu selekcji wariantów biblioteki RBS, a także mutantów enzymatycznych na podstawie intensywności fluorescencji43,44. Również one są jednak ograniczone pod względem liczby wariantów, które można skutecznie badać przesiewowo, ale wymagają również znacznej różnicy we fluorescencji, aby były wykrywalne44. Jako kompromis między w pełni kombinatoryczną jednoczesną mutacją wielu elementów jednocześnie, metodologia "dziel i rządź" ma na celu podzielenie dużych bibliotek wariantów na łatwiejsze do opanowania bloki przesiewowe41. Chociaż podejście modularne może być pragmatyczne, nie bada skutecznie przestrzeni projektowania kombinatorycznego, ponieważ wiadomo, że wydajność komponentów biologicznych jest wysoce zależna od kontekstu, zwłaszcza u bakterii, gdzie dominuje sprzężenie transkrypcyjne i translacyjne. Ma to potencjał, aby doprowadzić do wyborów projektowych, które są ukierunkowane na lokalne maksima, a nie globalne optima.
Transport i rozpoznawanie specyficznych induktorów to kolejna ważna cecha rozwoju biosensorów, która zasługuje na wzmiankę, mimo że nie jest głównym celem przedstawionego protokołu. Brak odpowiedniego aTF dla cząsteczki docelowej stanowi poważne wyzwanie dla badaczy. Racjonalna selekcja istniejącego aTF, który wiąże strukturalny analog efektora docelowego, może zapewnić idealną matrycę, na której można zastosować randomizację kodonów w celu dostrojenia specyficzności aTF do pożądanego efektora17. Dostosowanie sekwencji docelowej do rozwiązanych struktur lub przewidywań Alphafold może umożliwić identyfikację miejsc wiązania efektora z podejrzanymi resztami aminokwasowymi poddanymi półracjonalnej randomizacji i rankingowi, dostosowanemu do protokołu17. Podobnie, wybór i modulacja transporterów odpowiedzialnych za import/eksport efektorów może znacząco zmienić charakterystykę dawka-odpowiedź biosensora. Stwierdzono, że ekspresja genu transportera jest znaczącym graczem w odpowiedzi biosensora, ze zróżnicowaną biblioteką promotorów Ptac i RBS kontrolujących ekspresję transportera MucK używanego do stabilizacji jego ekspresji w wielu rundach FACS, zwiększając odporność odpowiedzi biosensora17. Podobnie, badania przesiewowe różnych białek transportowych same w sobie mogą modulować specyficzność bioczujników, przy czym badanie przesiewowe przypuszczalnego zestawu transporterów PcaK przy użyciu bioczujnika reagującego na PCA prowadzi do identyfikacji dwóch transporterów wyjątkowo zdolnych do wychwytywania substratów 3,5-hydroksylowanych, rozszerzając zestaw związków wykrywalnych przez ten system24.
Zautomatyzowane platformy mogą stać się jeszcze potężniejszymi narzędziami do charakteryzacji i eksploracji, gdy połączą zasady DoE z modelami głębokiego uczenia46,47. Po wstępnym zbadaniu przestrzeni projektowej biosensora z platformą o wysokiej przepustowości, algorytmy uczenia maszynowego zostały wykorzystane do przewidywania funkcji niescharakteryzowanych sekwencji z dobrą dokładnością 47. Metody przedstawione w tym protokole mogą być z łatwością zastosowane w testowaniu nowych modeli uczenia się języków do projektowania promotorów, podobnych do modeli, które zostały opracowane w oparciu o przewidywanie sekwencji między RBS48. Co więcej, integracja takich modeli może wykorzystać dane dotyczące funkcji sekwencyjnych zawarte w projektach niefunkcjonalnych promotorów i zapewnić krytyczny wgląd w szerszą funkcjonalność bioczujnika jako całości. Mianowicie, miałoby to potencjał, aby rozwiązać kluczowe ograniczenie przepływu pracy DoE, polegające na tym, że wyniki fałszywie dodatnie, np. niefunkcjonalny promotor, niekoniecznie są równoznaczne z zmierzonym wynikiem zerowym, ze zjawiskami takimi jak fałszywa transkrypcja lub wprowadzenie elementu szumu do danych DoE, który jest trudny do zidentyfikowania i kontrolowania. Co istotne, aby objąć całą eksperymentalną przestrzeń projektową, wszelkie wygenerowane biblioteki muszą wykazywać szeroki zakres działań, ponieważ niewystarczający zakres działań spowoduje wypaczenie wyników projektu i stworzy niewiarygodność wszelkich modeli statystycznych wygenerowanych na podstawie zestawu danych30. Jeśli problemem staje się niska zmienność biblioteki, można zaimplementować badanie innych elementów sekwencji lub zwiększyć stopień randomizacji, a różnice między bibliotekami można porównywać, aż do uzyskania odpowiedniej puli wariantów.
