Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Badania wykazały, że BMSC pochodzące z kości czaszki twarzy wykazują większe możliwości niż te z kości osiowych i wyrostka robaczkowego. Dlatego BMSC żuchwy są uważane za preferowany zasób do opracowywania przyszłych terapii chorób twarzoczaszki. Protokół ten łączy w sobie zalety przylegania całego szpiku kostnego i sortowania komórek fluorescencyjnych w celu uzyskania znacznej liczby oczyszczonych BMSC żuchwy w krótkim czasie.

Jeśli próbujesz tego protokołu po raz pierwszy, myślę, że bardzo ważne jest, aby zrozumieć strukturę anatomiczną i funkcjonalny ruch żuchwy szczura, co można osiągnąć, oglądając ten film lub czytając powiązaną literaturę. Po uśpieniu szczura umieść go w czystym dygestorii w pozycji leżącej. Naciąć skórę i mięśnie buccinatora od obustronnego angulus oris do tylnej części żuchwy.

Otwórz pysk szczura, popychając siekacze szczęki i żuchwy w przeciwnym kierunku obydwoma kciukami, aby odsłonić zęby żuchwy, które są przymocowane do żuchwy. Całkowicie odłącz mięśnie policzkowe i ścięgna przyczepione do kruków i dolnej granicy żuchwy. Następnie dociśnij tylne zęby żuchwy i obracaj je do tyłu i w dół, aż kłykcie po obu stronach będą wyraźnie odsłonięte.

Oddziel trzon żuchwy od czaszki i oczyść przylegającą tkankę miękką do powierzchni kości za pomocą mokrej gazy. Umieść kość w 10-centymetrowym sterylnym szklanym naczyniu wypełnionym wstępnie schłodzonym minimalnym niezbędnym podłożem alfa lub PBS na lodzie, aby zachować żywotność. Odetnij kość przednią wzdłuż mezjalnej krawędzi pierwszego zęba trzonowego od trzonu żuchwy, a następnie usuń ramus żuchwy, w tym kruczek i kłykcie wzdłuż dystalnej krawędzi trzeciego zęba trzonowego, aby odsłonić jamę szpiku.

Napełnij 10-centymetrowe sterylne szklane naczynie 10 mililitrami alpha-MEM z 10% FBS. Odessać podłoże za pomocą 10-mililitrowej strzykawki, a następnie wprowadzić igłę do jamy szpiku kostnego i kilkakrotnie przepłukać szpik kostny do naczynia. Przepłucz jamę kostną co najmniej trzy razy odpowiednio z mezjalnej i dystalnej strony kości, aż kość stanie się biała.

Przenieś pożywkę zawierającą przepłukane komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją z prędkością 800 obr./min przez pięć minut. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki trzema mililitrami alfa-MEM z 10% FBS. Umieść komórki w nowym 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Odessać pożywkę hodowlaną i umyć naczynie PBS. Dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny z 0,02% EDTA do naczynia i traw komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj cztery mililitry alpha-MEM z 10% FBS, aby zatrzymać reakcję.

Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją z prędkością 800 obr./min przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w 120 mikrolitrach PBS z 10% FBS po odwirowaniu. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do nowej probówki do mikrowirówki.

Zablokuj zawiesiny komórek jednym mikrolitrem przeciwciała przeciwko CD16 do CD32 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut i wybarwić komórki przeciwciałem sprzężonym z PE przeciwko CD45, przeciwciałem sprzężonym FITC przeciwko CD90 i przeciwciałem APC przeciwko CD29, w czterech stopniach Celsjusza przez godzinę w ciemności. Użyj pozostałych 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej jako niebarwionej kontroli ujemnej. Wirować probówki z prędkością 800 obr./min przez pięć minut.

Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra PBS z 10% FBS. Dodaj 10 mikrolitrów po 0,01 miligrama na mililitr DAPI 10 minut przed analizą. Użyj 40-nanometrowych filtrów umieszczonych na probówkach wirówkowych, aby przefiltrować komórki, a następnie przeanalizuj komórki na sortowniku komórek aktywowanym fluorescencją.

Najpierw usuń martwe komórki z całkowitej liczby komórek poprzez bramkowanie komórek ujemnych DAPI, a następnie bramkę dla CD29 dodatnich, CD90 dodatnich, CD45 ujemnych, w wybranych komórkach jako docelowych mBMSC. Zbierz posortowane mBMSC do 15-mililitrowej probówki wirówkowej z pięcioma mililitrami alpha-MEM z 10% FBS. Odwirować probówki z prędkością 800 obr./min przez pięć minut i usunąć bufor zbiorczy.

Dodaj jeden mililitr świeżej pożywki, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie umieść je w sześciocentymetrowym naczyniu hodowlanym. Korzystając z tego protokołu, duża część komórek przylgnęła do płytki trzeciego dnia po początkowej hodowli. Po dodatkowych trzech do czterech dniach hodowli zbieg komórek osiągnął 70 do 80%Do oczyszczenia mBMSC zastosowano sortowanie komórek fluorescencyjnych, które stanowiły około 81,1% w komórkach P0.

Po hodowli P2 mBMSC na płytce sześciodołkowej przez tydzień zaobserwowano znaczną ilość jednostek tworzących kolonie. Aby ocenić zdolność mBMSC do różnicowania wieloliniowego, indukowano je do linii osteo-chondro i adipo. Zwiększona aktywność ALP, czerwonych guzków zwapniających pod wpływem barwienia czerwienią alizaryny i zwiększona ekspresja specyficznych dla kości genów Runx2, Alp, Bsp i Ocn wskazywały na indukcję osteogenną.

Barwienie olejowo-czerwone-O zastosowano do identyfikacji adipogenezy. Liczne wakuole bogate w lipidy były widoczne po dziewięciu dniach indukcji. Ponadto zwiększona była ekspresja specyficznych dla adipogenów Ppar-gamma-1 i Cebpa.

Próbki wykazały dodatnie barwienie na obecność błękitu alcyjskiego podczas mikroskopowej obserwacji różnicowania chondrogennego. Ponadto barwienie immunologiczne przeciwciałem kolagenowym anty-typu II wykazało zwiększoną akumulację macierzy chrząstki. Zapewnienie żywotności mBMSC jest bardzo ważne w tym protokole.

Cel ten można osiągnąć poprzez dobór odpowiedniego zwierzęcia doświadczalnego, operację na lodzie i skrócenie czasu doświadczenia. Wykorzystując ten model in vitro, można uzyskać dużą liczbę proliferacyjnych BMSC żuchwy, co może ułatwić badanie cech biologicznych, późniejszą reakcję na mikrośrodowisko i inne zastosowania BMSC żuchwy.