Name: Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj trójwymiarową analizę morfometryczną astrocytów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala jednocześnie ocenić wiele parametrów architektury komórkowej w warunkach patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (NIH) zatwierdzonym przez Komitet Etyki Irańskiego Uniwersytetu Nauk Medycznych (Teheran, Iran).
1. Zwierzęta, chirurgia i preparaty próbek
UWAGA: Przygotuj tkankę mózgową do konfokalnej analizy mikroskopowej 3D.
<ol>
	<li>Podziel zwierzęta losowo na dwie grupy: Aβ1-40 – wstrzyknięcie (n = 8) i Aβ1-40 – wstrzyknięcie z leczeniem genisteiną (n = 8); podawać genisteinę (10 mg/kg rozcieńczoną w podłożu, takim jak polietylenowy olej rycynowy) przez zgłębnik 1 godzinę przed zabiegiem.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie należy potwierdzić poprzez brak odruchu wycofania po uszczypnięciu palca u nogi. Podczas zabiegu należy stosować maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Umieść zwierzęta w aparacie stereotaktycznym i ogol głowę. Zastosuj roztwór jodu, aby oczyścić skórę głowy przed nacięciem i utrzymuj miejsce operacji w sterylności podczas operacji, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Wstrzyknąć Aβ1-40 stereotaktycznie (4 μl) do hipokampa na wysokości −3,5 mm za bregmą, ± 2 mm z boku do linii środkowej i −2,8 mm poniżej opony twardej, zgodnie z atlasem mózgu szczura8. Dla metody stereotaktycznej patrz poprzednia publikacja9.</li>
	<li>Zapewnić obserwację/opiekę pooperacyjną do momentu, gdy zwierzęta będą w pełni świadome, aby zapewnić im komfort. Utrzymuj zwierzęta w cieple podczas rekonwalescencji i nie umieszczaj ich z powrotem w klatce z innymi zwierzętami aż do pełnego wyzdrowienia. Zwróć uwagę na wszelkie oznaki infekcji u zwierząt po operacji.</li>
	<li>Znieczulenie zwierząt należy dokładnie przeprowadzić za pomocą ketaminy (150 mg/kg) trzy tygodnie po zabiegu. Wykonać stabilizację przezsercową poprzez perfuzję zwierząt 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH = 7,4), a następnie usunąć i naprawić mózg zgodnie z opisem w10.</li>
	<li>Po utrwaleniu mózgów w 4% paraformaldehydzie przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osadź tkankę w blokach parafiny za pomocą sprzętu do zatapiania tkanek i unikaj niedopełniania lub przepełniania kasety, ponieważ może to zakłócać prawidłowe wyrównanie lub sekcję. Zwróć uwagę na orientację tkanki w bloku parafinowym. 
	UWAGA: Na przykład hipokamp szczura znajduje się blisko tylnej części półkuli mózgowej. Dlatego tkanka powinna być osadzona w taki sposób, aby sekcja zaczynała się w tylnej części mózgu. Użyj atlasu Paxinos8 jako przewodnika, aby osiągnąć pożądaną strukturę anatomiczną.</li>
	<li>Umieść mikrotom z dala od przeciągów powietrza lub drzwi, ponieważ ruchy powietrza utrudniają przenoszenie sekcji.</li>
	<li>Użyj przekrojów o grubości ≥20 μm, ponieważ ta głębokość jest niezbędna do uzyskania obrazów Z-Stack kompletnych astrocytów. Nie używaj pierwszych kilku sekcji, ponieważ mogą one mieć niepożądaną grubość ze względu na rozszerzalność cieplną.</li>
	<li>Umieść sekcje na powierzchni ciepłej wody (5 ± 2 °C, poniżej temperatury topnienia parafiny) na tyle długo, aby spłaszczyć sekcje. 
	UWAGA: Nadmierne rozszerzenie przekroju może zaburzyć morfologię konstrukcji. Użyj małego pędzla, aby ostrożnie przenieść sekcje. Zbierz od dwóch do trzech sekcji na każdym slajdzie.</li>
	<li>Przechowuj szkiełka w stojaku w pozycji pionowej i pozwól im wyschnąć w temperaturze 37 °C przez kilka godzin lub O/N.</li>
</ol>
2. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki w ksylenie, 2 x 10 min, i ponownie nawodnić za pomocą gradientu alkoholu (99,8%, 95% i 70%, 10 min każdy) i PBS.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP) rozcieńczonym w stosunku 1:1,500 w PBS zawierającym 0,25% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,25% Triton X-100 i 3,5% normalnej surowicy (O/N w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubować z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fosforanami alkalicznymi przez 1 godzinę (1:100, 21 °C, rozcieńczone w PBS).</li>