Kluczowym aspektem procesu DoE jest prawidłowe oszacowanie i wybór pierwotnych i wtórnych efektów uzyskanych z DSD, które następnie zostaną włączone do analizy statystycznej. DoE, jako podejście oparte na modelowaniu, jest bardzo podatne na nadmierne dopasowanie i stronniczość, co może szybko skomplikować proces optymalizacji poprzez kierowanie iteracyjnych wysiłków inżynieryjnych do nieoptymalnych sekcji przestrzeni projektowej49. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby zapewnić, że wszelkie projekty są solidnie odizolowane od takich efektów, zarówno na etapie koncepcji, jak i analizy danych. W początkowej fazie projektowania badań przesiewowych, wyśrodkowane przebiegi, w których wszystkie czynniki są ustawione na średnią geometryczną (tj. 0,0,0,0), mogą pomóc w zmniejszeniu błędu systematycznego modelu poprzez lepsze uwzględnienie interakcji nieliniowych, nie zwiększając jednocześnie znacznego obciążenia eksperymentalnego (1-3 dodatkowe serie)49. Ponadto włączenie projektów randomizowanych może pomóc w uwzględnieniu zmiennych zewnętrznych, które nie są uwzględnione w projekcie eksperymentalnym, ale nadal mogą wpływać na mierzone zmienne odpowiedzi. W kontekście biologicznym randomizacja rozwiązuje takie kwestie, jak efekty czasoprzestrzenne, takie jak położenie płytki lub zmienność między partiami, zapobiegając znaczącemu wpływowi takich efektów na interpretację danych. Dbałość o takie szczegóły na tym wczesnym etapie może poprawić niezawodność modeli i prowadzić do bardziej wiarygodnych wniosków. Po przeprowadzeniu eksperymentów sugerowanych przez DSD wymagana jest analiza statystyczna danych w celu wyjaśnienia tych czynników, które miały istotny wpływ na parametry wyjściowe. Wykresy półnormalne oferują intuicyjną wizualną reprezentację wielkości efektów, przy czym efekty bez znaczenia zwykle spadają wzdłuż linii prostej, podczas gdy efekty o znaczącym wpływie będą odbiegać od tej linii, umożliwiając prosty wybór najważniejszych czynników w optymalizacji biosensorów. Mając to na uwadze, należy przyjąć konserwatywne podejście do selekcji efektów, tak jak w przypadku każdego modelowania, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernego dopasowania modelu.
Możliwość szybkiego projektowania i optymalizacji biosensorów i innych obwodów genetycznych znacznie przyspieszy tempo badań w dziedzinie biotechnologii, np. w zakresie rozwoju szczepów i enzymów, ale także w diagnostyce w czasie rzeczywistym. Pojawienie się metodologii badań przesiewowych opartych na DoE w tej dziedzinie jest szczególnie obiecujące, ułatwiając efektywne wykorzystanie czasu i zasobów przy jednoczesnym badaniu maksymalnej możliwej przestrzeni projektowej, a także zostało już wykorzystane z dużym skutkiem w optymalizacji obwodów genetycznych dla szlaków metabolicznych i biosensorów 31,33,34,51. DoE szczególnie dobrze nadaje się do wieloczynnikowych problemów optymalizacyjnych, w których działa wiele interakcji pierwszego, drugiego, a nawet trzeciego rzędu, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zbadania przy użyciu typowego eksperymentalnego podejścia do projektowania oparty na jednym czynniku na raz. Co więcej, wysiłki zmierzające do zaprojektowania jednego aspektu biosensora często nieumyślnie skutkują poświęceniem innego parametru, takiego jak poprawa czułości kosztem zakresu dynamiki51. Dzięki zdolności DoE do mapowania takich ukrytych interakcji, a także tworzenia modeli, które przewidują zachowanie bioczujników, cykl uczenia się testów kompilacji jest znacznie przyspieszony.

