Name: Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę obrazowania optycznego z fotodiodami do rejestrowania akcji potencjałów w sieciach neuronowych bezkręgowców. Technika ta umożliwia bezpośredni zapis aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczego neuronu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NSF 1257923 i NIH 1U01NS10837. Autorzy pragną podziękować Jeanowi Wangowi za pomoc w laboratorium.

UWAGA: Opisany poniżej proces pracy jest podsumowany w Rysunek 2.
1. Minimalizacja wibracji
<ol>
	<li>Jeśli to możliwe, upewnij się, że platforma znajduje się na parterze i użyj stołu izolacyjnego opartego na sprężynie, który tłumi szerszy zakres częstotliwości drgań niż stoły powietrzne.</li>
	<li>Jeśli używasz stołu opartego na sprężynie, upewnij się, że jest on pływający (należy go regulować za każdym razem, gdy dodaje się lub zdejmuje coś ze stołu).</li>
	<li>Zmniejsz hałas spowodowany wibracjami w pomieszczeniu do obrazowania tak bardzo, jak to możliwe, nawet do tego stopnia, że w razie potrzeby odciąć przepływ powietrza podczas obrazowania. Zminimalizuj wszelkie wibracje wynikające z turbulencji płynu w systemach perfuzyjnych. 
	UWAGA: Preparat neuronalny nie może się poruszać podczas akwizycji. Wszelkiego rodzaju ruchy powodują przesunięcia krawędzi kontrastu w poprzek diod, co prowadzi do sztucznych sygnałów. Jeśli zabieg obejmuje bodziec podczas akwizycji, nie może on wywoływać ruchów preparacji.</li>
</ol>
2. Uruchom test otworkowy, aby umożliwić prawidłowe wyrównanie zdjęć ganglionów z danymi PDA
<ol>
	<li>Umieść kawałek folii aluminiowej z wbitymi w nią 3 małymi otworami na szkiełku mikroskopowym. Zrób zdjęcie trzech otworów aparatem cyfrowym zamontowanym na parafokalnym fotoportie.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do obrazowania dołączonego do palmtopa, uzyskaj krótki plik (np. 5 s). W trakcie akwizycji dotknij stołu, aby wywołać artefakty drgań, które będą bardzo widoczne wokół krawędzi otworków, co pozwoli na precyzyjne wyrównanie obrazu otworków z danymi optycznymi.</li>
	<li>Użyj funkcji Superimpose w oprogramowaniu do obrazowania, która znajduje się w punkcie menu "Wyświetlacz | Nakładanie strony | Nakładanie śladów z obrazem zewnętrznym | Nałóż obraz", aby nałożyć dane diody na zdjęcie otworków, a następnie iteracyjnie dostosuj ustawienia x, y i powiększenia dla zdjęcia, aż otworki znajdą się bezpośrednio na artefaktach otworkowych w danych diody.
	<ol>
		<li>Zapisz te liczby, aby wyrównać obrazy przygotowawcze wykonane aparatem z danymi diody w przyszłych eksperymentach. 
		UWAGA: Wyrównanie otworkowe PDA należy wykonać tylko raz po zamontowaniu PDA na mikroskopie, aż do jego obrócenia lub usunięcia, po czym należy to zrobić ponownie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcje trzech gatunków ślimaków morskich
<ol>
	<li>W przypadku gatunków, które osiągają duże rozmiary, takich jak Tritonia i Aplysia, zacznij od mniejszych osobników, które mają cieńsze, mniej nieprzezroczyste zwoje, co ułatwia uzyskanie wystarczającej ilości światła dla optymalnego stosunku sygnału do szumu.</li>
	<li>Przygotuj przefiltrowaną sztuczną wodę morską, która będzie używana jako sól fizjologiczna do sekcji i eksperymentów obrazowych. 
	UWAGA: We wszystkich kolejnych krokach protokołu "sola" oznacza sztuczną wodę morską.</li>
	<li>Rozwarstwienie Tritonia diomedea
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę w lodówce na około 20 minut, aby je znieczulić.</li>
		<li>W przypadku większych zwierząt należy odsłonić mózg, trzymając zwierzę w jednej ręce, pozwalając, aby koniec głowy układał się na palcu wskazującym, aby odsłonić "szyję". W przypadku mniejszych zwierząt przypnij je grzbietową stroną do góry w wyłożonym woskiem naczyniu preparacyjnym przed odsłonięciem mózgu.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 3-4 cm nacięcie w linii środkowej po grzbietowej stronie zwierzęcia, powyżej masy policzkowej (którą można wyczuć przez ścianę ciała). 
		UWAGA: Potrzebna część OUN, składająca się ze zrośniętych, obustronnych zwojów mózgowo-opłucnowych i pedałowych, jest pomarańczowa i różni się wyglądem od otaczającej tkanki; Leży bezpośrednio za nosorożcami i na szczycie masy policzkowej.</li>
		<li>Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, zachowując nienaruszone wszystkie nerwy łączące środkowe zwoje. Pozostaw długi odcinek nerwu pedału 3 (PdN3) lub innego nerwu, który będzie stymulowany.</li>
		<li>Użyj maleńkich szpilek, aby przymocować OUN do dna naczynia wyłożonego elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną w celu dalszej sekcji. Utrzymuj temperaturę przygotowania na poziomie 11 °C, przetapiając naczynie solą fizjologiczną dostarczaną za pomocą sterowanego sprzężeniem zwrotnym, liniowego systemu chłodzenia Peltiera za pomocą pompy perystaltycznej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji ostrożnie usuń luźno przylegającą warstwę tkanki łącznej z okolic OUN. Pozostaw cienką osłonkę ściśle przylegającą do zwojów.</li>
		<li>Krótko (~10 s) zanurz zwoje w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej. Umieść zwoje nerwowe z powrotem w naczyniu wyłożonym elastomerem z perfuzją soli fizjologicznej, pozwalając soli fizjologicznej zmyć aldehyd glutarowy przed rozpoczęciem barwienia VSD. 
		UWAGA: To lekkie utrwalenie tkanki łącznej i jej wewnętrznych mięśni pomoże zapobiec ruchowi podczas obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja Aplysia californica
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę o wadze około 40 g, wstrzykując ~20 ml 350 mM MgCl2 do organizmu przez powierzchnię brzuszną (stopę).</li>
		<li>Użyj szpilek, aby ustawić zwierzę brzuszną stroną do góry w naczyniu preparacyjnym wyłożonym woskiem.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 2-3 cm nacięcie w linii środkowej wzdłuż najbardziej przedniej części stopy. Przygnij płaty stopy po obu stronach nacięcia, aby odsłonić część OUN i masę policzkową. 
		UWAGA: Potrzebna część OUN, składająca się ze zrośniętych zwojów mózgowych i ściśle przylegających, obustronnych zwojów opłucnej i pedału, jest żółto-pomarańczowa i różni się wyglądem od otaczającej tkanki; Znajduje się grzbietowo i tylno-bocznie w stosunku do bulwiastej mięśniowej masy policzkowej.</li>
		<li>Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie wypreparować masę policzkową, odsłaniając zwoje mózgowe.</li>
		<li>Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, zachowując nienaruszone wszystkie nerwy łączące środkowe zwoje. Pozostaw długi odcinek nerwu pedału 9 (PdN9) lub innego nerwu, który będzie stymulowany.</li>
		<li>Użyj maleńkich szpilek, aby umieścić CNS w naczyniu wyłożonym elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną. Utrzymuj temperaturę przygotowania na poziomie 15-16 °C, przetapiając naczynie solą fizjologiczną przechodzącą przez urządzenie chłodzące Peltiera.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji usuń nadmiar tkanki łącznej z OUN i wypreparuj powierzchowną część osłonki na zwoju lub zwojach, które mają być zobrazowane. Uważaj podczas tego procesu, aby nie zrobić w osłonce, co spowodowałoby wylanie się neuronów ze środka.</li>
		<li>Krótko (~20 s) zanurzyć zwoje w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej. Umieść zwoje nerwowe z powrotem w naczyniu wyłożonym elastomerem przesyconym solą fizjologiczną, pozwalając soli fizjologicznej zmyć aldehyd glutarowy przed rozpoczęciem barwienia VSD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparacja Berghia stephanieae
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę w lodówce na około 20 minut, aby je znieczulić.</li>
		<li>Używając naczynia wyłożonego elastomerem wypełnionego solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej, umieść drobne szpilki zarówno w głowie, jak i ogonie.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji wykonaj 5-7 mm nacięcie grzbietowe powierzchowne do OUN. 