	<li>Myj sekcje w PBS przez 3 x 5 min. 
	UWAGA: Ważne jest, aby odpowiednio umyć skrawki po przeciwciałach wtórnych, aby zminimalizować barwienie tła.</li>
	<li>Inkubuj sekcje w ciemności za pomocą Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Uwaga: Roztwór należy przygotować nie później niż 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Myć sekcje w PBS przez 3 x 5 min.</li>
	<li>Na koniec wybarwić jądra 4-6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI; 1:500, rozcieńczony w PBS) przed pokryciem. Przechowuj szkiełka w lodówce 24-48 godzin przed mikroskopią.</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
UWAGA: Do oceny ilościowej (patrz poniżej), wybierz astrocyt z wyraźnie widocznym jądrem wybarwionym DAPI z minimalną liczbą nakładających się na siebie gałęzi, aby zmniejszyć ryzyko błędów. Tworzenie obrazów Z-Stack jest czasochłonne. Uzbrój się w cierpliwość i nie zatrzymuj się podczas przetwarzania. Pionowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy służy do tworzenia obrazów 3D z astrocytów.
<ol>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63X.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij Start systemu. Kliknij kartę Zlokalizuj. Przejdź do opcji Przypisz i wybierz GFP, aby dostosować odpowiednie światło.</li>
	<li>Otwórz migawkę, aby odbijać światło. Znajdź rewolwer reflektorowy po prawej stronie migawki i wybierz kolor, który ma być odbijany przez astrocyty (zielony, czerwony lub fioletowy); Użyto tutaj koloru czerwonego (FSet20 wf). 
	UWAGA: Nie zapomnij ustawić ostrości obrazu bezpośrednio w oku mikroskopu.</li>
	<li>Aby znaleźć najlepszą ostrość, kliknij Wszystkie zamknięte, umieść pinezkę mikroskopu w trybie ekranu i kliknij kartę Akwizycja.</li>
	<li>Kliknij Smart Setup na karcie Akwizycja; otworzy się okno. Wybierz odpowiedni fluorofor (tj. DAPI i Alexa Fluor 555, w bieżącym projekcie) z listy. Kolor jest wybierany automatycznie.</li>
	<li>Kliknij Najlepszy sygnał i Zastosuj, a następnie kliknij Ustaw ekspozycję; komputer automatycznie ustawi parametry ekspozycji.</li>
	<li>Aby zoptymalizować obraz, przejdź do okna Kanały. Odznacz Ścieżka2, podświetl Ścieżka1 i kliknij Na żywo. W razie potrzeby ustaw ostrość obrazu.</li>
	<li>W oknie Channels (Kanały) dostosuj następujące; kliknij na 1AU, aby automatycznie zoptymalizować otwor. Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok, w przeciwnym razie obrazy konfokalne będą nieoptymalne. Dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność (utrzymuj to ustawienie poniżej 800, aby zredukować dodatkowy szum). Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między 2 a 3.</li>
	<li>Odznacz Ścieżkę1, kliknij Ścieżkę2 i powtórz Krok 3.8 dla Ścieżki2. Następnie zatrzymaj Ścieżkę na żywo.</li>
	<li>Przejdź do okna Tryb pozyskiwania. Popraw obraz, optymalizując rozmiar klatki i uśrednianie. Aby zmienić rozmiar ramki, przejdź do X*Y i wybierz 1,024 x 1,024. Wybierz niską prędkość, aby uzyskać lepszy obraz.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Uśrednianie i wybierz liczbę ≥4. Ta wartość uśrednienia wskazuje liczbę skanów, które zostaną uśrednione w celu uzyskania uzyskanego obrazu. Teraz kliknij przycisk Snap i zapisz przechwycony obraz 2D.</li>
	<li>W przypadku obrazowania 3D zaznacz element Z-Stack w Smart Setup powodując otwarcie okna Z-Stack.</li>
	<li>Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję dla Z-Stack, czyli głębokość komórki. Najpierw kliknij Na żywo. Następnie użyj napędu ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na najwyższym położeniu astrocytu w tkance, gdzie ma się rozpocząć Z-Stack. Kliknij Ustaw najpierw. Następnie skup się na najniższej pozycji astrocytu w tkance, gdzie skanowanie Z-Stack powinno zostać zatrzymane. Kliknij Ustaw ostatnie. Następnie zatrzymaj transmisję na żywo.</li>
	<li>Wybierz interwał; w bieżącym badaniu stosuje się 1,01 μm; wyboru interwału można dokonać, klikając Optymalny, aby ustawić liczbę wycinków.</li>
	<li>Kliknij Rozpocznij eksperyment. Zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Obraz ten zostanie wykorzystany do pomiaru następujących parametrów: powierzchni i objętości terytorium astrocytów, całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra.</li>