Zdolność do regulowania ekspresji genów jest podstawową funkcją we wszystkich formach życia, ułatwiającą dynamiczne reakcje w czasie rzeczywistym na wpływy zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne, od efektorów chemicznych po bodźce biofizyczne1. Niezliczona liczba transkrypcyjnych systemów regulacyjnych występujących w całej przyrodzie ma ogromny potencjał w zakresie rozszerzania i przyspieszania inżynierii metabolicznej i badań biotechnologicznych, które są możliwe dzięki biologii syntetycznej. U prokariontów znaczna część regulacji zachodzącej w komórce jest kontrolowana przez jednoskładnikowe mechanizmy regulacyjne napędzane interakcjami allosterycznych czynników transkrypcyjnych (aTF) z wieloma efektorami małocząsteczkowymi2. Zazwyczaj składające się z domeny wiążącej efektor (EBD) i domeny wiążącej DNA (DBD), aTF działają jak przełączniki molekularne po związaniu się z określonymi efektorami małych cząsteczek, modulując powinowactwo ich DBD do określonych sekwencji operatora DNA zlokalizowanych w regionach promotorowych genomu, co powoduje aktywację lub represję transkrypcji3. Ten zwodniczo prosty mechanizm doprowadził do powstania wielu różnorodnych strategii regulacyjnych, począwszy od systemów represji/derepresji, a skończywszy na aktywatorach zdolnych do wykrywania i reagowania na oszałamiającą liczbę małocząsteczkowych efektorów lub bodźcówśrodowiskowych4. W związku z tym biologia syntetyczna wykorzystała tę różnorodność do skonstruowania genetycznie kodowanych bioczujników zdolnych do łączenia mnóstwa sygnałów wejściowych w niestandardowe wyjścia, tj. produkcję fluorescencyjnych białek reporterowych i regulację szlaków syntezy. Stosowane w biotechnologicznych przepływach pracy, takie systemy umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów, dynamiczną regulację szlaków i łatwe odczyty, pomagając w rozwoju bardziej wydajnych szlaków, szczepów i procesów biologicznych 5,6,7,8.
Zasadniczo bioczujniki są charakteryzowane według szeregu parametrów, w tym specyficzności, zakresu operacyjnego, zakresu dynamicznego, czułości i nachylenia, przy czym krzywa odpowiedzi na dawkę bioczujnika opisuje te parametry za pomocą sygnału wyjściowego w funkcji stężenia liganda (rysunek 1)9,10,11,12 . Równanie Hilla można wykorzystać do dopasowania charakterystyki wydajności bioczujnika, dostarczając półempirycznych dowodów dla każdego z opisanych powyżej parametrów, zapewniając w ten sposób sposób sposób charakterystykę systemu bioczujników, umożliwiając jednocześnie ocenę wysiłków wymaganych do dostrojenia systemu do wyników sterowanych aplikacją. Swoistość można zdefiniować jako względne różnice w wyjściowym sygnale indukowanym przez jeden efektor w porównaniu z szeregiem innych potencjalnych cząsteczek efektorowych i jest zwykle modulowana na poziomie EBD aTF. Zakres operacyjny definiuje się jako zakres stężeń ligandów, które bioczujnik jest w stanie wykryć, dyktując zakres stężeń, na które bioczujnik będzie w stanie zareagować. Z kolei zakres dynamiki opisuje stosunek najwyższego mierzalnego stanu aktywacji (ON) do stanu nieaktywnego (OFF) i jest ważnym parametrem zapewniającym, że bioczujnik niezawodnie zgłasza stężenia efektorowe powyżej autofluorescencji tła10. Czułość cząsteczki efektora jest opisana jako stężenie wymagane do wywołania określonego sygnału wyjściowego, mierzone przez połowę maksymalnego stężenia (EC50) efektora13. Wreszcie, nachylenie krzywej jest oznaczone przez kooperatywność (nH) aTF dla jego miejsca operatora w promotorze i skutkuje bardziej cyfrowym lub analogowym profilem wyjściowym odpowiedzi. Kooperatywność wynika z interakcji białko-białko między aTF związanymi z ligandami, tworząc kompleksy multimeryczne, które wzmacniają powinowactwo do miejsca operatora, co skutkuje gwałtownym wzrostem responsywności obwodu przy nasycających stężeniach ligandów i bardziej cyfrowym profilu odpowiedzi14.
