Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Ogólnym celem tej procedury jest ocena morfologii astrocytów poprzez analizę trójwymiarowych obrazów astrocytów, które zostały uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian morfologicznych, które mogą pojawić się w różnych typach komórek, zarówno w warunkach patologicznych, jak i jako efekt strategii interwencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele parametrów związanych z architekturą komórkową może być badanych jednocześnie.

Dr Mariam Bodel zademonstruje tę procedurę Po przygotowaniu szkiełek do immunohistochemicznego barwienia sekcji parize poprzez dwukrotne zanurzenie ich w ksylenie na 10 minut. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w każdym z 99,8%95% i 70% etanolu, aby nawodnić sekcje po umyciu. PBS inkubuje szkiełka w rozcieńczeniu od jednego do 1500 kwaśnego białka fibrylarnego gleju lub roztworu przeciwciała pierwszorzędowego GFAP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Po inkubacji przemyć skrawki w PB S3 razy przez pięć minut. Następnie inkubować szkiełka z roztworem przeciwciał drugorzędowych sprzężonym z fosfatazą alkaliczną od jednej do 100 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj sekcję w PB S3 razy przez pięć minut, mniej niż 30 minut przed użyciem.

Dodaj jedną kroplę czerwonego roztworu chromogenu do trzech mililitrów buforu substratu. Inkubować każde szkiełko w 100 mikrolitrach tego roztworu przez 15 do 20 minut w ciemności. Następnie umyj szkiełka w PB S3 razy przez pięć minut.

Na koniec wybarwić jądra DPI rozcieńczonym od jednego do 500 w PBS. Nałóż jedną lub dwie krople podłoża Antify na sekcję i natychmiast uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin przed mikroskopią, aby zapewnić uszczelnienie.

Aby rozpocząć mikroskopię konfokalną, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63x. Po otwarciu oprogramowania do akwizycji kliknij na inteligentną konfigurację w zakładce akwizycji i wybierz odpowiednie piętro czwórek. Tutaj używane są dappy i Alexa, piętro 5 55.

Następnie kliknij najlepszy sygnał, a następnie zastosuj. Następnie kliknij ustaw ekspozycję, aby umożliwić komputerowi określenie optymalnych parametrów ekspozycji Aby zoptymalizować obraz, otwórz okno kanałów i przełącz obraz na żywo. W razie potrzeby dostosuj ostrość.

Następnie kliknij jeden au, aby zoptymalizować otwór, dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność. Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między dwoma a trzema. Po tej optymalizacji zatrzymaj obraz na żywo i otwórz okno trybu akwizycji.

Dostosuj rozmiar ramki, klikając X by Y i wybierz 10 24 na 10 24. Wybierz także niską prędkość. Następnie otwórz kartę uśredniania i wybierz liczbę większą lub równą cztery.

Następnie kliknij przycisk przyciągania i zapisz przechwycony obraz 2D. Aby skonfigurować obrazowanie 3D, otwórz kartę inteligentnej konfiguracji i zaznacz element stosu ZS, co spowoduje otwarcie okna stosu Zs. Aby ustawić pierwszą i ostatnią pozycję dla Zacka, ponownie kliknij na żywo i dostosuj ostrość do najwyższej pozycji astrocytu.

Najpierw kliknij ustaw. Teraz ustaw ostrość na najniższą pozycję astrocytu i kliknij ustaw ostatnią, a następnie zatrzymaj podgląd na żywo. Następnie wybierz interwał, klikając optymalny.

Aby ustawić tutaj liczbę plasterków, interwał wynosi 1,01 mikrometra. Na koniec kliknij start, eksperymentuj i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Możesz także uzyskać obraz 2D za pomocą obiektywu 10 x lub 20 x.

W przypadku pomiarów intensywności fluorescencji wybierz narzędzie prostokąta lub okręgu w oknie obrazu i podświetl obszar do pomiaru, aby określić ilościowo objętość i powierzchnię jądra astrocytu, ciała i terytorium komórki somy. Przenieś obrazy 3D do odpowiedniego oprogramowania analitycznego, takiego jak Velocity 6.1 w oprogramowaniu do analizy. Utwórz nową bibliotekę i przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny.

Wybierz jeden obraz 3D i włącz jeden z pozyskanych kanałów zainteresowania, np. dapi. W przypadku pomiarów jądrowych ręcznie dostosuj jasność, aby zoptymalizować kontrast. Teraz wybierz menu narzędzi.

Wybierz opcję Utwórz objętość i utwórz pojedynczy obraz 3D z obrazów Zacka. Otwórz menu edycji i kliknij właściwości. Upewnij się, że są wyświetlane właściwości X, Y i Z.

Następnie wybierz odręczne narzędzie ROI z paska narzędzi. Za pomocą wybranego narzędzia narysuj linię wokół jądra oznaczonego DPI, aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytu. Ponownie, korzystając z odręcznego narzędzia ROI, zmierz objętość i powierzchnię całego astrocytu, rysując linię wokół somy podążającą za powierzchnią wszystkich gałęzi.

Kliknij menu pomiarów w górnej części okna obrazu, przeciągnij znajdź obiekty na górę okna i nadaj opisową nazwę populacji pierwszej, wybierz powiązany kolor i kliknij miarę, co otworzy nowe okno. W tym nowym oknie. Jako parametr wybierz objętość lub pole powierzchni i kliknij przycisk OK.

Aby zapisać dane, kliknij menu pomiaru i wybierz opcję Utwórz element pomiaru. Wybierz nowy element miary wywoływany z okna. Wprowadź nazwę pliku dla danych i kliknij przycisk OK.

Na koniec należy wyeksportować dane pomiarowe do odpowiedniego pakietu oprogramowania w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i wygenerowania wykresów danych. Naukowcy porównali astrocyty w utrwalonej tkance mózgowej szczurów leczonych amyloidem beta one 40 lub amyloidem beta one 40 i Ianem. Wstrzyknięcie białka amyloidowego spowodowało powstanie astrocytów o grubszych i dłuższych gałęziach.

Te astrocyty od zwierząt leczonych Ianem wykazywały gwiaździsty kształt z krótkimi i cienkimi gałęziami. Szczury leczone Ianem wykazały również zmniejszoną dodatnią fluorescencję astrocytów GFAP w wycinkach mózgu. Analiza morfometryczna określonych objętości astrocytów wykazała, że objętość jądra astrocytu, ciała komórkowego, całego astrocytu i terytorium astrocytów zmniejszyła się podczas leczenia Ianem w porównaniu z samym leczeniem amyloidem.

Po opanowaniu tego obrazu, technika analiz może zostać zakończona w ciągu kilku minut na komórkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby oznaczyć konstrukcję z dużą precyzją. Najlepiej jest przećwiczyć ręczne zaznaczanie interesującej nas struktury przed rozpoczęciem eksperymentu po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, histologią i patologią do zbadania struktury komórki w zdrowym lub chorym otoczeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć 12 różnych parametrów dla pojedynczej komórki za pomocą zdjęć 3D.