	<li>Uzyskaj obraz 2D przy użyciu obiektywu 10X lub 20X zgodnie z opisem w krokach 3.6-3.11. Obraz ten może być wykorzystany do pomiaru intensywności fluorescencji, immunoreaktywności przeciwciał oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000μm2).</li>
</ol>
4. Gęstość astrocytów i intensywność fluorescencji GFAP+
<ol>
	<li>Otwórz obraz 2D 20X. Kliknij Histo (hisogram) po lewej stronie okna obrazu.</li>
	<li>Aby obliczyć gęstość astrocytów, wybierz trzy kolejne pola widzenia pod obiektywem 20X. Policz liczbę astrocytów, które wykazują klarowną somę z minimalnymi, zachodzącymi na siebie gałęziami na polach.</li>
	<li>Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji, wybierz odpowiednie narzędzie (prostokąt lub okrąg) w stopce okna obrazu i wybierz obszar do pomiaru. Zwróć uwagę, że wartość średnia i odchylenie standardowe pojawiają się automatycznie pod obrazem. W niniejszej pracy wykorzystano prostokątny obszar o wielkości 0,7mm2 między prążkowiem a blaszką przyśrodkową zakrętu zębatego.</li>
</ol>
5. Gałęzie astrocytów
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo długość i całkowitą liczbę gałęzi, użyj obrazów 3D (uzyskanych z 20X) w oprogramowaniu do analizy obrazu. Narysuj linię ręcznie wzdłuż długości każdej gałęzi wybranego astrocytu. Następnie wybierz narzędzie pomiarowe, które jest wyspecjalizowane w pomiarze długości linii. Aby określić ilościowo liczbę gałęzi, wybierz narzędzie zliczające, aby policzyć liczbę oznaczonych elementów.</li>
</ol>
6. Objętość i powierzchnia
UWAGA: Ręczne oznaczanie konstrukcji w oprogramowaniu do analizy obrazów 3D wymaga skupienia i treningu. Poćwicz kilka razy przed rozpoczęciem eksperymentu.
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo objętość i powierzchnię jądra astrocytów, somy, ciała i terytorium komórki, przenieś obrazy 3D (uzyskane w krokach 3.1-3.16) do oprogramowania do analizy obrazów 3D, takiego jak Volocity 6.1.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie i utwórz nową bibliotekę. Przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny w nowej bibliotece. Następnie wybierz jeden obraz 3D. Po prawej stronie znajdują się różne kanały w różnych kolorach. Włącz jeden kanał zainteresowania; na przykład niebieski kanał dla DAPI podczas pomiaru jądra. Zmień jasność ręcznie, aby uzyskać optymalny kontrast.</li>
	<li>Wybierz menu Narzędzia, przejdź do opcji Utwórz objętość i utwórz pojedynczy obraz 3D z obrazów stosu Z. Kliknij Właściwości w menu Edycja i upewnij się, że prezentowane są właściwości X, Y i Z; w przeciwnym razie niemożliwe jest przeprowadzenie analizy 3D.</li>
	<li>Kliknij ikonę narzędzia RIO odręcznego na pasku narzędzi. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytów, narysuj linię wokół jądra oznaczonego DAPI\u2012.</li>
	<li>Aby zmierzyć objętość i powierzchnię ciała komórki astrocytów, narysuj linię wokół somy z wyłączeniem gałęzi.</li>
	<li>Aby zmierzyć objętość i powierzchnię całego astrocytu (ciała komórki, w tym gałęzi), narysuj linię wokół somy, podążając za powierzchnią wszystkich gałęzi.</li>
	<li>Aby ocenić objętość i powierzchnię terytorium astrocytów, narysuj linię między końcami gałęzi. 
	UWAGA: Naciśnij Delete na klawiaturze, aby usunąć niechciane rysunki.</li>
	<li>Kliknij menu Measurements (Pomiary) w górnej części okna obrazu, aby utworzyć protokół pomiarowy; otworzy się okno zawierające różne narzędzia.</li>
	<li>Przeciągnij pozycję Znajdź obiekty na górę okna (okienka). Nadaj opisową nazwę populacji 1, wybierz powiązany kolor i kliknij przycisk Zmierz. Otworzy się kolejne okno.</li>
	<li>Wybierz parametr, np. objętość lub powierzchnię. Kliknij OK. Dane pojawią się w tabeli.</li>
	<li>Aby zapisać dane, kliknij menu Pomiar i wybierz opcję Utwórz element pomiaru.</li>
	<li>Wybierz Nowy element miary wywoływany w otwartym oknie. Następnie nadaj nazwę danym i kliknij OK.</li>
	<li>Na koniec wyeksportuj dane do oprogramowania statystycznego, takiego jak Graph pad lub program Excel. Użyj testu t, aby przeanalizować dane, a następnie wykreśl wykresy 2D.</li>
</ol>