Charakterystyka reakcji bioczujnika na dawkę może znacząco wpłynąć na przydatność jego zastosowań i często stanowi decydujący punkt dla każdego zastosowania koncepcyjnego. Wydajność biosensora może się znacznie różnić w zależności od systemu, przy czym zakres operacyjny zwykle waha się od 0,1 nM-10 mM13, podczas gdy zakresy dynamiczne mogą wynosić od 1,4 do 2000 razy15. Ponadto, chociaż liczba związków efektorowych zgłoszonych w odniesieniu do aTF jest szeroka (produkty przemiany materii, aminokwasy, metale, antybiotyki, quorum sensing itp.),11, nie jest ona wyczerpująca, co stanowi wyzwanie dla badaczy, gdy odpowiedni bioczujnik dla ich efektora nie istnieje jeszcze w literaturze. Biologia syntetyczna umożliwiła inżynierię bioczujników, które odpowiadają na takie wyzwania, umożliwiając dostrojenie zakresu efektora i charakterystyki dawka-odpowiedź w celu ściślejszego dopasowania do wyników badań aplikacji, i została wykorzystana do rozwiązania obu wyżej wymienionych problemów, odpowiednio16,17. Dwa kluczowe obszary inżynierii są ukierunkowane za pomocą biologii syntetycznej, regionu promotorowego bioczujnika i samego aTF, pośrednicząc w ich działaniu na poziomie transkrypcji i białka. Podejścia, które koncentrują się na elementach genetycznych biosensora w celu modulowania wydajności na poziomie promotora, obejmują inżynierię RBS, lokalizacji operatorskich oraz -35, -10 (sześciokąty) w celu dostrojenia czułości, zakresów operacyjnych i dynamicznych, i są przedmiotem metodologii opisanej w tym manuskrypcie (rysunek 1). Alternatywnie, modyfikacja selektywności i czułości biosensora poprzez analizę jego domeny wiązania efektora i mutacji reszt zaangażowanych w koordynację efektora (przy użyciu homologii sekwencji i / lub biologii strukturalnej) może modulować jego odpowiedź na pokrewny efektor 18,19,20 lub całkowicie zmienić go w kierunku niepokrewnego efektora będącego przedmiotem zainteresowania 16,17,21. Takie wysiłki związane z dostrojeniem mogą następnie skierować bioczujniki do określonych zastosowań, przy czym zwykle są to kontrolery metaboliczne (pętle sprzężenia zwrotnego, obwody sterujące), podstawowe narzędzia przesiewowe (odkrywanie enzymów lub szczepów), wtórne narzędzia przesiewowe (badania przesiewowe wariantów enzymów, inżynieria metaboliczna) oraz bioprospekcja transporterów 22,23,24 . Jednym z takich przykładów jest zastosowanie reagującego na kwas mukonowy aTF, CatM, w połączeniu z zaprojektowaną sekwencją promotora w celu poprawy zakresu dynamicznego i operacyjnego. System ten został zintegrowany z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją w celu wyizolowania najskuteczniejszych szczepów wytwarzających kwas mukoniczny w oparciu o fluorescencję GFP po adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej25.