		UWAGA: Oczy, ciemne plamy, które znajdują się w zwierzęciu obok OUN, wygodnie zaznaczają położenie potrzebnej części OUN, która składa się z obustronnie zrośniętych zwojów mózgowo-opłucnowych i pedałowych i znajduje się na szczycie masy policzkowej.</li>
		<li>Wytnij OUN, przecinając nerwy unerwiające ciało zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji. Pozostaw stymulowany nerw wystarczająco długo, aby elektroda ssąca mogła zostać potwierdzona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zabarwić preparat barwnikiem wrażliwym na napięcie.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe RH155 (znanego również jako NK3041) lub RH482 (znanego również jako NK3630 lub JPW1132).
	<ol>
		<li>RH155: Rozpuścić 5,4 mg stałego barwnika w 1 ml 100% EtOH, pipetując 29 μl do każdej z 34 probówek do mikrowirówek. Mając zawartość każdej tubki wystawioną na działanie powietrza, pozostaw ją do wyschnięcia przez noc w ciemności. Zakryć i umieścić otrzymane stałe porcje RH155, z których każdy zawiera 0,15 mg, w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>RH482: Rozpuścić 2 mg stałego barwnika w 100 μl DMSO, podzielić roztwór na 20 porcji po 5 μl, z których każda zawiera 0,1 mg RH482 i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: W przypadku Tritonia i Aplysia, w celu załadowania VSD RH155 do błon neuronów w preparacie można zastosować perfuzję w kąpieli lub aplikację ciśnieniową. Zastosowanie ciśnienia ma tę zaletę, że tylko ganglion, który jest obrazowany, jest wystawiony na VSD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu perfuzji w kąpieli dodać 5 ml soli fizjologicznej do każdej z dwóch powyższych porcji stałego RH155 i przetoczyć wir do roztworu, otrzymując połączony roztwór 10 ml zawierający 0,03 mg/ml RH155.
	<ol>
		<li>Perfuzja w ciemności (w celu uniknięcia fotowybielania) przez 1 do 1,5 godziny w temperaturze 11 °C dla Tritonii i w temperaturze 16 °C dla Aplysia. Utrzymuj temperaturę, przepuszczając roztwór perfuzyjny przez układ chłodzenia Peltiera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku aplikacji ciśnieniowej dodać 500 μl soli fizjologicznej do jednej podwielokrotności RH155 i odwirować, aby uzyskać stężenie barwnika 0,3 mg/ml.
	<ol>
		<li>Pobrać około 200 μl roztworu do rurki polietylenowej za pomocą ręcznego mikrodozownika, upewniając się, że średnica probówki jest dobrze dopasowana do średnicy ganglionu, który ma być zabarwiony.</li>
		<li>Użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie umieścić koniec rurki nad docelowym ganglionem, opuszczając go, aż utworzy ciasne uszczelnienie na ganglionie. Użyj opisanego powyżej typu układu chłodzenia, aby utrzymać zwoje w żądanej temperaturze.</li>
		<li>Przyciemnij światła w pomieszczeniu, aby uniknąć fotowybielania i obracaj pokrętło aplikatora mikrodozownika co 5 minut, aby wcisnąć więcej barwnika na ganglion.</li>
		<li>Sprawdź po 30 minutach, aby upewnić się, że występuje dobre barwienie, a następnie kontynuuj barwienie przez łączny czas około 1 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do barwienia w Berghia dodaj 1 ml soli fizjologicznej do zamrożonej podwielokrotności RH482 i zwiruj do rozpuszczenia.
	<ol>
		<li>Przenieść 200 μl tego roztworu do probówki mikrowirówkowej zawierającej 800 μl soli fizjologicznej i przekręcić do roztworu, otrzymując końcowy roztwór barwiący 0,02 mg/ml RH482 w soli fizjologicznej z 0,1% DMSO.</li>
		<li>Umieść cały OUN w probówce do mikrowirówki, owijając probówkę folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania, i potrząsaj ręcznie co 5-6 minut przez około 1 godzinę. Pozostałe 800 μl pierwszego roztworu przechowuj w lodówce i używaj do 3 dni w celu zabarwienia kolejnych preparatów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Spłaszcz przygotowanie i przygotuj się na stymulację nerwów
UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji powinny być wykonywane przy minimalnym oświetleniu lub przy zielonym świetle, aby zminimalizować fotowybielanie.
<ol>
	<li>Po barwieniu zanurz OUN w soli fizjologicznej w komorze obrazowania i umieść pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Umieść kawałki silikonu (dla Tritonii lub Aplysia) lub kropelki wazeliny (dla Berghii) po lewej i prawej stronie ganglionu/ganglii, które mają być zobrazowane.</li>
	<li>Dociśnij odpowiedniej wielkości kawałek szklanego lub plastikowego szkiełka nakrywkowego do preparatu, aby go spłaszczyć. Naciskaj mocno, ale nie tak mocno, aby uszkodzić neurony. 
	UWAGA: Spłaszczenie wypukłej powierzchni preparatu w ten sposób sprawi, że większa liczba neuronów stanie się parafokalna, zwiększając tym samym liczbę rejestrowanych neuronów, a ponadto pomoże unieruchomić preparat podczas obrazowania.</li>
	<li>Jeśli stymulujesz nerw w celu wywołania fikcyjnego programu motorycznego, przygotuj elektrodę ssącą, której przednia końcówka jest w przybliżeniu tak szeroka, jak średnica nerwu. W tym celu należy ostrożnie stopić segment rurki polietylenowej PE-100 nad płomieniem, delikatnie pociągając oba końce segmentu rurki, a następnie przecinając powstały stożek w żądanym punkcie.
	<ol>
		<li>Wciągnąć niewielką objętość soli fizjologicznej przez stożkowy koniec polietylenowej elektrody ssącej, a następnie koniec nerwu, który ma być stymulowany, mocując odcinek grubościennej, elastycznej rurki polimerowej do tylnego końca elektrody i używając ssania w ustach do wytworzenia podciśnienia.</li>
		<li>Upewnij się, że sól fizjologiczna w elektrodzie nie ma pęcherzyków, które mogłyby przerwać przewodzenie elektryczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie i optymalizacja do obrazowania
<ol>
	<li>Przenieś komorę do stanowiska do obrazowania. Rozpocznij perfuzję soli fizjologicznej przez komorę rejestracyjną i umieść sondę temperatury w pobliżu preparatu. Ustaw regulator temperatury na żądaną temperaturę dla obrazowanego gatunku (dla Tritonii 11 °C, dla Aplysii 15-16 °C lub dla Berghia 26-27 °C).</li>
	<li>Umieść jeden drut chlorkowanego srebra w dół elektrody ssącej, upewniając się, że styka się z solą fizjologiczną w elektrodzie, a drugi drut Ag-AgClCl (ścieżka powrotna) umieść w soli fizjologicznej kąpieli, w pobliżu elektrody ssącej.</li>
	<li>Opuść soczewkę zanurzeniową w wodzie do soli fizjologicznej. Zamknij przysłonę podstawową, a następnie podnieś lub opuść kondensator podstopniowy i wyreguluj ostrość, aż krawędzie przysłony będą ostre, tworząc oświetlenie Köhlera.
	<ol>
		<li>Skoncentruj się na obszarze przygotowania, które ma być zobrazowane. Stronniczość skupia się na mniejszych neuronach w stosunku do większych, ponieważ sygnały optyczne pochodzące z większych neuronów są bardziej prawdopodobne niż mniejsze neurony, nawet jeśli są nieco nieostre.</li>
		<li>Zrób zdjęcie ganglionu, który ma być sfotografowany za pomocą parafokalnego aparatu cyfrowego.</li>
		<li>Gdy przełącznik wzmocnienia panelu sterowania jest ustawiony na 1x, sprawdź natężenie światła spoczynkowego (RLI) w oprogramowaniu do obrazowania, klikając przycisk "RLI" i sprawdzając średnie RLI diod. Dostosuj poziom napięcia przesyłanego ze stymulatora do zasilania lampy LED i kontynuuj sprawdzanie średniego poziomu RLI, aż znajdzie się w żądanym zakresie (zwykle około 3-4 V). 
		UWAGA: Pożądane są wysokie RLI, odpowiadające około 3-4 V na PDA. Im wyższe światło, tym lepszy stosunek sygnału do szumu sygnałów optycznych, jednak należy to zrównoważyć z szybszym tempem fotowybielania przy wyższych RLI. Ryzyko to jest zminimalizowane dzięki zastosowaniu soczewek obiektywowych o wysokim NA. Stosowane soczewki obiektywowe do zanurzenia w wodzie to 10x/0,6 NA, 20x/0,95 NA, 40x/0,8 NA i 40x/1,15 NA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 100x dla nagrywania.</li>
	<li>Jeśli stymulujesz nerw, ustaw żądane napięcie, częstotliwość i czas trwania na oddzielnym stymulatorze od tego, który służy do ustawiania poziomu światła. Upewnij się, że wyzwalanie TTL między panelem sterowania a stymulatorem jest prawidłowo skonfigurowane. 
