Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów
December 11th, 2015
Astrocyty w OUN zmieniają swoje właściwości funkcjonalne i strukturalne w odpowiedzi na szkodliwe bodźce. W artykule przedstawiono protokół oceny trójwymiarowej morfologii astrocytów w stanach chorobowych lub po interwencjach terapeutycznych.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena morfologii astrocytów poprzez analizę trójwymiarowych obrazów astrocytów, które zostały uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian morfologicznych, które mogą pojawić się w różnych typach komórek, zarówno w warunkach patologicznych, jak i jako efekt strategii interwencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele parametrów związanych z architekturą komórkową może być badanych jednocześnie.
Dr Mariam Bodel zademonstruje tę procedurę Po przygotowaniu szkiełek do immunohistochemicznego barwienia sekcji parize poprzez dwukrotne zanurzenie ich w ksylenie na 10 minut. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w każdym z 99,8%95% i 70% etanolu, aby nawodnić sekcje po umyciu. PBS inkubuje szkiełka w rozcieńczeniu od jednego do 1500 kwaśnego białka fibrylarnego gleju lub roztworu przeciwciała pierwszorzędowego GFAP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Po inkubacji przemyć skrawki w PB S3 razy przez pięć minut. Następnie inkubować szkiełka z roztworem przeciwciał drugorzędowych sprzężonym z fosfatazą alkaliczną od jednej do 100 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj sekcję w PB S3 razy przez pięć minut, mniej niż 30 minut przed użyciem.
Dodaj jedną kroplę czerwonego roztworu chromogenu do trzech mililitrów buforu substratu. Inkubować każde szkiełko w 100 mikrolitrach tego roztworu przez 15 do 20 minut w ciemności. Następnie umyj szkiełka w PB S3 razy przez pięć minut.
Na koniec wybarwić jądra DPI rozcieńczonym od jednego do 500 w PBS. Nałóż jedną lub dwie krople podłoża Antify na sekcję i natychmiast uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin przed mikroskopią, aby zapewnić uszczelnienie.
Aby rozpocząć mikroskopię konfokalną, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 63x. Po otwarciu oprogramowania do akwizycji kliknij na inteligentną konfigurację w zakładce akwizycji i wybierz odpowiednie piętro czwórek. Tutaj używane są dappy i Alexa, piętro 5 55.
Następnie kliknij najlepszy sygnał, a następnie zastosuj. Następnie kliknij ustaw ekspozycję, aby umożliwić komputerowi określenie optymalnych parametrów ekspozycji Aby zoptymalizować obraz, otwórz okno kanałów i przełącz obraz na żywo. W razie potrzeby dostosuj ostrość.
Następnie kliknij jeden au, aby zoptymalizować otwór, dostosuj wzmocnienie, aby uzyskać najlepszą intensywność. Na koniec ustaw wzmocnienie cyfrowe między dwoma a trzema. Po tej optymalizacji zatrzymaj obraz na żywo i otwórz okno trybu akwizycji.
Dostosuj rozmiar ramki, klikając X by Y i wybierz 10 24 na 10 24. Wybierz także niską prędkość. Następnie otwórz kartę uśredniania i wybierz liczbę większą lub równą cztery.
Następnie kliknij przycisk przyciągania i zapisz przechwycony obraz 2D. Aby skonfigurować obrazowanie 3D, otwórz kartę inteligentnej konfiguracji i zaznacz element stosu ZS, co spowoduje otwarcie okna stosu Zs. Aby ustawić pierwszą i ostatnią pozycję dla Zacka, ponownie kliknij na żywo i dostosuj ostrość do najwyższej pozycji astrocytu.
Najpierw kliknij ustaw. Teraz ustaw ostrość na najniższą pozycję astrocytu i kliknij ustaw ostatnią, a następnie zatrzymaj podgląd na żywo. Następnie wybierz interwał, klikając optymalny.
Aby ustawić tutaj liczbę plasterków, interwał wynosi 1,01 mikrometra. Na koniec kliknij start, eksperymentuj i zapisz obrazy po zakończeniu skanowania. Możesz także uzyskać obraz 2D za pomocą obiektywu 10 x lub 20 x.
W przypadku pomiarów intensywności fluorescencji wybierz narzędzie prostokąta lub okręgu w oknie obrazu i podświetl obszar do pomiaru, aby określić ilościowo objętość i powierzchnię jądra astrocytu, ciała i terytorium komórki somy. Przenieś obrazy 3D do odpowiedniego oprogramowania analitycznego, takiego jak Velocity 6.1 w oprogramowaniu do analizy. Utwórz nową bibliotekę i przeciągnij wszystkie obrazy do lewej szarej kolumny.
Wybierz jeden obraz 3D i włącz jeden z pozyskanych kanałów zainteresowania, np. dapi. W przypadku pomiarów jądrowych ręcznie dostosuj jasność, aby zoptymalizować kontrast. Teraz wybierz menu narzędzi.
Wybierz opcję Utwórz objętość i utwórz pojedynczy obraz 3D z obrazów Zacka. Otwórz menu edycji i kliknij właściwości. Upewnij się, że są wyświetlane właściwości X, Y i Z.