Podczas gdy sukces opisanych powyżej strategii inżynieryjnych jest oczywisty, współzależności dźwigni dostępnych dla biologów syntetycznych do dostrajania bioczujników mogą skomplikować proces projektowania i wydłużyć okres poświęcony na rozwój bioczujników, co może zniechęcić niektórych badaczy do wdrażania bioczujników do własnych przepływów pracy. Jak pokazano na rysunku 1, próby dostrojenia bioczujnika do określonego wyniku poprzez modyfikację sześciokątów mogą nieumyślnie tłumić inne parametry, przy czym ta współzależność jest uznanym wyzwaniem w inżynierii biosensorów12. Powszechne podejścia do dostrajania biosensorów polegają na racjonalnym projektowaniu i inżynierii ukierunkowanej ewolucji, przy czym te pierwsze opierają się na zrozumieniu a priori strukturalnych i mechanistycznych cech systemu, aby skoncentrować eksperymenty na komponentach o wysokim prawdopodobieństwie sukcesu; podczas gdy ta ostatnia opiera się na randomizowanej mutagenezie i naturalnej ewolucji w połączeniu z wysokoprzepustowym badaniem przesiewowym w celu wybrania wariantów wykazujących zoptymalizowane cechy 26,27,28,29,30. Obie techniki, choć skuteczne, mają również pewne wady: inżynieria ukierunkowana, na przykład poprzez skupienie się na określonych elementach strukturalnych lub funkcjonalnych, jest podatna na ograniczoną eksplorację pełnej przestrzeni eksperymentalnej i może ignorować efekty allosteryczne lub wtórne30. Nieukierunkowane generowanie i selekcja bibliotek, choć idealne do optymalizacji projektów w sposób niekierowany, wymagające niewielkiej ilości wstępnych prac projektowych (tj. projektowania i generowania bibliotek), wymagają skłonności do użytecznych mutacji. Bez takiego odchylenia oczekuje się, że znacznie większy odsetek mutacji może być szkodliwy, wymagający większej liczby badań przesiewowych31. W związku z tym bardzo atrakcyjne są podejścia holistyczne, które uwzględniają nie tylko pierwotny wpływ części składowych biosensora (aTF, RBS, miejsca operatorskie i sześciokąty), ale także sposób, w jaki te elementy oddziałują ze sobą w celu wpływania na parametry bioczujnika.
Ustrukturyzowane metodologie wielowymiarowego eksperymentowania i modelowania statystycznego zostały szeroko przyjęte w procesach inżynierii procesowej w celu zbadania wielowymiarowej przestrzeni eksperymentalnej przy użyciu minimalnej możliwej liczby eksperymentów. To podejście, które łączy eksperymentowanie i modelowanie, zwane projektowaniem eksperymentów (DoE), co najważniejsze, pozwala badaczom optymalizować złożone procesy wielowymiarowe w kierunku określonych wyników, nie wymagając przy tym rozległej wiedzy a priori 23,30. Chociaż zwykle stosuje się go do optymalizacji zmiennych ciągłych, dla których ustrukturyzowana eksploracja eksperymentalna jest łatwiejsza, DoE jest również stosowany w optymalizacji szlaków metabolicznych na poziomie genetycznym 31,32,33. Obejmuje to wstępny etap badania, w którym wybierane są czynniki uważane za najważniejsze dla pożądanego wyniku, a następnie etap optymalizacji, w którym wybrane czynniki są dostosowywane w celu uzyskania pożądanej wydajności, w tym przypadku w celu optymalizacji określonych parametrów biosensorów w celu zwiększenia ich zakresu zastosowania. Co najważniejsze, technikę tę można połączyć ze zautomatyzowanymi platformami do obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości badań przesiewowych do średniej wielkości bibliotek 103 - 104 w celu globalnej optymalizacji wydajności bioczujników w oparciu o dane23. Poniżej opisano protokół wdrożenia podejścia opartego na DoE do optymalizacji bioczujników, wspomaganego robotyką do obsługi cieczy w celu usprawnienia generowania bibliotek, badań przesiewowych i gromadzenia danych w celu globalnej optymalizacji czułości bioczujników.