	UWAGA: Przykładowe parametry bodźca nerwowego u każdego gatunku są następujące: Tritonia PdN3, 2 s, ciąg impulsów 10 Hz 5 ms, impulsy 10 V; Aplizja PdN9, 2,5 s, ciąg impulsów 20 Hz 5 ms, impulsy 8 V; nerw pedałowy Berghia, 2 s, ciąg impulsów 10 Hz 5 ms, impulsy 5 V.</li>
	<li>Dokładnie sprawdź, czy stół sprężynowy lub powietrzny unosi się na wodzie.</li>
</ol>
7. Zapis optyczny
<ol>
	<li>Wyłącz lub przyciemnij światła w pomieszczeniu, w tym górne oświetlenie fluorescencyjne.</li>
	<li>Ustaw żądany czas trwania pliku, ścieżkę i nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk "Weź dane" w oprogramowaniu do obrazowania, aby pobrać pliki do pojemności dostępnej pamięci RAM komputera. Pozostań nieruchomo podczas zapisu optycznego, ponieważ małe drgania mogą wprowadzać duże artefakty do danych zapisu optycznego. 
	UWAGA: W przypadku przejęć, które przekraczałyby dostępną pamięć RAM komputera, dostępny jest niestandardowy program do nabywania języka C++ za pośrednictwem dr Jian-young Wu z Uniwersytetu Georgetown.</li>
	<li>Aby wyświetlić dane natychmiast po ich pozyskaniu, użyj funkcji Superimpose w oprogramowaniu do obrazowania, aby nałożyć dane zebrane przez wszystkie 464 diody na obraz ganglionu wykonany wcześniej przez preparat7. Kliknij dowolną z diod reprezentowanych w oprogramowaniu, aby rozwinąć to, co zarejestrowały na osobnym ekranie śledzenia.
	<ol>
		<li>Osiągnij dokładne wyrównanie diod w odniesieniu do przygotowania, wprowadzając współczynniki x, y i powiększenia, jak wcześniej określono w teście otworkowym.</li>
		<li>Aby zmaksymalizować widoczność potencjału czynnościowego i poprawić wydajność neuronów dla późniejszego sortowania impulsów14, nałóż pasmowoprzepustowy filtr Butterwortha z odcięciami 5 Hz i 100 Hz (dostępny w oprogramowaniu do obrazowania), aby usunąć zarówno szumy o niskiej, jak i wysokiej częstotliwości.</li>
		<li>Aby zapisać przefiltrowane dane optyczne jako plik tekstowy do dalszej analizy na naukowej platformie obliczeniowej, najpierw zaznacz pole "Filtr TP" tuż pod ekranem "Strona" w oprogramowaniu do obrazowania. Następnie wybierz "Zapisz stronę jako ASCII" z zakładki "Wyjście" i wprowadź żądaną nazwę pliku w wyświetlonym oknie dialogowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Principles+for+Next-Generation+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).</li>
<li>Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+from+the+bottleneck%3A+benefits+of+the+comparative+approach+to+modern+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience.</a> Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).</li>
<li>Bolker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms%3A+There%27s+more+to+life+than+rats+and+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Model organisms: There's more to life than rats and flies.</a> Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+matters%3A+the+importance+of+comparative+studies+and+the+potential+for+synergy+between+neuroscience+and+evolutionary+biology%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology.</a> JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).</li>
<li>Chase, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChase%2C+R+%22Behavior+and+its+neural+control+in+gastropod+molluscs%22">Behavior and its neural control in gastropod molluscs</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+activity+in+an+invertebrate+central+nervous+system%3A+simultaneous+monitoring+of+several+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).</li>
<li>Frost, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Spiking+Activity+of+Many+Individual+Neurons+in+Invertebrate+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).</li>
<li>Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereo-compound+hybrid+microscope+for+combined+intracellular+and+optical+recording+of+invertebrate+neural+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).</li>
<li>Frost, W. N., Wu, J. -Y. Voltage-sensitive dye imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrost%2C+WN+%22Basic+Electrophysiological+Methods%22">Basic Electrophysiological Methods</a>. Covey, E., Carter, M. , Oxford University Press. Oxford, UK. 169-195 (2015).</li>
<li>Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+at+the+neural+cocktail+party%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis at the neural cocktail party.</a> Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).</li>
<li>Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+independent+component+analysis+for+rapid+spike+sorting+of+optical+recording+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).</li>
<li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+deconstruction+reveals+the+dynamical+and+physical+building+blocks+of+a+locomotion+motor+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program.</a> Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).</li>
<li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spiral+attractor+network+drives+rhythmic+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">A spiral attractor network drives rhythmic locomotion.</a> ELife. 6, 27342(2017).</li>
<li>Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N. ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHill%2C+ES+%22Independent+Component+Analysis+for+Audio+and+Biosignal+Applications%22">Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications</a>. Naik, G. R. , InTech. London. 235-246 (2012).</li>
<li>Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+locomotion+in+Aplysia%3A+role+of+the+central+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+and+Neural+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia.</a> Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).</li>
<li>Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging+of+population+neuronal+activity+in+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).</li>
<li>Neveu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Configurations+of+Compression+and+Truncation+of+Neuronal+Activity+Underlie+l-DOPA-Induced+Selection+of+Motor+Patterns+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia.</a> eNeuro. 4 (5), 17(2017).</li>
<li>Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+neuronal+network+functional+connectivity+with+directed+information%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Inferring neuronal network functional connectivity with directed information.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+Formation+in+Tritonia+via+Recruitment+of+Variably+Committed+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons.</a> Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).</li>
<li>Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+populations+during+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal populations during decision-making.</a> Science. 307 (5711), 896-901 (2005).</li>
<li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).</li>
<li>Tomina, Y., Wagenaar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+double-sided+microscope+to+realize+whole-ganglion+imaging+of+membrane+potential+in+the+medicinal+leech%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech.</a> ELife. 6, 29839(2017).</li>
<li>Chang, P. Y., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+optimization+of+absorbance+and+fluorescence+signals+from+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).</li>
<li>Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+recording+of+patterns+of+electrical+activity+in+ensembles+of+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).</li>
<li>Katz, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+central+pattern+generators+and+rhythmic+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+London%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours.</a> Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057(2016).</li>
<li>Moroz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+Meets+Neuroscience%3A+From+the+Sequencing+Ship+%28Ship-Seq%29+to+Deciphering+Parallel+Evolution+of+Neural+Systems+in+Omic%27s+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era.</a> Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).</li>
<li>Frost, W. N., Tian, L. -M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+mechanism+for+prepulse+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cellular mechanism for prepulse inhibition.</a> Neuron. 40, 991-1001 (2003).</li>
<li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+neuronal+participation+in+stereotypic+motor+programs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variable neuronal participation in stereotypic motor programs.</a> PLoS One. 7 (7), 40579(2012).</li>
<li>London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+recording+of+activity+from+many+neurons+during+feeding+in+Navanax%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax.</a> Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).</li>
<li>Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+during+different+behaviors+in+Aplysia%3A+A+distributed+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization.</a> Science. 263 (5148), 820-823 (1994).</li>
<li>Marder, E. Searching for insight. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarder%2C+E+%22In+Invertebrate+Neurobiology%22">In Invertebrate Neurobiology</a>. North, G., Greenspan, R. J. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-18 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z najważniejszych szczegółów we wdrażaniu naszego podejścia do obrazowania VSD na dużą skalę jest minimalizacja wibracji, które powodują ruchy krawędzi kontrastu na diodach, co skutkuje dużymi sztucznymi sygnałami. Ponieważ absorbancja VSD wytwarza bardzo małe procentowe zmiany natężenia światła z potencjałami czynnościowymi, artefakty wibracyjne, jeśli nie zostaną zapobieżone, mogą przesłaniać interesujące sygnały neuronalne. Stosujemy kilka metod w celu zminimalizowania artefaktów drgań. Po pierwsze, na parterze znajduje się nasza pracownia obrazowania, która izoluje preparat od drgań związanych z budynkowymi urządzeniami wentylacyjnymi i wieloma innymi źródłami. Po drugie, zastosowano sprężynowy stół izolacyjny, który według innych użytkowników PDA zapewnia lepsze tłumienie drgań niż bardziej powszechny stół powietrzny16. Po trzecie, zastosowano obiektywy zanurzenia w wodzie, które eliminują fluktuacje obrazu wynikające z fal powierzchniowych. Po czwarte, obrazowany preparat został lekko wciśnięty między dno szkiełka nakrywkowego komory a fragment szkiełka nakrywkowego dociśnięty od góry, który jest utrzymywany na miejscu przez korki silikonowe lub wazelinę, co dodatkowo stabilizuje preparat. Powoduje to również spłaszczenie wypukłej powierzchni obrazowanego zwoju lub zwojów, co skutkuje większą liczbą neuronów w płaszczyźnie ostrości obiektywu, co zwiększa liczbę rejestrowanych neuronów.
Aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu dla bardzo małych zmian stopnia absorpcji światła VSD wynikających z potencjału czynnościowego, konieczne jest uzyskanie światła bliskiego nasyceniu przez przygotowanie do PDA, przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania barwnika. W tym celu zazwyczaj pracujemy przy napięciu 3-4 V spoczynkowego natężenia światła, mierzonego przełącznikiem wzmocnienia panelu sterowania PDA w pozycji 1x (wzmacniacze PDA 464 nasycają się przy 10 V światła). Podczas akwizycji danych ten współczynnik wzmocnienia jest zmieniany na 100x. Uzyskanie wystarczającej ilości światła do osiągnięcia 3-4 V mierzonego przez PDA można osiągnąć na kilka sposobów. Po pierwsze, użyj ultrajasnego źródła światła LED, które dostarcza długość fali odpowiednią do właściwości absorpcyjnych używanego barwnika absorpcyjnego. W związku z tym zastosowano lampę kolimowaną LED o długości fali 735 nm, która pokrywa się z optymalnymi długościami fal absorpcji RH155 i RH482. Po drugie, jeśli to konieczne, użyj kondensatora podstopniowego typu flip-top, który koncentruje światło ze źródła światła LED na mniejszym obszarze. Po trzecie, dostosuj wysokość kondensora, aby uzyskać oświetlenie Köhlera, które zapewnia wysoką, równomierną jasność i maksymalną jakość obrazu. Po czwarte, upewnij się, że w ścieżce optycznej nie ma filtrów termicznych, które mogą tłumić długość fali lampy LED 735 nm. Po piąte, usuń dyfuzory, jeśli potrzeba więcej światła, ze ścieżki optycznej. Po szóste, należy używać obiektywów o wysokiej rozdzielczości NA, które zapewniają wysoką rozdzielczość przestrzenną i pozwalają na dotarcie światła do PDA przy niższych natężeniach lampy. Pozwoliło nam to zminimalizować fotowybielanie do tego stopnia, że możemy uzyskać kilka plików akwizycyjnych o czasie trwania 10-20 minut na preparat przy użyciu tego samego natężenia światła we wszystkich plikach i bez znacznej utraty amplitudy sygnału lub konieczności ponownego barwienia. Co najważniejsze, jeśli eksperymentator chce śledzić neurony w tych dłuższych plikach, powinien upewnić się, że płaszczyzna ogniskowa się nie zmienia, a preparat się nie porusza. Wreszcie, dodatkowym sposobem na skierowanie wystarczającej ilości światła do PDA jest użycie młodszych zwierząt, które mają cieńsze, a tym samym mniej nieprzezroczyste zwoje.
Od czasu do czasu zauważamy, że stosunek sygnału do szumu sygnałów optycznych pogarsza się i/lub rytmy programów motorycznych są nieoptymalne (np. wolne lub nieprawidłowe). Kiedy zaczyna to zachodzić konsekwentnie, mieszamy świeże roztwory VSD. Podwielokrotności VSD zazwyczaj zachowują żywotność przez około 6 miesięcy w zamrażarce o temperaturze -20 °C. W związku z tym warto zauważyć, że w przypadku Berghii najlepsze wyniki uzyskano do tej pory przy użyciu absorbancji VSD RH482. Ponieważ RH482 jest bardziej lipofilowy niż RH155, może lepiej barwić stosunkowo mniejsze neurony Berghia lub skuteczniej pozostawać w błonach neuronalnych przy wyższej temperaturze zapisu soli stosowanej dla tego tropikalnego gatunku.
Jedno z ograniczeń obrazowania aktywności neuronalnej za pomocą PDA odnosi się do sprzężenia sygnałów napięciowych prądu przemiennego w sprzęcie przed 100-krotnym krokiem przedwzmacniacza: chociaż stanowi to niezbędną cechę do usunięcia dużego przesunięcia prądu stałego wytwarzanego przez wysoki poziom światła spoczynkowego wymagany przez tę technikę, sprzężenie prądu przemiennego nieodłącznie związane z PDA wyklucza pomiar powolnych zmian potencjału błony, takie jak te związane z wejściami synaptycznymi. Jeśli pożądane jest rejestrowanie powolnych lub ustalonych zmian potencjału, można wykorzystać system obrazowania kamery CMOS sprzężony z prądem stałym do uchwycenia aktywności podprogowej. Byrne i współpracownicy niedawno wykorzystali taką konfigurację z RH155 do zobrazowania aktywności neuronów w zwoju policzkowym Aplysia 17,18. Korzystaliśmy z obu systemów i stwierdziliśmy, że kamera CMOS, ze względu na znacznie większą gęstość detektorów (128 x 128), generuje 50x większe pliki danych dla tego samego czasu obrazowania7. Mniejsze pliki PDA ułatwiają szybsze przetwarzanie i analizę. Umożliwia to również rozszerzone nagrania pojedynczej próby (Rysunek 4) oraz badania uczenia się, w których dane z wielu prób są łączone w jeden duży plik przed sortowaniem skokowym, co pozwala na śledzenie organizacji sieci w miarę rozwoju uczeniasię19.
W innych badaniach opartych na kamerach, fluorescencyjne VSD zostały wykorzystane przez Kristana i współpracowników do zbadania funkcji sieci w zwojach segmentowych pijawki. W jednym z wpływowych badań doprowadziło to do zidentyfikowania neuronu zaangażowanego w decyzję zwierzęcia o pływaniu lub czołganiusię. W innym badaniu Kristan i in. zbadali, w jakim stopniu zachowania pijawki związane z pływaniem i pełzaniem są napędzane przezobwody wielofunkcyjne i dedykowane. Niedawno Wagenaar i jego współpracownicy użyli dwustronnego mikroskopu do obrazowania napięcia, który pozwala im rejestrować z prawie wszystkich neuronów w zwoju segmentowympijawki 22. W przeciwieństwie do wielu metod obrazowania opartych na kamerach, zaletą naszej metody obrazowania opartej na PDA jest szybkie i bezstronne sortowanie impulsów przez ICA, forma ślepej separacji źródeł, która nie wiąże się z podejmowaniem decyzji o granicach neuronów w celu przetwarzania wyników.
Jeśli chodzi o wybór VSD, jedną z zalet barwników absorpcyjnych RH155 i RH482 jest związana z nimi fototoksyczność23,24 lub niewielka lub zerowa 23,24, co umożliwia dłuższy czas rejestracji niż jest to typowe dla fluorescencyjnych VSD. Co więcej, stosowane przez nas VSD o dużej absorpcji doskonale nadają się do rejestrowania przekroczonych somatycznych potencjałów czynnościowych w preparatach ślimaków, które zwykle mają amplitudę 80 mV. Jak pokazano na rysunku 3G, nasza metoda optyczna może rejestrować niedoregulowania potencjału czynnościowego (żadne z naszych zapisów nie jest uśrednione śladowo): sugeruje to, że używane przez nas VSD powinny być w stanie dostrzec potencjały czynnościowe w innych układach modelowych, które tłumią się do pewnego stopnia, a zatem nie są przekroczone, zanim dotrą do somy. Niemniej jednak nasze podejście optyczne może nie być idealne dla gatunków, o których wiadomo, że wykazują wysoce osłabione potencjały czynnościowe po zarejestrowaniu w somie.
Wiele obecnych badań nad sieciami neuronowymi koncentruje się na niewielkiej liczbie zaprojektowanych gatunków transgenicznych. Jednak neuronauka czerpie korzyści z badania szerokiej gamy filogenetycznie odrębnych gatunków. Badanie wielu różnych gatunków dostarcza informacji na temat ewolucji obwodów25,26 i rzuca światło na zasady funkcjonowania sieci, które mogą być wspólne dla typów 1,2,3,4,27. Do tej pory zastosowaliśmy naszą metodę obrazowania do wielu gatunków ślimaków, w tym Aplysia californica 8,11,12,13,14,28, Tritonia diomedea 8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, Pleurobranchaea californica (dane niepublikowane), a ostatnio Berghia stephanieae (ryc. 5). Zaletą tego podejścia jest to, że można je łatwo zastosować do wielu gatunków, bez potrzeby stosowania zwierząt transgenicznych. Pragniemy potwierdzić, że nasze zastosowanie obrazowania VSD z barwnikami o szybkiej absorpcji i PDA podąża śladami pionierskich prac, które osiągnęły to w częściowo nienaruszonych, zachowujących się preparatach Navanax29 i Aplysia30. Nasz nacisk na szybkość naszego podejścia jest po części odpowiedzią na obawy, że wielu badaczy może być coraz bardziej niechętnych do rozpoczynania badań sieciowych na nowych gatunkach z powodu obaw, że konieczne będą lata badań, aby scharakteryzować podstawową organizację sieci, zanim będą mogli zgłębić pytania naukowe o szerokim znaczeniu dla neuronauki.. W związku z tym naszym celem jest zademonstrowanie techniki, która znacznie przyspiesza ten proces – do tego stopnia, że można uzyskać znaczące informacje na temat organizacji sieci tego samego dnia z pojedynczych preparatów.