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li>
<li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%2Fproliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22A+stereotaxic+atlas+of+the+rat+brain%22">A stereotaxic atlas of the rat brain</a>. , Academic. New York. (1998).</li>
<li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079(2012).</li>
<li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta%281-40%29-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat%3A+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526(2013).</li>
<li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li>
<li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscie+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li>
<li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol+Exp%22%5BJournal%5D)">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez granty Rady Hrabstwa Östergötland (Szwecja) oraz Centrum Badań Komórkowych i Molekularnych na Irańskim Uniwersytecie Nauk Medycznych (Teheran, Iran).

W obecnym protokole zastosowaliśmy morfometrię konfokalną 3D do oceny 12 różnych parametrów związanych z morfologią astrocytów. W tym celu wykorzystano tkankę hipokampa szczurów z astroglejozą wywołaną Aβ1-40\u2012, z lub bez wstępnego leczenia genisteiny jako środka przeciwzapalnego. Korzystając z obrazów 3D i oprogramowania morfometrycznego, byliśmy w stanie pokazać wpływ genisteiny na astroglejozę, czyli morfologię astrocytów.
Zmiany w wewnątrz- i zewnątrzkomó...

W zdrowym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), astrocyty odgrywają ważną rolę w regulacji przepływu krwi, metabolizmu energetycznego, funkcji synaptycznych i plastyczności oraz homeostazy zewnątrzkomórkowych jonów i neuroprzekaźników1-3. Ponadto astrocyty reagują na różne szkodliwe bodźce i nieprawidłowe stany, takie jak uraz, infekcja, niedokrwienie lub neurodegeneracja poprzez astroglejozę reaktywną, która charakteryzuje się hipertrofią, proliferacją i funkcjonalną przebudową astrocytów4,5.
Astroglejoza reaktywna może zainstruować reakcję zapalną i proces naprawy w tkance, a tym samym może wpływać na kliniczne wyniki interwencji terapeutycznych. W związku z tym astrocyty zyskały uwagę neurobiologów w ciągu ostatnich dziesięcioleci jako potencjalne cele interwencji terapeutycznych w przypadku różnych chorób wpływających na OUN.
Astrocyty zazwyczaj mają gwiaździsty kształt z dobrze zaznaczonymi gałęziami, które rozprzestrzeniają się wokół somy6. W chorobie mózgu gałęzie astrocytów stają się pofałdowane i wykazują spuchnięte końce7, na przykład w obecności beta-amyloidu (Aβ).
Ten artykuł przedstawia protokół analizy obrazów 3D astrocytów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zmierzono dwanaście różnych parametrów ilościowych dla każdego astrocytu: powierzchnie i objętości terytorium astrocytów (tkanka pokryta astrocytem), cała komórka (w tym gałęzie), ciało komórki i jądro; całkowita długość i liczba odgałęzień; intensywność fluorescencji przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów; i gęstość astrocytów (liczba/1 000 μm2). W tym celu wykorzystaliśmy skrawki mózgu szczurów narażonych na wstrzyknięcie do hipokampa Aβ1-40 z leczeniem genisteiną lub bez niej jako substancji przeciwzapalnej. Opisany protokół może być stosowany do analizy morfometrycznej różnych typów komórek in vitro lub in vivo w różnych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Trzymaj w -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>trzymaj się -20 &deg; C</td></tr><tr><td>wielokolkolnicze przeciwciała królicze przeciwko fibrylarnemu białku kwasowemu glejowemu</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaliczne przeciwciała anty-króliczą IgG świń sprzężone z fosforanami</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płynny chromogen trwały</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Płynny trwały bufor do czerwonego podłoża</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polietylenotleniowany olej rycynowy - Krok 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Analiza obrazu 2000</td><td>Aparat streotaksyjny Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tablet Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Jako komórki glejowe w mózgu, astrocyty pełnią różne funkcjonalne role w ośrodkowym układzie nerwowym. W obecności szkodliwych bodźców astrocyty modyfikują swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne, co nazywa się astroglejozą reaktywną. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oceny właściwości morfologicznych astrocytów. Protokół ten obejmuje kwantyfikację 12 różnych parametrów, tj. powierzchni i objętości tkanki pokrytej przez astrocyt (terytorium astrocytów), całego astrocytu, w tym gałęzi, ciała komórki i jądra, a także całkowitej długości i liczby gałęzi, intensywności immunoreaktywności fluorescencyjnej przeciwciał stosowanych do wykrywania astrocytów oraz gęstości astrocytów (liczba/1 000 μm2). W tym celu stworzono trójwymiarowe (3D) konfokalne obrazy mikroskopowe, a do pomiarów wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu 3D, takie jak Volocity 6.3. Do przedstawienia metody wykorzystano tkankę mózgową szczura wystawioną na działanie amyloidu beta1-40 (Aβ1-40) z interwencją terapeutyczną lub bez niej. Protokół ten może być również stosowany do analizy morfometrycznej 3D innych komórek w warunkach in vivo lub in vitro.