<table><tbody><tr><td>1000 &mikro; L CO-RE Końcówki, sterylne bez filtra</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>2,2 ml 96 Płytka głębinowa, kwadratowe studzienki z dnem w kształcie litery V</td><td>Thermo</td><td>11594754</td><td></td></tr><tr><td>300 i mikro; Końcówki L CO-RE, ułożone w stos NTR, sterylne</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>235985</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste dno, czarne płytki do mikromiareczkowania</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655097</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Złożone plazmidowe DNA</td><td>Dostarczony użytkownik&nbsp;</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek ClarioStar Plus&nbsp;</td><td>BMG</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deksynukloetydu (dNTP)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher BioReaggents&nbsp;</td><td>Zobacz materiał BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Drabina DNA 100pz</td><td>NEB</td><td>N3231L</td><td></td></tr><tr><td>Drabina DNA 1KB</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie DNA&nbsp;</td><td>Źródło: Bioscience</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Synteza DNA&nbsp;</td><td>Identyfikator IDT</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha; Komórki kompotentne</td><td>NEB</td><td>Zobacz materiał C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik w żelu, fioletowy X6 bez SDS</td><td>NEB</td><td>Zobacz materiał B7025S</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji z pulserem genowym/mikropulserem, odstęp 0,2 cm</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Graficzny pad Pryzmat 10&nbsp;</td><td>Podkładka graficzna</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Płyn Hamilton Star&nbsp;</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką płytkową HT multitron&nbsp;</td><td>Infors HT</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet analiz statystycznych JMP&nbsp;</td><td>JMP</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB (młynarz)</td><td>Młynarz&nbsp;</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół (Miller) z agarem&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator MicroPulser&nbsp;</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>Zobacz materiał M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Midiprep</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>&nbsp; 12143</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Miniprep</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick&nbsp;</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>Zobacz materiał 28706X4 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>QIAGEN powiedział:</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zbieracz kolonii Qpix 420</td><td>Urządzenia molekularne w Wielkiej Brytanii</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>SOC Outgrowth Medium&nbsp;</td><td>NEB</td><td>Zobacz materiał B9020S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczna barwnik żelowa DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE (tris-acetat-EDTA, 50X)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Zobacz materiał B49</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM Woda destylowana bez dnazy/rnazy&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Efficient Sampling of Genetically Encoded Biosensor Design Space Enabled with a Design of Experiments and Automation Workflow

Genetycznie kodowane bioczujniki są potężnymi narzędziami do wysokowydajnego przetwarzania informacji, umożliwiającymi transdukcję środowiskowych lub chemicznych sygnałów wejściowych na różne wyjścia. Umożliwia to dynamiczne wykrywanie, bezpośrednią kontrolę i precyzyjną regulację ekspresji genów w szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych, w tym optymalizacji enzymów, rozwoju szczepów i kontroli procesów mikrobiologicznych. Aby dostosować je do tego celu, wydajność bioczujników można udoskonalić, modyfikując stechiometrię elementów obwodu biosensora (np. transporterów, modułów wejściowych i wyjściowych) i/lub dostrajając powiązane interakcje międzycząsteczkowe gospodarz-biosensor (np. DNA-białko, białko-białko). Jednak w tym przypadku ogromna liczba możliwych permutacji biosensorów tworzy złożoną kombinatoryczną przestrzeń projektową, wymagającą starannej optymalizacji strategii badań przesiewowych w celu zidentyfikowania konfiguracji, które zapewniają pożądaną wydajność fenotypową. Złożoność tę dodatkowo potęgują cechy działania bioczujników, takie jak możliwość przestrajania, które wymagają analizy miareczkowania efektorowego w warunkach badań przesiewowych monoklonalnych. W związku z tym potrzeba eksploracji różnorodnych sekwencji i przestrzeni eksperymentalnej sprawia, że metody próbkowania frakcyjnego szczególnie dobrze nadają się do tego celu. Podstawą tego przepływu pracy są algorytmy projektowania eksperymentów (DoE), które są dobrze umiejscowione, aby umożliwić wydajne, oparte na statystyce mapowanie strukturalne i ułamkowe próbkowanie tej kombinatorycznej eksperymentalnej przestrzeni projektowej. 
Opisano w nim połączenie wysokowydajnej automatyzacji i podejścia obliczeniowego w celu efektywnego próbkowania przestrzeni projektowej bioczujników opartych na allosterycznych czynnikach transkrypcyjnych w celu uzyskania odrębnych konfiguracji z cyfrowymi i analogowymi krzywymi dawka-odpowiedź. Protokół rozpoczyna się od stworzenia i zautomatyzowanego wyboru bibliotek promotorów i miejsc wiązania rybosomów. Biblioteki te i odpowiadające im dane wyrażeń są przekształcane w ustrukturyzowane, bezwymiarowe dane wejściowe, co umożliwia obliczeniowe mapowanie całej eksperymentalnej przestrzeni projektowej. Próbkowanie frakcyjne jest następnie wykonywane przy użyciu algorytmu DoE i sprzężone z analizą miareczkowania efektorowego przy użyciu wysokowydajnej platformy automatyzacji. Ten przepływ pracy zapewnia niezależne ramy dla rozwoju i optymalizacji przyszłych systemów biosensorów i obwodów genetycznych, zapewniając zestaw narzędzi regulacyjnych dla społeczności biologii syntetycznej.