Rozwój transgenicznych linii bezkręgowców, takich jak Drosophila i C. elegans, dostarczył potężnych systemów, w których neuronalne podstawy zachowania mogą być optycznie badane i manipulowane. Jednak te specjalne preparaty mogą mieć tę wadę, że zmniejszają entuzjazm dla badań nad obwodami neuronalnymi gatunków nietransgenicznych, szczególnie w odniesieniu do wprowadzania nowych gatunków do badań neurobiologicznych. Skupianie się wyłącznie na jednym lub dwóch systemach modelowych jest szkodliwe dla poszukiwania ogólnych zasad działania sieci, ponieważ badania porównawcze stanowią istotną drogę, dzięki której takie zasady są odkrywane1,2,3,4. Naszym celem jest zademonstrowanie podejścia do obrazowania na dużą skalę w celu uzyskania szybkiego wglądu w strukturę funkcjonalną sieci neuronowych ślimaków, w celu ułatwienia badań porównawczych funkcji sieci neuronowych. 
Ślimaki, takie jak Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea i inne, od dawna są wykorzystywane do badania zasad funkcjonowania sieci neuronowych, głównie dlatego, że ich zachowania są zapośredniczone przez duże, często indywidualnie identyfikowalne neurony znajdujące się na powierzchni zwojów, co czyni je łatwo dostępnymi dla technik nagrywania5. W latach siedemdziesiątych XX wieku opracowano barwniki wrażliwe na napięcie (VSD), które mogą integrować się z błoną plazmatyczną, co wkrótce umożliwiło pierwsze bezelektrodowe zapisy potencjałów czynnościowych generowanych przez wiele neuronów6. Tutaj pokazujemy nasze zastosowanie VSD do badania aktywności sieciowej u kilku gatunków ślimaków, w tym jednego nowego w neurobiologii, Berghia stephanieae. Urządzenie do obrazowania to dostępny na rynku 464-elementowy układ fotodiod (PDA), który próbkuje z prędkością 1600 klatek na sekundę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), która, gdy jest używana z VSD o dużej absorbancji, ujawnia potencjały czynnościowe wszystkich zarejestrowanych neuronów7. Sygnały zarejestrowane przez wszystkie diody są wyświetlane natychmiast po akwizycji i nakładane na obraz zwoju w oprogramowaniu do akwizycji PDA, co umożliwia badanie interesujących neuronów za pomocą ostrych elektrod w tym samym preparacie8,9. 
W surowych danych PDA, wiele diod redundantnie rejestruje większe neurony, a wiele z nich zawiera również mieszane sygnały z wielu neuronów. Punktem zwrotnym było opracowanie zautomatyzowanej metody sortowania impulsów wykorzystującej niezależną analizę komponentów do szybkiego przetwarzania każdego surowego 464-kanałowego zestawu danych PDA na nowy zestaw śladów, w którym każdy zarejestrowany neuron pojawia się w osobnym śladzie zawierającym tylko jego potencjały czynnościowe10,11. 
W tym artykule opisujemy podstawowe kroki związane z uzyskaniem dużych zapisów potencjału czynnościowego z układów nerwowych ślimaków za pomocą układu fotodiodowego i szybkich absorbancji VSD. Ponadto ilustrujemy metody analityczne, które mogą być wykorzystane do grupowania i mapowania optycznie zarejestrowanych neuronów w odniesieniu do ich funkcjonalnych zespołów, oraz do charakteryzowania cech na poziomie populacji, które często nie są widoczne poprzez prostą inspekcję Ślady wypalania 12,13.

<table><tbody><tr><td>Achromatyczny skraplacz wahadłowy 0,9 NA</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bipolarny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100 z SC-20</td><td>Kontroluje temperaturę soli perfuzyjnej Termometr</td></tr><tr><td>komorowy</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12 z mikrosondą IT-18 Aparat</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy</td><td>Optronics</td><td>S97808</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>American Diagnostic Corp.</td><td>ADC-3410Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop obrazowy</td><td>Olympus</td><td>BX51WIF</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowa komora perfuzyjna</td><td>Siskiyou</td><td>PC-H</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS6-25</td><td>Wytwarza jednorazowo 25 galonów</td></tr><tr><td>Stymulator impulsów Master-8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodozownik</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-752</td><td>Aplikator barwnika do barwienia ciśnieniowego</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji</td><td>Moria</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minutien (0,1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9677548</td><td>Do pozycjonowania i stabilizacji CNS</td></tr><tr><td>Zmotoryzowana platforma mikroskopowa</td><td>Thorlabs</td><td>GHB-BX</td><td>Gibraltar</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>NeuroPlex RedShirtImaging</td><td>NeuroPlex</td><td>Kompatybilny z matrycą fotodiod WuTech</td></tr><tr><td>Soczewki obiektywowe</td><td>Olympus</td><td>XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe PE-100 VWR</td><td></td><td>63018-726</td><td>Rurki do wytwarzania elektrod ssących</td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Instech</td><td>P720 z zestawem</td> <td>rurek DBS062SDBSU</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Equate</td><td>NDC 49035-038-54</td><td></td></tr><tr><td>Matryca fotodiod z panelem sterowania</td><td>WuTech Instruments</td><td>469-IV tablica fotodiod</td><td>Skontaktuj się z jianwu2nd@gmail.com w celu zamówienia</td></tr><tr><td>informacji RH155</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-499432</td><td>Barwnik wrażliwy na napięcie</td></tr><tr><td>RH482</td><td>Univ of Conn. Health Center</td><td>JPW-1132</td><td>Barwnik wrażliwy na napięcie; specjalne zamówienie od Leslie Leow</td></tr><tr><td>Silikonowe zatyczki do uszu</td><td>Mack's</td><td>Model 7</td><td>Do użycia do przygotowania kompresji</td></tr><tr><td>Barwienie rurek PE VWR</td><td></td><td>63018-xxx</td><td>Różne rozmiary w zależności od dopasowania</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184 Zestaw</td><td></td><td>elastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Thorlabs LED i sterownik</td><td>Thorlabs</td><td>M735L2-C1, DC2100</td><td>Lampa LED i sterownik Rurka</td></tr><tr><td>Tygon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-xxx</td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Kinetic Systems</td><td>MK26</td><td>Na bazie sprężyny</td></tr></tbody></table>

obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Rozwój preparatów dla transgenicznych bezkręgowców, w których aktywność określonych zestawów neuronów może być rejestrowana i manipulowana za pomocą światła, stanowi rewolucyjny postęp w badaniach nad neuronalnymi podstawami zachowania. Jednak wadą tego rozwoju jest tendencja do skupiania badaczy na bardzo małej liczbie organizmów "zaprojektowanych" (np. C. elegans i Drosophila), co potencjalnie negatywnie wpływa na prowadzenie badań porównawczych wśród wielu gatunków, co jest potrzebne do określenia ogólnych zasad funkcjonowania sieci. Niniejszy artykuł ilustruje, w jaki sposób zapis optyczny z barwnikami wrażliwymi na napięcie w mózgach nietransgenicznych gatunków ślimaków może być wykorzystany do szybkiego (tj. w trakcie trwania pojedynczych eksperymentów) ujawnienia cech funkcjonalnej organizacji ich sieci neuronowych z rozdzielczością pojedynczej komórki. Szczegółowo opisujemy metody preparacji, barwienia i rejestrowania stosowane przez nasze laboratorium w celu uzyskania śladów potencjału czynnościowego od dziesiątek do ~ 150 neuronów podczas behawioralnie istotnych programów motorycznych w OUN wielu gatunków ślimaków, w tym jednego nowego w neurobiologii – ślimaka nagoskrzelnego Berghia stephanieae. Obrazowanie odbywa się za pomocą barwników wrażliwych na napięcie absorpcyjne i 464-elementowego układu fotodiod, który próbkuje z prędkością 1600 klatek na sekundę, wystarczająco szybko, aby uchwycić wszystkie potencjały czynnościowe generowane przez zarejestrowane neurony. Na jeden preparat można uzyskać wiele kilkuminutowych nagrań z niewielkim lub zerowym wybielaniem sygnału lub fototoksycznością. Surowe dane optyczne zebrane za pomocą opisanych metod mogą być następnie analizowane za pomocą różnych ilustrowanych metod. Nasze podejście do rejestracji optycznej może być z łatwością wykorzystane do badania aktywności sieci u różnych gatunków nietransgenicznych, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań porównawczych nad tym, jak mózg generuje zachowanie.

