Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów
11 grudnia 2015
Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena morfologii astrocytów poprzez analizę obrazów trójwymiarowych astrocytów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być wykorzystana do oceny zmian morfologicznych, które mogą pojawić się w różnych typach komórek, zarówno w warunkach patologicznych, jak i w wyniku zastosowania strategii interwencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego badania wielu parametrów związanych z architekturą komórkową.
Dr Mariam Bodel zademonstruje tę procedurę. Po przygotowaniu preparatów do barwienia immunohistochemicznego odparafinuj skrawki, zanurzając je dwukrotnie w ksylenie na 10 minut. Inkubuj preparaty przez 10 minut w każdym z roztworów etanolu o stężeniu 99,8%, 95% i 70%, aby nawodnić skrawki po przemyciu. Inkubuj preparaty w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko białku kwaśnemu włókienek glejowych (GFAP) w rozcieńczeniu 1:1500 w PBS w temperaturze 4°C przez noc.
Po inkubacji przemyj skrawki w PB S 3 razy przez pięć minut. Następnie inkubuj preparaty z roztworem przeciwciała wtórnego sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj skrawki w PB S 3 razy przez pięć minut, nie później niż 30 minut przed użyciem.
Dodaj jedną kroplę roztworu chromogenu czerwonego do trzech mililitrów buforu substratowego. Inkubuj każdy preparat w 100 µL tego roztworu przez 15 do 20 minut w ciemności. Następnie przemyj preparaty w PBS 3 razy przez pięć minut.
Na koniec zabarw jądra komórkowe za pomocą DPI rozcieńczonego 1:500 w PBS. Nanieś jedną lub dwie krople medium Antifading na skrawki i niezwłocznie przykryj je szkiełkiem cover slip. Inkubuj preparaty w temperaturze 4°C przez 24 do 48 godzin przed badaniem mikroskopowym, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie.
Aby rozpocząć mikroskopię konfokalną, umieść preparat na stole mikroskopu i wybierz obiektyw 63 x. Po uruchomieniu oprogramowania do akwizycji kliknij smart setup w zakładce akwizycji i wybierz odpowiedni zestaw filtrów (floor of fours). W tym przypadku zastosowano dappy i Alexa, floor 5 55.
Następnie kliknij best signal, a następnie apply. Następnie kliknij set exposure, aby komputer mógł określić optymalne parametry ekspozycji. Aby zoptymalizować obraz, otwórz okno channels i przełącz obraz na tryb live. W razie potrzeby dostosuj ostrość.
Następnie kliknij na jedną cząstkę au, aby zoptymalizować otwór w przysłonie (pinhole), i dostosuj wzmocnienie (gain) dla uzyskania najlepszej intensywności. Na koniec ustaw cyfrowe wzmocnienie w zakresie od dwóch do trzech. Po tej optymalizacji zatrzymaj obraz na żywo i otwórz okno trybu akwizycji.
Dostosuj rozmiar ramki, klikając X na Y, i wybierz 10 24 na 10 24. Wybierz również niską prędkość. Następnie otwórz zakładkę uśredniania i wybierz liczbę większą lub równą czterem.
Następnie kliknij przycisk snap i zapisz uchwycony obraz 2D. Aby skonfigurować obrazowanie 3D, otwórz kartę smart setup i zaznacz pozycję ZS stack, co spowoduje otwarcie okna Zs stack. Aby ustawić pierwsze i ostatnie położenie dla Zack, ponownie kliknij live i dostosuj ostrość do najwyższego punktu astrocytu.
Najpierw kliknij set first. Następnie ustaw ostrość na najniższą pozycję astrocytu i kliknij set last, a potem zatrzymaj podgląd na żywo. W następnej kolejności wybierz interwał, klikając optimal.
Aby ustawić liczbę przekrojów, należy przyjąć interwał wynoszący 1,01 µm. Następnie kliknij start, experiment i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Należy również wykonać obraz 2D, używając obiektywu 10x lub 20x.