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Genetically encoded biosensors are powerful tools for high-throughput information processing, enabling the transduction of environmental or chemical input ...

Rozwój i optymalizacja biosensorów pod kątem zastosowań biotechnologicznych to zakres naszych badań. W szczególności naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób zoptymalizować i zaprojektować biosensory poprzez modulację ich elementów genetycznych. Wybory projektowe oparte na intuicji, takie jak klasyczna inżynieria promotorów i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, są technikami rutynowo stosowanymi w charakterystyce i projektowaniu bioczujników.Projektowanie metodologii eksperymentów nie zostało jeszcze powszechnie przyjęte w projektowaniu obwodów genetycznych. Dzięki temu protokołowi staramy się zwiększyć wykorzystanie tego typu technik w projektowaniu obwodów genetycznych i bioczujników. Na początek określ teoretyczną wielkość biblioteki i oblicz liczbę indywidualnych wariantów potrzebnych do zapewnienia więcej niż 95% pokrycia biblioteki.Obliczyć wymaganą objętość pożywki bulionowej z lizogenii uzupełnionej antybiotykiem w zależności od liczby kolonii, które mają być badane przesiewowo. Otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy i kliknij uruchom obok programu do przesyłania cieczy MTP. Umieść przygotowane podłoże w odpowiedniej pozycji zbiornika.Następnie wypełnij pokład pustymi płytkami do mikromiareczkowania zgodnie z układem. Ustaw program tak, aby dozował 200 mikrolitrów pożywki. Kliknij OK, aby potwierdzić start programu.Teraz przenieś wypełnione studzienki na płytkę mikromiareczkową na platformę zbieracza kolonii i rozszczelnij i przenieś kwadratowe płytki ślimakowe Pseudomonas putida przekształcone z DNA biblioteki wariantów plazmidowych na platformę zbieracza kolonii. Użyj selektora kolonii, aby zaszczepić każdą wstępnie napełnioną studzienkę pojedynczą kolonią z płytek transformujących. Ponownie zamknąć zaszczepione płytki i przenieść je do inkubatora z wytrząsaniem w trybie offline.Po inkubacji włóż wyhodowane płytki z powrotem na platformę do obsługi cieczy i rozszczelnić. Kliknij uruchom obok protokołu dodaj glicerol do MTP. Upewnij się, że układ płyt na ekranie jest zgodny z układem dokującym do obsługi cieczy.I sekwencyjnie kliknij OK, aby protokół został uruchomiony. Po zakończeniu uszczelnij płytki i krótko wymieszaj je w inkubatorze z wytrząsaniem offline z prędkością 800 obrotów na minutę przez pięć minut. Oznacz tabliczki kodami kreskowymi i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne.Obliczyć wymaganą objętość pożywki uzupełnionej antybiotykiem dla bloków głębinowych. Kliknij przycisk Uruchom obok programu do przesyłania cieczy DWB. Upewnij się, że nośnik został dodany do właściwego zbiornika.Puste bloki studni głębinowej znajdują się w prawidłowych pozycjach układu i czy dostępny jest odpowiedni zapas końcówek. Ustaw program tak, aby dozował 495 mikrolitrów pożywki. Gdy wszystko będzie gotowe, sekwencyjnie kliknij OK, aby uruchomić program.Teraz uszczelnij wypełnione bloki studni głębinowej oddychającą membraną i przenieś do tymczasowego przechowywania w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie kliknij przycisk uruchom obok inokulatu z rozmrożonego programu MTP. Upewnij się, że zapasy kriogeniczne MTP i bloki głębokich studni są przenoszone na platformę zgodnie z układem i że załadowano wystarczającą ilość końcówek.Sekwencyjnie kliknij OK, aby zainicjować. Po zakończeniu programu zamknij zaszczepione przez noc bloki studni głębinowej oddychającą membraną. Przenieś je do inkubatora z wytrząsarką płytkową offline na 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, 800 obrotach na minutę i wilgotności 75%.Ponownie zamknij, wymieszaj i włóż płytki do mikromiareczkowania Cryostock do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza. Teraz oblicz wymaganą objętość pożywki uzupełnionej różnymi stężeniami efektorów i antybiotyków dla nocnych