Tritonia 
Kontakt skóry z drapieżną rozgwiazdą wywołuje Tritonia diomedea pływanie ucieczkowe, polegające na rytmicznej serii zgięć całego ciała, które odpychają zwierzę w bezpieczne miejsce (Rycina 3A). W izolowanych preparatach mózgu krótki bodziec podany do nerwu pedalnego 3 (PdN3) wywołuje rytmiczny program motoryczny pływania (SMP) odpowiadający za to zachowanie, który jest łatwo rozpoznawalny w rejestracjach optycznych z zwojów pedalnych. Rysunek 3B przedstawia schemat eksperymentu obrazowania VSD, zaprojektowanego w celu zapisu aktywności wyładowań neuronów na powierzchni grzbietowej lewej Tritonia zwoj pedałowy, nad którym umieszczono PDA, ponieważ stymulacja przeciwległego (prawego) PdN3 wywołuje SMP. Surowe i przefiltrowane dane (pasmowy filtr Butterwortha, częstotliwości odcięcia 5 i 100 Hz) z 20 diod rejestrujących aktywność przed, w trakcie i po stymulacji PdN3 przedstawiono w Ryciny 3C,D odpowiednio. Stymulację nerwu zastosowano w 20. sekundzie 2-minutowego pliku. Bezpośrednio po akwizycji sygnały zmierzone przez wszystkie 464 diody macierzy rejestrującej mogą zostać wyświetlone topograficznie na obrazie preparatu w oprogramowaniu do obrazowania (Rysunek 3E). Na tym etapie wiele zapisów zawiera impulsy zarejestrowane redundancją z tych samych neuronów, a niektóre zapisy zawierają impulsy pochodzące z więcej niż jednego neuronu. Sortowanie impulsów (spike sorting) przefiltrowanych zapisów z diod za pomocą ICA pozwoliło na wyodrębnienie 53 unikalnych zapisów neuronalnych, z których 30 przedstawiono w Rycina 3FKinetykę poszczególnych impulsów (spike'ów) można ocenić w Rycina 3G, co stanowi rozszerzenie fragmentu czterech śladów z Rycina 3F (czerwona ramka); dokładność algorytmu sortowania impulsów ICA została wcześniej zweryfikowana za pomocą jednoczesnych rejestracji elektrodami ostrymi, które wykazały, że wszystkie impulsy w posortowanych śladach odpowiadają impulsom rejestrowanym wewnątrzkomórkowo z poszczególnych neuronów11,14.
Aplysia 
Silny bodziec awersyjny przyłożony do ogona Aplysia californica wywołuje stereotypową, dwuczęściową rytmiczną reakcję ucieczki15. Pierwsza faza reakcji to galop składający się z kilku cykli wyrzutów głowy i przyciągnięć ogona, które szybko przemieszczają zwierzę do przodu. Zazwyczaj następuje po nim okres pełzania, obejmujący powtarzające się fale skurczów mięśni od głowy do ogona, które napędzają zwierzę do przodu z mniejszą prędkością przez kilka minut (Rysunek 4A). Aby zarejestrować te motoryczne programy ucieczki za pomocą pomiarów optycznych, PDA skupiono na powierzchni grzbietowej prawego zwoju stopowego w izolowanym preparacie mózgu, a elektrodę ssącą umieszczono na przeciwległym (lewym) nerwie stopowym 9 (PdN9; Rysunek 4B). W pierwszej minucie ciągłego 20-minutowego zapisu optycznego (Rysunek 4C), PdN9 został stymulowany w celu wywołania sekwencji programów motorycznych galopu i pełzania. Probabilistyczne gaussowskie rozkłady przestrzenne sygnałów ze wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów naniesiono na zwój (Rysunek 4D). Redukcja wymiarowości zastosowana do pełnego zapisu wykazała, że fazy galopu (cyjan) i pełzania (ciemnoniebieski) programu ucieczki zajmowały odrębne obszary i tworzyły różne trajektorie, odpowiednio w formie spirali i pętli, w przestrzeni głównych składowych (Rysunek 4E).
Trzy filmy oparte na rejestracji Aplysia przedstawionej na Rysunku 4 demonstrują kolejne rodzaje analiz, jakie można przeprowadzić na takich zestawach danych. Film 1 animuje wyładowania wszystkich zarejestrowanych neuronów przez cały czas trwania pomiaru. Początkowy okres po stymulacji w programie motorycznym ucieczki charakteryzował się galopem, w którym aktywność w zwoju objawiała się naprzemiennymi seriami wyładowań różnych klastrów funkcjonalnych (Film 2). Galop przeszedł następnie w pełzanie, podczas którego aktywność w klastrach neuronalnych pozostała w dużym stopniu fazowa, ale przyjęła przeciwnie do ruchu wskazówek zegara trajektorię rotacyjną w zwoju (Film 3). Dwa ostatnie filmy zawierają również grupowanie konsensusowe, które ujawnia wyładowania i lokalizacje różnych zespołów funkcjonalnych oddzielnie dla faz galopu i pełzania w reakcji ucieczki. Należy zauważyć, że wiele neuronów przypisanych do tego samego klastra zarówno w fazie galopu, jak i pełzania, wykazywało bliskość fizyczną w zwoju, co jest zgodne z wcześniejszymi odkryciami12.
Berghia 
Aeolidyczny ślimak nagoskrzelny Berghia stephanieae (Ryc. 5A) stanowi nowy system modelowy dla neuronauki. Układ obrazowania dla typowego eksperymentu z użyciem Berghia przedstawiono na Ryc. 5B. Aby wywołać szerokozakresową aktywność neuronalną, elektrodę ssącą umieszczono na najbardziej wyraźnym lewym nerwie stopy, a stymulację nerwu podano w 30. sekundzie 2-minutowego zapisu. Ślady przetworzone za pomocą ICA ujawniły aktywność zarówno spontaniczną, jak i wywołaną stymulacją w 55 neuronach (Ryc. 5C). Detekcja wspólnot poprzez klastrowanie konsensusowe pozwoliła zidentyfikować dziesięć odrębnych zespołów funkcjonalnych, które przedstawiono na Ryc. 5D w formie grafu sieci oraz na Ryc. 5E, gdzie ślady pokazane na Ryc. 5C zostały zreorganizowane na podstawie przypisanych im klastrów. Rozkłady Gaussa sygnałów ze wszystkich rejestrowanych neuronów naniesiono na obraz preparatu na Ryc. 5F, aby wskazać położenie wszystkich 55 zarejestrowanych neuronów.