W tej sekcji przedstawiono przykłady obserwacji jakościowych i ilościowych uzyskanych w drodze analizy morfometrycznej 3D. Pełne wyniki dla wszystkich 12 wspomnianych wcześniej parametrów znajdują się w naszej poprzedniej publikacji10.
Obserwacje jakościowe
Astrocytom towarzyszyły cienkie lub grube wypustki, które zazwyczaj były długie u szczurów po wstrzyknięciu Aβ1-40 (Rysunek 1). W korze mózgu zaobserwowano nieliczne małe as...

Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena morfologii astrocytów poprzez analizę obrazów trójwymiarowych astrocytów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być wykorzystana do oceny zmian morfologicznych, które mogą pojawić się w różnych typach komórek, zarówno w warunkach patologicznych, jak i w wyniku zastosowania strategii interwencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego badania wielu parametrów związanych z architekturą komórkową.Dr Mariam Bodel zademonstruje tę procedurę. Po przygotowaniu preparatów do barwienia immunohistochemicznego odparafinuj skrawki, zanurzając je dwukrotnie w ksylenie na 10 minut. Inkubuj preparaty przez 10 minut w każdym z roztworów etanolu o stężeniu 99,8%, 95% i 70%, aby nawodnić skrawki po przemyciu. Inkubuj preparaty w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko białku kwaśnemu włókienek glejowych (GFAP) w rozcieńczeniu 1:1500 w PBS w temperaturze 4°C przez noc.Po inkubacji przemyj skrawki w PB S 3 razy przez pięć minut. Następnie inkubuj preparaty z roztworem przeciwciała wtórnego sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj skrawki w PB S 3 razy przez pięć minut, nie później niż 30 minut przed użyciem.Dodaj jedną kroplę roztworu chromogenu czerwonego do trzech mililitrów buforu substratowego. Inkubuj każdy preparat w 100 µL tego roztworu przez 15 do 20 minut w ciemności. Następnie przemyj preparaty w PBS 3 razy przez pięć minut.Na koniec zabarw jądra komórkowe za pomocą DPI rozcieńczonego 1:500 w PBS. Nanieś jedną lub dwie krople medium Antifading na skrawki i niezwłocznie przykryj je szkiełkiem cover slip. Inkubuj preparaty w temperaturze 4°C przez 24 do 48 godzin przed badaniem mikroskopowym, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie.Aby rozpocząć mikroskopię konfokalną, umieść preparat na stole mikroskopu i wybierz obiektyw 63 x. Po uruchomieniu oprogramowania do akwizycji kliknij smart setup w zakładce akwizycji i wybierz odpowiedni zestaw filtrów (floor of fours). W tym przypadku zastosowano dappy i Alexa, floor 5 55.Następnie kliknij best signal, a następnie apply. Następnie kliknij set exposure, aby komputer mógł określić optymalne parametry ekspozycji. Aby zoptymalizować obraz, otwórz okno channels i przełącz obraz na tryb live. W razie potrzeby dostosuj ostrość.Następnie kliknij na jedną cząstkę au, aby zoptymalizować otwór w przysłonie (pinhole), i dostosuj wzmocnienie (gain) dla uzyskania najlepszej intensywności. Na koniec ustaw cyfrowe wzmocnienie w zakresie od dwóch do trzech. Po tej optymalizacji zatrzymaj obraz na żywo i otwórz okno trybu akwizycji.Dostosuj rozmiar ramki, klikając X na Y, i wybierz 10 24 na 10 24. Wybierz również niską prędkość. Następnie otwórz zakładkę uśredniania i wybierz liczbę większą lub równą czterem.Następnie kliknij przycisk snap i zapisz uchwycony obraz 2D. Aby skonfigurować obrazowanie 3D, otwórz kartę smart setup i zaznacz pozycję ZS stack, co spowoduje otwarcie okna Zs stack. Aby ustawić pierwsze i ostatnie położenie dla Zack, ponownie kliknij live i dostosuj ostrość do najwyższego punktu astrocytu.Najpierw