Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis tego, jak używać matrycy fotodiod i barwników wrażliwych na napięcie do jednoczesnego rejestrowania potencjałów czynnościowych z dużej liczby neuronów. W porównaniu z obrazowaniem aktywności neuronalnej wapniem, które jest pośrednie, barwniki wrażliwe na napięcie, których używamy, rejestrują potencjały czynnościowe bezpośrednio podobne do zapisów ostrych elektrod, ale w wielu neuronach jednocześnie. Nasz proces obrazowania optycznego można dostosować do szybkiej wizualizacji aktywności sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu i potencjału czynnościowego w różnych nietransgenicznych systemach bezkręgowców, a nawet kręgowców.

Dodatkowo procedury w naszym protokole zademonstruje Evan Hill z mojego laboratorium. Zacznij od znieczulenia 40-gramowego zwierzęcia Aplysia californica i przygwożdżenia go brzuszną stroną do góry w woskowanym naczyniu rozwarstwiającym. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe nacięcie w linii środkowej wzdłuż najbardziej przedniej części stopy i przypnij płaty stopy po obu stronach nacięcia, aby odsłonić część ośrodkowego układu nerwowego i masę policzkową.

Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie wypreparować masę policzkową, odsłaniając zwoje mózgowe, i przeciąć nerwy unerwiające ciało zwierzęcia, aby wyciąć ośrodkowy układ nerwowy, pozostawiając długi odcinek nerwu do stymulacji. Za pomocą drobiazgowych szpilek umieść ośrodkowy układ nerwowy w naczyniu wyłożonym elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną i przelej naczynie solą fizjologiczną przepuszczoną przez urządzenie chłodzące Peltiera, aby utrzymać temperaturę przygotowania na poziomie od 15 do 16 stopni Celsjusza. Użyj kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej z nerwów i wypreparuj powierzchowną część osłonki na zwoju lub zwojach, które mają być zobrazowane.

Następnie zanurz oczyszczony ośrodkowy układ nerwowy w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej na 20 sekund, zanim skierujesz ośrodkowy układ nerwowy z powrotem do naczynia wyłożonego elastomerem perfuzji soli fizjologicznej, aby spłukać nadmiar aldehydu glutarowego. Aby przygotować roztwór roboczy barwnika wrażliwego na napięcie, dodaj 500 mikrolitrów soli fizjologicznej do wcześniej przygotowanej stałej podwielokrotności wilgotności względnej 155, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 0,3 miligrama na mililitr. I użyj ręcznego mikrodozownika, aby załadować 200 mikrolitrów roztworu do kawałka rurki polietylenowej o średnicy podobnej do średnicy ganglionu, który ma być zabarwiony.

Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie umieść koniec rurki nad docelowym ganglionem, opuszczając rurkę, aż utworzy szczelne uszczelnienie nad ganglionem. Obracaj pokrętłem aplikatora mikrodozownika co pięć minut przez godzinę, aby wcisnąć więcej barwnika na ganglion, sprawdzając próbkę po 30 minutach, aby potwierdzić, że występuje odpowiednie barwienie. Po barwieniu, utrzymując przyciemnione światła, należy umieścić odpowiedni materiał buforowy po lewej i prawej stronie miejsca, w którym preparat zostanie umieszczony w komorze obrazowania zawierającej sól fizjologiczną, a następnie zanurzyć w komorze ośrodkowy układ nerwowy.

Dociśnij kawałek szkiełka nakrywkowego o odpowiedniej wielkości do tkanki i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć tkankę bez uszkadzania neuronów. Następnie umieść komorę obrazowania pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli stymulujesz nerw do wywołania fikcyjnego programu motorycznego, ostrożnie stopij segment rurki polietylenowej PE100 nad płomieniem, delikatnie pociągając oba końce segmentu rurki i odetnij powstały stożek w żądanym punkcie.

Następnie przymocuj odcinek grubościennej elastycznej rurki polimerowej do tylnego końca polietylenowej elektrody ssącej. Następnie użyj sekcji ustnej, aby wytworzyć podciśnienie i wciągnij niewielką objętość soli fizjologicznej przez stożkowy koniec elektrody ssącej. Narysuj koniec nerwu, który ma być stymulowany, do elektrody pod mikroskopem i upewnij się, że sól fizjologiczna w elektrodzie nie ma pęcherzyków, które mogłyby przerwać przewodzenie elektryczne.

W celu zobrazowania ganglionu należy przenieść komorę do stanowiska do obrazowania i zainicjować perfuzję soli fizjologicznej przez komorę rejestracyjną. Umieść sondę temperatury w pobliżu preparatu i ustaw temperaturę odpowiednią dla obrazowanego gatunku. Umieść jeden drut chlorkowanego srebra w dół elektrody ssącej, upewniając się, że styka się z solą fizjologiczną w elektrodzie i umieść drut z chlorkiem srebra w soli fizjologicznej w kąpieli w pobliżu elektrody ssącej.