W celu pomiaru intensywności fluorescencji należy wybrać narzędzie prostokąta lub koła w oknie obrazu i zaznaczyć obszar pomiarowy, aby określić objętość oraz powierzchnię ciała komórkowego (somy) i terytorium jądra astrocytu. Przenieś obrazy 3D do odpowiedniego programu analitycznego, np. Velocity 6.1. Utwórz nową bibliotekę i przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny.
Wybierz jeden obraz 3D i włącz jeden z interesujących nas nabytych kanałów, na przykład dapi. W przypadku pomiarów jądrowych ręcznie dostosuj jasność, aby zoptymalizować kontrast. Teraz wybierz menu narzędzi.
Wybierz opcję make volume, aby wygenerować pojedynczy obraz 3D z obrazów Zack. Otwórz menu edycji i kliknij właściwości. Upewnij się, że wyświetlane są właściwości X, Y oraz Z.
Następnie z paska narzędzi należy wybrać narzędzie do definiowania obszaru zainteresowania (ROI) metodą wolnej ręki. Używając wybranego narzędzia, należy obrysować jądro oznaczone jako DPI, aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytu. Ponownie, korzystając z narzędzia ROI metodą wolnej ręki, należy zmierzyć objętość i powierzchnię całego astrocytu, obrysowując somę i podążając za powierzchnią wszystkich wypustek.
Kliknij menu pomiarów u góry okna obrazu, przeciągnij funkcję znajdowania obiektów (find objects) na górę okna i nadaj opisową nazwę dla populacji pierwszej, wybierz powiązany kolor i kliknij mierz (measure), co otworzy nowe okno. W tym nowym oknie wybierz objętość lub powierzchnię jako parametr i kliknij OK.
Aby zapisać dane, kliknij menu pomiarów i wybierz pozycję wykonaj pomiar. Z okna wybierz nową pozycję pomiaru. Wprowadź nazwę pliku dla danych i kliknij OK.
Na koniec wyeksportuj dane pomiarowe do odpowiedniego pakietu oprogramowania, aby przeprowadzić analizę statystyczną i wygenerować wykresy danych. W tym przypadku badacze porównali astrocyty w utrwalonej tkance mózgowej szczurów traktowanych amyloidem beta 1-40 lub amyloidem beta 1-40 i Ian. Iniekcja białka amyloidowego doprowadziła do powstania astrocytów o grubszych i dłuższych wypustkach.
Astrocyty z grupy zwierząt traktowanych Ian wykazywały formę gwiaździstą z krótkimi i cienkimi wypustkami. U szczurów traktowanych Ian stwierdzono również zmniejszoną fluorescencję astrocytów pozytywnych pod kątem GFAP w skrawkach mózgu. Analiza morfometryczna objętości konkretnych elementów astrocytów wykazała, że objętość jądra astrocytu, ciała komórki, całego astrocytu oraz terytorium astrocytu uległy zmniejszeniu po zastosowaniu Ian w porównaniu do leczenia samym amyloidem.
Po opanowaniu tego obrazu technikę analizy można przeprowadzić w ciągu kilku minut na jedną komórkę, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest, aby zaznaczać strukturę z wysoką precyzją. Najlepiej jest poćwiczyć ręczne zaznaczanie interesującej struktury przed rozpoczęciem eksperymentu, po jego opracowaniu.
Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu biologii komórki, histologii i patologii do badania struktury komórki w stanie zdrowia lub choroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pomiarzeć 12 różnych parametrów dla pojedynczej komórki przy użyciu obrazów 3D.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy raport przedstawia protokół oceny morfologii astrocytów w trzech wymiarach z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Metoda ta pozwala na ocenę zmian morfologicznych w astrocytach w warunkach patologicznych lub po interwencjach terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Patologia
Wstęp
- Astrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym wykazują zmiany w odpowiedzi na szkodliwe bodźce.
- Zrozumienie morfologii astrocytów jest kluczowe dla badania różnych schorzeń neurologicznych.
- Niniejszy protokół umożliwia jednoczesną analizę wielu parametrów architektury komórkowej.