kliknij set first. Następnie ustaw ostrość na najniższą pozycję astrocytu i kliknij set last, a potem zatrzymaj podgląd na żywo. W następnej kolejności wybierz interwał, klikając optimal.Aby ustawić liczbę przekrojów, należy przyjąć interwał wynoszący 1,01 µm. Następnie kliknij start, experiment i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Należy również wykonać obraz 2D, używając obiektywu 10x lub 20x.W celu pomiaru intensywności fluorescencji należy wybrać narzędzie prostokąta lub koła w oknie obrazu i zaznaczyć obszar pomiarowy, aby określić objętość oraz powierzchnię ciała komórkowego (somy) i terytorium jądra astrocytu. Przenieś obrazy 3D do odpowiedniego programu analitycznego, np. Velocity 6.1. Utwórz nową bibliotekę i przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny.Wybierz jeden obraz 3D i włącz jeden z interesujących nas nabytych kanałów, na przykład dapi. W przypadku pomiarów jądrowych ręcznie dostosuj jasność, aby zoptymalizować kontrast. Teraz wybierz menu narzędzi.Wybierz opcję make volume, aby wygenerować pojedynczy obraz 3D z obrazów Zack. Otwórz menu edycji i kliknij właściwości. Upewnij się, że wyświetlane są właściwości X, Y oraz Z.Następnie z paska narzędzi należy wybrać narzędzie do definiowania obszaru zainteresowania (ROI) metodą wolnej ręki. Używając wybranego narzędzia, należy obrysować jądro oznaczone jako DPI, aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytu. Ponownie, korzystając z narzędzia ROI metodą wolnej ręki, należy zmierzyć objętość i powierzchnię całego astrocytu, obrysowując somę i podążając za powierzchnią wszystkich wypustek.Kliknij menu pomiarów u góry okna obrazu, przeciągnij funkcję znajdowania obiektów (find objects) na górę okna i nadaj opisową nazwę dla populacji pierwszej, wybierz powiązany kolor i kliknij mierz (measure), co otworzy nowe okno. W tym nowym oknie wybierz objętość lub powierzchnię jako parametr i kliknij OK.Aby zapisać dane, kliknij menu pomiarów i wybierz pozycję wykonaj pomiar. Z okna wybierz nową pozycję pomiaru. Wprowadź nazwę pliku dla danych i kliknij OK.Na koniec wyeksportuj dane pomiarowe do odpowiedniego pakietu oprogramowania, aby przeprowadzić analizę statystyczną i wygenerować wykresy danych. W tym przypadku badacze porównali astrocyty w utrwalonej tkance mózgowej szczurów traktowanych amyloidem beta 1-40 lub amyloidem beta 1-40 i Ian. Iniekcja białka amyloidowego doprowadziła do powstania astrocytów o grubszych i dłuższych wypustkach.Astrocyty z grupy zwierząt traktowanych Ian wykazywały formę gwiaździstą z krótkimi i cienkimi wypustkami. U szczurów traktowanych Ian stwierdzono również zmniejszoną fluorescencję astrocytów pozytywnych pod kątem GFAP w skrawkach mózgu. Analiza morfometryczna objętości konkretnych elementów astrocytów wykazała, że objętość jądra astrocytu, ciała komórki, całego astrocytu oraz terytorium astrocytu uległy zmniejszeniu po zastosowaniu Ian w porównaniu do leczenia samym amyloidem.Po opanowaniu tego obrazu technikę analizy można przeprowadzić w ciągu kilku minut na jedną komórkę, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest, aby zaznaczać strukturę z wysoką precyzją. Najlepiej jest poćwiczyć ręczne zaznaczanie interesującej struktury przed rozpoczęciem eksperymentu, po jego opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu biologii komórki, histologii i patologii do badania struktury komórki w stanie zdrowia lub choroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pomiarzeć 12 różnych parametrów dla pojedynczej komórki przy użyciu obrazów 3D.