Opuść soczewkę zanurzeniową w wodzie do soli fizjologicznej i zamknij membranę podstawową. Podnieś lub opuść kondensator podstopniowy i wyreguluj ostrość, aż krawędzie membrany będą ostre, tworząc oświetlenie Kohlera. Skoncentruj się na obszarze preparatu, który ma być obrazowany, i uzyskaj obraz interesującego ganglionu za pomocą parafokalnej kamery cyfrowej.

Ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 1X i kliknij przycisk natężenia światła spoczynkowego, aby sprawdzić średnie natężenie światła spoczynkowego diod. Dostosuj poziom napięcia przesyłanego ze stymulatora do zasilania lampy LED i kontynuuj sprawdzanie średniego poziomu natężenia światła spoczynkowego, aż znajdzie się w żądanym zakresie. Następnie ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 100X do nagrywania i dokładnie sprawdź, czy stół sprężynowy lub powietrzny unosi się.

Gdy kontrolki są nadal przyciemnione, ustaw czas trwania pliku, ścieżkę i nazwę w oprogramowaniu do obrazowania, a następnie kliknij przycisk Pobierz dane, aby pobrać pliki do pojemności dostępnej pamięci RAM komputera. Uważaj, aby pozostać nieruchomo podczas nagrywania, ponieważ małe wibracje mogą wprowadzać duże artefakty do danych zapisu optycznego. Aby wyświetlić dane natychmiast po akwizycji, użyj funkcji nałożenia, aby nałożyć dane zebrane przez wszystkie 464 diody na obraz ganglionu i kliknij dowolną diodę reprezentowaną w oprogramowaniu, aby rozwinąć zarejestrowane dane na osobnym ekranie śledzenia.

Aby uzyskać dokładne wyrównanie diod w stosunku do preparatu, wprowadź współczynniki X, Y i powiększenia, zgodnie z testem otworkowym. Aby zmaksymalizować widoczność potencjału czynnościowego i poprawić wydajność neuronów do późniejszego sortowania impulsów, nałóż pasmowo-przepustowy filtr Butterwortha z pięcioma i 100 hercami, aby usunąć zarówno szum o niskiej, jak i wysokiej częstotliwości. Aby zapisać przefiltrowane dane optyczne jako plik tekstowy do późniejszej analizy, na ekranie strony zaznacz pole Filtr TP.

Na karcie danych wyjściowych wybierz opcję zapisz stronę jako ASCII. Następnie wprowadź odpowiednią nazwę pliku w wyświetlonym oknie dialogowym. Kontakt skóry z morskim drapieżnikiem uruchamia ucieczkowe pływanie Tritonia diomedia, składające się z rytmicznej serii zgięć całego ciała, które popychają go w bezpieczne miejsce.

Na tym rysunku pokazano surowe i przefiltrowane dane z 20 diod rejestrujących aktywność przed, w trakcie i po stymulacji nerwu pedału trzy. Bezpośrednio po akwizycji, sygnały zmierzone przez wszystkie 464 diody matrycy rejestrującej mogą być topograficznie wyświetlone na obrazie preparatu w oprogramowaniu do obrazowania. W tej analizie kolce sortujące przefiltrowane ślady diody za pomocą niezależnej analizy komponentów (ICA) dały 53 unikalne ślady neuronalne, z których 30 pokazano tutaj.

Silnie awersyjny bodziec ogonowy wobec Aplysia californica wywołuje powtarzające się fale dwuczęściowej rytmicznej reakcji ucieczki, składającej się z okresu galopu składającego się z kilku cykli wychyleń głowy i ciągnięć za ogon, które szybko przesuwają zwierzę do przodu, a następnie okresu pełzania. W tej reprezentatywnej analizie, po jednej minucie ciągłego 20-minutowego nagrania optycznego, nerw pedałowy dziewiąty został pobudzony do wywołania sekwencji programu motorycznego galopu-pełzania. Probabilistyczne rozkłady przestrzenne Gaussa sygnałów ze wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów zostały zmapowane na zwoju.

Redukcja wymiarowości zastosowana do pełnego nagrania ujawniła, że fazy galopu i czołgania się programu ucieczki zajmowały odrębne obszary i tworzą różne trajektorie w przestrzeni głównego komponentu. Podczas korzystania z tego protokołu ważne kwestie obejmują: optymalizację barwienia, minimalizację wibracji i kierowanie wystarczającej ilości światła przez preparat do PDA, przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotowybielania barwnika. Przykłady analiz po przejęciu, które ujawniły wgląd w sieć na poziomie populacji, obejmują wykrywanie zespołów funkcjonalnych poprzez grupowanie konsensusu w algorytmie uczenia się nienadzorowanego oraz redukcję wymiarowości przy użyciu analizy głównych składowych.

Połączenie naszego systemu obrazowania opartego na matrycy fotodiodowej i zastosowania absorbentów barwników wrażliwych na napięcie umożliwia monitorowanie dynamicznej ewolucji sieci w dłuższym okresie czasu.