Następnie wybierz odręczne narzędzie ROI z paska narzędzi. Za pomocą wybranego narzędzia narysuj linię wokół jądra oznaczonego DPI, aby zmierzyć objętość i powierzchnię jądra astrocytu. Ponownie, korzystając z odręcznego narzędzia ROI, zmierz objętość i powierzchnię całego astrocytu, rysując linię wokół somy podążającą za powierzchnią wszystkich gałęzi.
Kliknij menu pomiarów w górnej części okna obrazu, przeciągnij znajdź obiekty na górę okna i nadaj opisową nazwę populacji pierwszej, wybierz powiązany kolor i kliknij miarę, co otworzy nowe okno. W tym nowym oknie. Jako parametr wybierz objętość lub pole powierzchni i kliknij przycisk OK.
Aby zapisać dane, kliknij menu pomiaru i wybierz opcję Utwórz element pomiaru. Wybierz nowy element miary wywoływany z okna. Wprowadź nazwę pliku dla danych i kliknij przycisk OK.
Na koniec należy wyeksportować dane pomiarowe do odpowiedniego pakietu oprogramowania w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i wygenerowania wykresów danych. Naukowcy porównali astrocyty w utrwalonej tkance mózgowej szczurów leczonych amyloidem beta one 40 lub amyloidem beta one 40 i Ianem. Wstrzyknięcie białka amyloidowego spowodowało powstanie astrocytów o grubszych i dłuższych gałęziach.
Te astrocyty od zwierząt leczonych Ianem wykazywały gwiaździsty kształt z krótkimi i cienkimi gałęziami. Szczury leczone Ianem wykazały również zmniejszoną dodatnią fluorescencję astrocytów GFAP w wycinkach mózgu. Analiza morfometryczna określonych objętości astrocytów wykazała, że objętość jądra astrocytu, ciała komórkowego, całego astrocytu i terytorium astrocytów zmniejszyła się podczas leczenia Ianem w porównaniu z samym leczeniem amyloidem.
Po opanowaniu tego obrazu, technika analiz może zostać zakończona w ciągu kilku minut na komórkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby oznaczyć konstrukcję z dużą precyzją. Najlepiej jest przećwiczyć ręczne zaznaczanie interesującej nas struktury przed rozpoczęciem eksperymentu po jego opracowaniu.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, histologią i patologią do zbadania struktury komórki w zdrowym lub chorym otoczeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć 12 różnych parametrów dla pojedynczej komórki za pomocą zdjęć 3D.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy raport przedstawia protokół oceny morfologii astrocytów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopi konfokalnej. Metoda ocenia zmiany morfologiczne w astrocytach w warunkach patologicznych lub po interwencjach terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Patologia
Tło
- Astrocyty w OUN wykazują zmiany w odpowiedzi na szkodliwe bodźce.
- Zrozumienie morfologii astrocytów jest kluczowe dla badania różnych stanów neurologicznych.
- Ten protokół pozwala na jednoczesną analizę wielu parametrów architektury komórkowej.
- Mikroskopia konfokalna zapewnia wysokiej rozdzielczości trójwymiarowe obrazy.
Cel badania
- Ocenienie morfologii astrocytów w stanie chorobowym.
- Ocena wpływu interwencji terapeutycznych na strukturę astrocytów.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu do analizy morfologicznej.
Stosowane metody
- Przygotowanie preparatów do barwienia immunohistochemicznego.
- Deparaffinizacja przekrojów przy użyciu xylolu.
- Rehydratacja przekrojów poprzez stopniowe roztwory etanolu.
- Inkubacja z pierwotnym przeciwciałem GFAP do identyfikacji astrocytów.
Główne wyniki
- Wykazanie zmian morfologicznych w astrocytach.
- Identyfikacja zmian strukturalnych w odpowiedzi na interwencje.
- Walidacja protokołu na potrzeby przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie ocenia morfologię astrocytów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli astrocytów w patologii OUN.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić strategie terapeutyczne w chorobach neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of astrocyte morphology enables mechanistic de-risking in neurodegenerative target validation by linking structural changes to therapeutic interventions. This 3D confocal morphometric approach supports predictive confidence in early discovery by providing multiparametric readouts that reflect pathway-specific glial responses. The method enhances translational continuity from in vitro or in vivo models to preclinical decision-making through standardized, reproducible imaging workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying astrocyte structural remodeling in response to amyloid beta and intervention strategies.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric analysis of glial reactivity, reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and intervention-induced morphological phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative 12-parameter morphometric outputs suitable for high-content screening adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling reactive astrogliosis in amyloid-exposed rat brain tissue, aligning with translational biomarker pathways in neurodegeneration.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of astrocyte structural changes across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative glial morphology data that informs target selection and pathway de-risking.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through structural phenotyping of astrocytes in pathological and intervention contexts.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via standardized 3D imaging and multiparametric analysis.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including volume, surface area, branch length, number, fluorescence intensity, and density.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via disease-relevant astrocyte reactivity modeling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized imaging and analysis protocols applicable across cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, immunohistochemical staining, and 3D image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal microscope with Z-stack capability and 3D analysis software such as Volocity.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols, imaging parameters, and morphometric measurement consistency.
- Adaptation considerations across model systems including in vivo and in vitro astrocyte preparations from various species.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise manual structure marking and optimization of imaging settings for signal-to-noise ratio.