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Ten film przedstawia procedurę barwienia immunologicznego utrwalonego wycinka tkanki mózgowej myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych astrocytów przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz przechwytywania obrazów barwionych astrocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

Źródło: Moye, S. L., et.al.  Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą żółtej jonoforezy Lucyfera. J. Vis. Exp. (2019).  Ten film demonstruje zastosowanie jonoforezy barwnika fluorescencyjnego do badania morfologii astrocytów w utrwalonych wycinkach mózgu. Szczegółowo opisuje przekłuwanie somy astrocytów elektrodą w celu dostarczenia anionowego, hydrofilowego barwnika do cytoplazmy pod prądem o niskim napięciu, umożliwiając barwnikowi dyfuzję i znakowanie somy i gałęzi. Mikroskopia...

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy barwnika fluorescencyjnego w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Źródło: Bagheri, M., et al. Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych astrocytów w części mózgu myszy przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wycinek mózgu umieszcza się pod odpowiednią soczewką obiektywu i dobiera odpowiednie fluorofory i filtry. Po automatycznej optymalizacji ekspozycji, parametry skanowania są definiowane w celu zapewnienia obrazów 2D o wysokiej rozdzielczości. Parametry...

Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Astrocyty to morfologicznie złożone komórki, czego przykładem są ich liczne procesy i krzaczaste terytoria. Aby przeanalizować ich skomplikowaną morfologię, przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej żółtej jonoforezy Lucyfera w lekko utrwalonej tkance.

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

Poznaj trójwymiarową analizę morfometryczną astrocytów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala jednocześnie ocenić wiele parametrów architektury komórkowej w warunkach patologicznych.

Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów

Przeglądaj więcej filmów