- Mikroskopia konfokalna pozwala na uzyskanie trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- Ocena morfologii astrocytów w stanach chorobowych.
- Ocena wpływu interwencji terapeutycznych na strukturę astrocytów.
- Opracowanie niezawodnego protokołu analizy morfologicznej.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie preparatów do barwienia immunohistochemicznego.
- Deparafinyzacja skrawków przy użyciu ksylenu.
- Rehydratacja skrawków w szeregu roztworów etanolu o różnym stężeniu.
- Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym przeciwko GFAP w celu identyfikacji astrocytów.
Główne wyniki
- Demonstracja zmian morfologicznych w astrocytach.
- Identyfikacja zmian strukturalnych w odpowiedzi na interwencje.
- Walidacja protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie ocenia morfologię astrocytów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli astrocytów w patologiach OUN.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić strategie terapeutyczne w chorobach neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena morfologii astrocytów umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych poprzez powiązanie zmian strukturalnych z interwencjami terapeutycznymi. To konfokalne podejście morfometryczne 3D zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, dostarczając wieloparametrycznych odczytów odzwierciedlających specyficzne dla danej ścieżki odpowiedzi glejowe. Metoda ta usprawnia ciągłość translacyjną z modeli in vitro lub in vivo do podejmowania decyzji przedklinicznych dzięki ustandaryzowanym i powtarzalnym procesom obrazowania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotezy terapeutycznej poprzez ilościowe określenie przebudowy strukturalnej astrocytów w odpowiedzi na beta-amyloid oraz strategie interwencyjne.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celu poprzez multiparametryczną analizę reaktywności glejowej, co pozwala zmniejszyć niejednoznaczność mechanistyczną w zakresie oddziaływania na cele w OUN.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez ustanowienie bazowych oraz indukowanych interwencją fenotypów morfologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testu dzięki ilościowym wynikom morfometrycznym opartym na 12 parametrach, odpowiednim do adaptacji w badaniach wysokoprzepustowych (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia istotność choroby poprzez modelowanie reaktywnej astrogliozy w tkance mózgu szczura eksponowanej na amyloid, co jest zgodne z translacyjnymi ścieżkami biomarkerów w neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając podłużne śledzenie zmian strukturalnych astrocytów w różnych warunkach leczenia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków – dostarczając ilościowych danych dotyczących morfologii gleju, co pozwala na dobór celów terapeutycznych oraz ograniczenie ryzyka związanego z analizowanymi szlakami.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez fenotypowanie strukturalne astrocytów w kontekstach patologicznych i interwencyjnych.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu, powtarzalność lub wyniki ilościowe, jeśli artykuł wspiera to poprzez standaryzowaną obrazowanie 3D i analizę multiparametryczną.
- Analityka: Wyróżnia pomiary, odczyty lub wyniki statystyczne pomagające zespołom porównywać warunki, w tym objętość, powierzchnię, długość odgałęzień, liczbę, intensywność fluorescencji i gęstość.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów tylko wtedy, gdy źródło wspiera to poprzez modelowanie reaktywności astrocytów istotnej dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotny potencjał, a nie technikę jednorazowego użytku, dzięki standaryzowanym protokołom obrazowania i analizy, które można zastosować w różnych typach komórek i warunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu mikroskopii konfokalnej, barwienia immunohistochemicznego oraz trójwymiarowej (3D) analizy obrazu.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym mikroskop konfokalny z możliwością akwizycji serii obrazów (Z-stack) oraz oprogramowanie do analizy 3D, takie jak Volocity.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w odniesieniu do protokołów barwienia, parametrów obrazowania oraz spójności pomiarów morfometrycznych.
- Zagadnienia dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym preparatów astrocytów in vivo i in vitro pochodzących z różnych gatunków.
- Ograniczenia praktyczne opisane w materiale źródłowym, w tym potrzeba precyzyjnego manualnego znakowania struktur oraz optymalizacji ustawień obrazowania w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.