<img alt="Układ mikroskopu i macierz fotodiod do spektroskopii optycznej; obejmuje kamerę parafokalną i światłowody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Widoki układu obrazowania optycznego i macierzy fotodiod (PDA). (A) Układ obrazowania optycznego, zawierający PDA, kamerę cyfrową, mikroskop i stolik. (B) Wewnętrzna konstrukcja PDA, w której światłowody łączą aperturę obrazowania z 464 fotodiodami. Nad fotodiodami znajduje się rząd wzmacniaczy. (C) Sześciokątna powierzchnia apertury obrazowania, na którą ogniskowany jest obrazowany obszar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces preparowania do obrazowania sygnału wizualnego; schemat obrazowania VSD; kroki obejmują konfigurację i analizę obliczeniową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący podstawowy przebieg prac w celu uzyskania zapisów optycznych. Na tym schemacie przedstawiono kluczowe etapy protokołu obrazowania VSD, od preparowania i barwienia, aż po szczegóły obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rejestracja bodźców neuronalnych, schemat rozmieszczenia elektrod i wykresy odpowiedzi neuronalnych dla analizy sensorycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyniki uzyskane z Tritonia diomedea, ilustrujące surowe, przefiltrowane i posortowane dane impulsowe (spike-sorted). (A) Tritonia uciekająca przed drapieżną rozgwiazdą Pycnopodia helianthoides poprzez pływanie, które polega na naprzemiennych zgięciach grzbietowych i brzusznych ciała. (B) Schemat układu obrazowania. Ce=płat mózgowy zwoju mózgowo-pleuralnego; Pl = płat pleuralny zwoju mózgowo-pleuralnego; Pd = zwój pedalny. (C) Surowe dane z 20 fotodiod, wykazujące aktywność w lewym zwoju pedalnym w odpowiedzi na stymulację przeciwległego PdN3 (bodziec zaznaczony strzałką). (D) Dane przefiltrowane z tych samych diod co w C (pasmowy filtr Butterwortha 5 i 100 Hz). (E) Wynik z oprogramowania obrazującego, w którym skompresowane ślady zebrane przez wszystkie 464 diody są nałożone topograficznie na obraz preparatu. Pozycje 20 diod, których ślady pokazano w C i D , są zaznaczone na czerwono. (F) Trzydzieści wybranych śladów pojedynczych neuronów wygenerowanych poprzez sortowanie impulsów za pomocą ICA. (G) Powiększony widok czterech śladów pojedynczych neuronów, odpowiadający czerwonej ramce w F, przedstawiający ich potencjały czynnościowe przy wyższej rozdzielczości czasowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza lokomocji ślimaka; schemat rejestracji elektrofizjologicznej; wykres aktywności neuronalnej i wykres PCA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki uzyskane u Aplysia californica, ilustrujące długotrwałą rejestrację, mapowanie sygnałów oraz redukcję wymiarowości. (A) Dwie fazy sekwencyjnego programu motorycznego ucieczki Aplysia: galop oraz pełzanie. (B) Schemat układu obrazowania. Ce = zwoje mózgowe; Pl = zwoje pleuralne; Pd = zwoje pedalne. (C) 20-minutowa rejestracja 81 neuronów w prawym zwoju pedalnym reagujących na bodziec podany do kontralateralnego PdN9 (wskazany strzałką). Zielone, cyjanowe i ciemnoniebieskie paski poniżej śladów wskazują odpowiednio okres przedbodźcowy, fazę galopu oraz fazę pełzania programu motorycznego ucieczki. (D) Obraz preparatu z zamapowanymi probabilistycznymi rozkładami Gaussa lokalizacji wszystkich 81 źródeł sygnałów neuronalnych zidentyfikowanych za pomocą ICA. Zielona obramowanie reprezentuje pozycję sześciokątnej powierzchni PDA względem zwoju. Numery przy każdym rozkładzie Gaussa odpowiadają numerom śladów w części C. (E) Redukcja wymiarowości przy użyciu analizy głównych składowych (PCA), przedstawiająca trzy pierwsze główne składowe względem siebie w trakcie 20-minutowego pliku. Linia bazowa przedbodźcowa, epoki galopu i pełzania są przedstawione odpowiednio w kolorze zielonym, cyjanowym i ciemnoniebieskim. Animacje wyładowań neuronalnych odpowiadające tej rejestracji znajdują się w Filmach 1-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza sieci neuronowej, schemat łączności, elektrofizjologia, odpowiedź na bodziec, dane nerwowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wyniki uzyskane dla Berghia stephanieae, nowego gatunku dla neuronauki, ilustrujące grafowanie sieci, klastrowanie funkcjonalne oraz bilateralne mapowanie sygnałów. (A) Okaz Berghia. (B) Schemat układu obrazowania. Ce = płat mózgowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pl = płat opłucnowy zwoju mózgowo-opłucnowego; Pd = zwój stopowy; Rh = zwój rinofora. (C) Ślady obrazujące spontaniczną i wywołaną bodźcem aktywność 55 bilateralnych neuronów w zwojach mózgowo-opłucnowych (podanie bodźca zaznaczono strzałką). (D) Graf sieci przedstawiający dziesięć zespołów funkcjonalnych, z których każdy został oznaczony unikalnym kolorem, zidentyfikowanych za pomocą klastrowania konsensusowego. Węzły na tym wykresie reprezentują neurony, gdzie odległość w przestrzeni sieci reprezentuje stopień korelacji wyładowań wewnątrz i pomiędzy zespołami. (E) Ślady z części C zostały przeorganizowane i zakodowane kolorystycznie (zgodnie ze schematem kolorów z części D) w zespoły funkcjonalne. (F) Obraz preparatu pokazujący zmapowane lokalizacje sygnałów z każdego zarejestrowanego neuronu oraz odpowiadające im numery śladów w częściach C i E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Animacja pełnego, 20-minutowego programu lokomocyjnego ucieczki Aplysia. Przezroczystość białych kształtów nakładających się na 81 pojedynczych neuronów w prawym zwoju stopowym (panel lewy) była sterowana przez odpowiadające im ślady neuronalne (panel prawy) i zmieniała się liniowo w funkcji średniej częstotliwości impulsów (zgrupowanych co 0,61 s czasu rzeczywistego w rejestracji). Dla każdego neuronu pełna nieprzezroczystość została znormalizowana do jego maksymalnej częstotliwości wyładowań w czasie trwania rejestracji. Jedna sekunda czasu w wideo odpowiada 12,2 s czasu rzeczywistego. Pasek skali odpowiada czasowi rzeczywistemu, przy czym zielone, cyjanowe i ciemnoniebieskie linie pod śladami wskazują odpowiednio fazę bazową przed stymulacją, fazę galopu oraz fazę pełzania programu lokomocyjnego ucieczki. Żółte ramki wokół fazy galopu i części fazy pełzania wskazują fragmenty rejestracji użyte do wygenerowania animacji w Wideo 2 i 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video1(Full)_reduced.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
Wideo 2: Animacja fazy galopu programu lokomocyjnego ucieczki Aplysia. W celu wyznaczenia zespołów funkcjonalnych przeprowadzono klasteryzację konsensusową wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów wyłącznie w fazie galopu programu motorycznego, stosując metodę i oprogramowanie opisane i udostępnione w ref.12. Z filmu pominięto zespoły neuronalne wykazujące w tej fazie programu ucieczki w przeważającej mierze toniczne lub nieregularne wzorce wyładowań. Potencjały czynnościowe neuronów należących do zespołów czarnego i oliwkowo-zielonego są słyszalne w ścieżce dźwiękowej filmu, przy czym odpowiednie neurony i ślady są wyróżnione. Średnie częstotliwości impulsów zostały znormalizowane w taki sam sposób jak w Wideo 1 i przy zastosowaniu analogicznego podziału czasu; 1 s czasu upływającego w filmie odpowiada 6,1 s czasu rzeczywistego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video2(Gallop).mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
Wideo 3: Animacja fazy pełzania programu lokomocyjnego ucieczki Aplysia. W celu wyłonienia zespołów funkcjonalnych przeprowadzono klastrowanie konsensusowe wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów wyłącznie w fazie pełzania programu motorycznego. Z niniejszego filmu pominięto zespoły wykazujące w tej fazie programu motorycznego głównie toniczne lub nieregularne wzorce wyładowań. Średnie częstotliwości impulsowania zostały znormalizowane analogicznie jak w Wideo 1 i Wideo 2 przy zastosowaniu równoważnego podziału czasu na przedziały; 1 s czasu upływającego w filmie odpowiada około 12,2 s czasu rzeczywistego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video3(Crawl)_reduced.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis tego, jak używać matrycy fotodiod i barwników wrażliwych na napięcie do jednoczesnego rejestrowania potencjałów czynnościowych z dużej liczby neuronów. W porównaniu z obrazowaniem aktywności neuronalnej wapniem, które jest pośrednie, barwniki wrażliwe na napięcie, których używamy, rejestrują potencjały czynnościowe bezpośrednio podobne do zapisów ostrych elektrod, ale w wielu neuronach jednocześnie. Nasz proces obrazowania optycznego można dostosować do szybkiej wizualizacji aktywności sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu i potencjału czynnościowego w różnych nietransgenicznych systemach bezkręgowców, a nawet kręgowców.Dodatkowo procedury w naszym protokole zademonstruje Evan Hill z mojego laboratorium. Zacznij od znieczulenia 40-gramowego zwierzęcia Aplysia californica i przygwożdżenia go brzuszną stroną do góry w woskowanym naczyniu rozwarstwiającym. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe nacięcie w linii środkowej wzdłuż najbardziej przedniej części stopy i przypnij płaty stopy po obu stronach nacięcia, aby odsłonić część ośrodkowego układu nerwowego i masę policzkową.Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie wypreparować masę policzkową, odsłaniając zwoje mózgowe, i przeciąć nerwy unerwiające ciało zwierzęcia, aby wyciąć ośrodkowy układ nerwowy, pozostawiając długi odcinek nerwu do stymulacji. Za pomocą drobiazgowych szpilek umieść ośrodkowy układ nerwowy w naczyniu wyłożonym elastomerem wypełnionym solą fizjologiczną i przelej naczynie solą fizjologiczną przepuszczoną przez urządzenie chłodzące Peltiera, aby utrzymać temperaturę przygotowania na poziomie od 15 do 16 stopni Celsjusza. Użyj kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej z nerwów i wypreparuj powierzchowną część osłonki na zwoju lub zwojach, które mają być zobrazowane.Następnie zanurz oczyszczony ośrodkowy układ nerwowy w roztworze 0,5% aldehydu glutarowego w soli fizjologicznej na 20 sekund, zanim skierujesz ośrodkowy układ nerwowy z powrotem do naczynia wyłożonego elastomerem perfuzji soli fizjologicznej, aby spłukać nadmiar aldehydu glutarowego. Aby przygotować roztwór roboczy barwnika wrażliwego na napięcie, dodaj 500 mikrolitrów soli fizjologicznej do wcześniej przygotowanej stałej podwielokrotności wilgotności względnej 155, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 0,3 miligrama na mililitr. I użyj ręcznego mikrodozownika, aby załadować 200 mikrolitrów roztworu do kawałka rurki polietylenowej o średnicy podobnej do średnicy ganglionu, który ma być zabarwiony.Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie umieść koniec rurki nad docelowym ganglionem, opuszczając rurkę, aż utworzy szczelne uszczelnienie nad ganglionem. Obracaj pokrętłem aplikatora mikrodozownika co pięć minut przez godzinę, aby wcisnąć więcej barwnika na ganglion, sprawdzając próbkę po 30 minutach, aby potwierdzić, że występuje odpowiednie barwienie. Po barwieniu, utrzymując przyciemnione światła, należy umieścić odpowiedni materiał buforowy po lewej i prawej stronie miejsca, w którym preparat zostanie umieszczony w komorze obrazowania zawierającej sól fizjologiczną, a następnie zanurzyć w komorze ośrodkowy układ nerwowy.Dociśnij kawałek szkiełka nakrywkowego o odpowiedniej wielkości do tkanki i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć tkankę bez uszkadzania neuronów. Następnie umieść komorę obrazowania pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli stymulujesz nerw do wywołania fikcyjnego programu motorycznego, ostrożnie stopij segment rurki polietylenowej PE100 nad płomieniem, delikatnie pociągając oba końce segmentu rurki i odetnij powstały stożek w żądanym punkcie.Następnie przymocuj odcinek grubościennej elastycznej rurki polimerowej do tylnego końca polietylenowej elektrody ssącej. Następnie użyj sekcji ustnej, aby wytworzyć podciśnienie i wciągnij niewielką objętość soli fizjologicznej przez stożkowy koniec elektrody ssącej. Narysuj koniec nerwu, który ma być stymulowany, do elektrody pod mikroskopem i upewnij się, że sól fizjologiczna w elektrodzie nie ma pęcherzyków, które mogłyby przerwać przewodzenie elektryczne.W celu zobrazowania ganglionu należy przenieść komorę do stanowiska do obrazowania i zainicjować perfuzję soli fizjologicznej przez komorę rejestracyjną. Umieść sondę temperatury w pobliżu preparatu i ustaw temperaturę odpowiednią dla obrazowanego gatunku. Umieść jeden drut chlorkowanego srebra w dół elektrody ssącej, upewniając się, że styka się z solą fizjologiczną w elektrodzie i umieść drut z chlorkiem srebra w soli fizjologicznej w kąpieli w pobliżu elektrody ssącej.Opuść soczewkę zanurzeniową w wodzie do soli fizjologicznej i zamknij membranę podstawową. Podnieś lub opuść kondensator podstopniowy i wyreguluj ostrość, aż krawędzie membrany będą ostre, tworząc oświetlenie Kohlera. Skoncentruj się na obszarze preparatu, który ma być obrazowany, i uzyskaj obraz interesującego ganglionu za pomocą parafokalnej kamery cyfrowej.Ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 1X i kliknij przycisk natężenia światła spoczynkowego, aby sprawdzić średnie natężenie światła spoczynkowego diod. Dostosuj poziom napięcia przesyłanego ze stymulatora do zasilania lampy LED i kontynuuj sprawdzanie średniego poziomu natężenia światła spoczynkowego, aż znajdzie się w żądanym zakresie. Następnie ustaw przełącznik wzmocnienia panelu sterowania w pozycji 100X do nagrywania i dokładnie sprawdź, czy stół sprężynowy lub powietrzny unosi się.Gdy kontrolki są nadal przyciemnione, ustaw czas trwania pliku, ścieżkę i nazwę w oprogramowaniu do obrazowania, a następnie kliknij przycisk Pobierz dane, aby pobrać pliki do pojemności dostępnej pamięci RAM komputera. Uważaj, aby pozostać nieruchomo podczas nagrywania, ponieważ małe wibracje mogą wprowadzać duże artefakty do danych zapisu optycznego. Aby wyświetlić dane natychmiast po akwizycji, użyj funkcji nałożenia, aby nałożyć dane zebrane przez wszystkie 464 diody na obraz ganglionu i kliknij dowolną diodę reprezentowaną w oprogramowaniu, aby rozwinąć zarejestrowane dane na osobnym ekranie śledzenia.Aby uzyskać dokładne wyrównanie diod w stosunku do preparatu, wprowadź współczynniki X, Y i powiększenia, zgodnie z testem otworkowym. Aby zmaksymalizować widoczność potencjału czynnościowego i poprawić wydajność neuronów do późniejszego sortowania impulsów, nałóż pasmowo-przepustowy filtr Butterwortha z pięcioma i 100 hercami, aby usunąć zarówno szum o niskiej, jak i wysokiej częstotliwości. Aby zapisać przefiltrowane dane optyczne jako plik tekstowy do późniejszej analizy, na ekranie strony zaznacz pole Filtr TP.Na karcie danych wyjściowych wybierz opcję zapisz stronę jako ASCII. Następnie wprowadź odpowiednią nazwę pliku w wyświetlonym oknie dialogowym. Kontakt skóry z morskim drapieżnikiem uruchamia ucieczkowe pływanie Tritonia diomedia, składające się z rytmicznej serii zgięć całego ciała, które popychają go w bezpieczne miejsce.Na tym rysunku pokazano surowe i przefiltrowane dane z 20 diod rejestrujących aktywność przed, w trakcie i po stymulacji nerwu pedału trzy. Bezpośrednio po akwizycji, sygnały zmierzone przez wszystkie 464 diody matrycy rejestrującej mogą być topograficznie wyświetlone na obrazie preparatu w oprogramowaniu do obrazowania. W tej analizie kolce sortujące przefiltrowane ślady diody za pomocą niezależnej analizy komponentów (ICA) dały 53 unikalne ślady neuronalne, z których 30 pokazano tutaj.Silnie awersyjny bodziec ogonowy wobec Aplysia californica wywołuje powtarzające się fale dwuczęściowej rytmicznej reakcji ucieczki, składającej się z okresu galopu składającego się z kilku cykli wychyleń głowy i ciągnięć za ogon, które szybko przesuwają zwierzę do przodu, a następnie okresu pełzania. W tej reprezentatywnej analizie, po jednej minucie ciągłego 20-minutowego nagrania optycznego, nerw pedałowy dziewiąty został pobudzony do wywołania sekwencji programu motorycznego galopu-pełzania. Probabilistyczne rozkłady przestrzenne Gaussa sygnałów ze wszystkich 81 zarejestrowanych neuronów zostały zmapowane na zwoju.Redukcja wymiarowości zastosowana do pełnego nagrania ujawniła, że fazy galopu i czołgania się programu ucieczki zajmowały odrębne obszary i tworzą różne trajektorie w przestrzeni głównego komponentu. Podczas korzystania z tego protokołu ważne kwestie obejmują: optymalizację barwienia, minimalizację wibracji i kierowanie wystarczającej ilości światła przez preparat do PDA, przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotowybielania barwnika. Przykłady analiz po przejęciu, które ujawniły wgląd w sieć na poziomie populacji, obejmują wykrywanie zespołów funkcjonalnych poprzez grupowanie konsensusu w algorytmie uczenia się nienadzorowanego oraz redukcję wymiarowości przy użyciu analizy głównych składowych.Połączenie naszego systemu obrazowania opartego na matrycy fotodiodowej i zastosowania absorbentów barwników wrażliwych na napięcie umożliwia monitorowanie dynamicznej ewolucji sieci w dłuższym okresie czasu.

photodiode-based-optical-imaging-for-recording-network-dynamics-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób barwniki napięciowo-wrażliwe umożliwiają optyczną rejestrację aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych, takich jak sploty jelitowego układu nerwowego świnki morskiej, z regulowaną rozdzielczością obejmującą zakres od pojedynczych komórek po obwody wieloganglionarne.

Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z...

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak implementować i wykonywać zapisy fotometryczne z wieloma włóknami, jak korygować artefakty niezależne od wapnia, oraz ważne kwestie dotyczące obrazowania fotometrycznego dwukolorowego.

Fotometria wielowłóknowa do rejestrowania aktywności neuronalnej u swobodnie poruszających się zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obrazowania optycznego z fotodiodami do rejestrowania akcji potencjałów w sieciach neuronowych bezkręgowców. Technika ta umożliwia bezpośredni zapis aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczego neuronu.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Przeglądaj więcej filmów