bloków studni głębinowych, które mają być przesiewane. Kliknij przycisk Uruchom obok programu do przesyłania cieczy DWB.Następnie upewnij się, że zbiorniki na media uzupełnione efektorem są prawidłowo umieszczone. Dodaj puste bloki studni głębinowej do platformy obsługi cieczy. Gdy dostępna jest wystarczająca liczba końcówek, kliknij kolejno przycisk OK, aby uruchomić protokół generowania bloków głębokich odwiertów.Po napełnieniu uszczelnij bloki studni testowej oddychającą membraną. Napełnij pojemnik na płyny pustymi talerzami. Powtarzaj inokulację, aż wszystkie bloki testowe zostaną wypełnione.Następnie kliknij przycisk uruchom obok programu transfer to assay DWB. Po rozszczelnieniu testu bloki studni głębinowej z pożywką uzupełnioną efektorem są prawidłowo umieszczone, przenieść i rozpieczętować przez noc bloki studni głębinowej zawierające wyhodowany P. putida na układ. Sekwencyjnie kliknij OK, aby uruchomić protokół.Po zakończeniu programu uszczelnij płytki testowe do inkubatora offline. Po zaszczepieniu wyrzuć bloki studni głębinowej na noc. Następnie przenieś bloki studni głębinowej do wirówki.Granulki o masie 4 000 G w wirniku sterowanym lodem w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po wyrzuceniu supernatantu umieścić bloki wirówki na platformie urządzenia do obsługi cieczy. Oblicz objętość jednorazowego wymaganego PBS na podstawie liczby bloków studni głębinowych, które mają zostać przebadane.Kliknij uruchom obok testu, ustaw program DWB do ponownego zawieszania PBS i ustaw objętość dozowania na 500 mikrolitrów. Następnie upewnij się, że PBS został dodany do odpowiedniego zbiornika i ułóż odwirowane płytki zgodnie z układem. Kliknij OK, aby uruchomić program po potwierdzeniu dostępności napiwku.Ponownie uszczelnić i usunąć ponownie zawieszone bloki studni głębinowej z urządzenia do obsługi cieczy. Sprawdź spód płytki, aby upewnić się, że granulki są całkowicie zawieszone. Kliknij przycisk Uruchom obok komórek ustawień testu i programu MTP w edycji PBS.Następnie przenieś zawieszone bloki studni głębinowej do urządzenia do obsługi cieczy zgodnie z układem. Załaduj puste płytki do mikromiareczkowania zgodnie z układem i ustaw objętość dozowania na 200 mikrolitrów przed kliknięciem OK. Przenieś napełnione płytki do mikromiareczkowania do wielotrybowego czytnika płytek offline i zmierz względną fluorescencję i OD600.Zautomatyzowane badania przesiewowe 5 000 wariantów promotora zidentyfikowały najlepszych kandydatów wykazujących ponad 3,6-krotną aktywację. Wartości EC 50 dla 100 unikalnych wariantów zostały wykreślone w celu wizualizacji rozkładu czułości i zidentyfikowania solidnych kandydatów. Wartości EC 50 obliczono dla 226 wzbogaconych wariantów i uszeregowano za pomocą transformacji Lin-log w celu utworzenia biblioteki skalowanej czułości.Ostateczny projekt przesiewania został skonstruowany przy użyciu wariancji 1, 0 i 1 poziomu z czterech modułów. Profile modelu miejsca wiązania rybosomów w transporcie, regulatorze, wyjściu i rybosomów ujawniły, w jaki sposób zmiany poziomów ekspresji czterech modułów nieliniowo wpłynęły na EC 50 i współczynnik Hilla. Identyfikacja optymalnych kombinacji ekspresji za pomocą RBS-Out, wykazująca silny pozytywny wpływ zarówno na czułość, jak i nachylenie.Globalnie zoptymalizowany wariant biosensora, wykorzystujący moduły o idealnej wytrzymałości, wykazał zwiększoną czułość i współczynnik Hilla w porównaniu zarówno z wersją nadrzędną, jak i zoptymalizowaną pod kątem DSD.

efficient-sampling-genetically-encoded-biosensor-design-space-enabled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę automatycznej optymalizacji genetycznie zakodowanych biosensorów z wykorzystaniem projektowania eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy. Protokół umożliwia efektywne pobieranie próbek z przestrzeni projektowej bibliotek genetycznych.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy (Wideo) | JoVE Journal

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Przeglądaj więcej filmów