Mechaniczna separacja i solubilizacja białek zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywiteliny z jaj kurzych

Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku pobierania próbek podwarstw błony perywitelinowej z jaj ptaków w celu dalszego badania ich fizjologicznej roli w rozrodzie ptaków. Pobieranie próbek z membrany peryvitelinowej zostało zoptymalizowane na każdym etapie, aby ograniczyć wszelkie uszkodzenia strukturalne i molekularne. Protokół został dalej opracowany pod kątem dogłębnej proteomiki.

Rozpocznij od pobrania próbki warstwy perywiteliny lub PL ze świeżo złożonej, niezapłodnionej komórki jajowej. Rozbij jajko i użyj separatora do jaj, aby oddzielić żółtko od białka. Usuń gradówkę małymi nożyczkami i rozwałkuj żółtko na bibule filtracyjnej, aby usunąć przylegającą albuminę, która wydaje się przezroczysta, ale widoczna struktura.

Zanurz żółtko w krystalizatorze zawierającym 10-milimolowy Tris HCL o pH ósmym, który został wcześniej schłodzony do czterech stopni Celsjusza i usuń obszar PL nad krążkiem rozrodczym w strefie jednego centymetra za pomocą nożyczek. Rozerwij PL małymi nożyczkami wewnątrz bufora, a następnie przytrzymaj dwie krawędzie pękniętego PL kleszczami i oderwij je od żółtka. Opłucz PL kilka razy w kąpielach o stężeniu 10 milimolowym Tris HCL, aż nie będzie widać śladu żółtka.

Upewnij się, że PL jest czysty, biały i pływający w buforze. Przetwarzaj PL w celu separacji podwarstw lub przejdź bezpośrednio do analiz biochemicznych. Aby oddzielić OPL i IPL, rozprowadź całą próbkę z OPL skierowanym do góry na plastikowej szalce Petriego wypełnionej 10-milimolowym Tris HCL i 50-milimolowym chlorkiem sodu i utrzymuj ją płasko z jak najmniejszą liczbą zmarszczek.

Określ lokalizację pozostałych chalazae, które są przyczepione tylko do OPL. Następnie pokrój całą PL na kawałki o długości około dwóch do trzech centymetrów małymi nożyczkami. Mechanicznie oddziel dwie warstwy za pomocą ultraprecyzyjnych kleszczyków z końcówką pod mikroskopem preparacyjnym.

Otrzymane próbki IPL i OPL należy przechowywać pojedynczo w mikroprobówkach w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Aby przeprowadzić pierwotną solubilizację białka, liofilizuj próbki IPL i OPL pojedynczo, aby usunąć pozostałą wodę, a następnie odetnij około jednego miligrama z każdej próbki i umieść ją w czystej mikroprobówce z szczelną nakrętką. Pozostałe próbki należy przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w celu przedłużonego przechowywania w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza.

Wymieszaj jeden miligram każdej liofilizowanej podwarstwy z 400 mikrolitrami 50 milimolowych Tris o pH siódmym i 500 milimolowym chlorku sodu. Użyj młynka miksującego dwa razy przez pięć minut przy 30 Hz, aby rozbić struktury na mikrocząstki i ułatwić solubilizację białek. Zbierz 400 mikrolitrów próbek do dwóch czystych mikroprobówek.

Aby przygotować próbki do elektroforezy, dodaj 5-krotny bufor próbek SDS-PAGE do każdej próbki o pojemności 400 mikrolitrów i podgrzej ją do 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załaduj maksymalnie 20 mikrogramów białek do każdego pasa żelu poliakrylamidowego SDS o gradiencie 4-20% i wykonaj elektroforezę przy napięciu 120 woltów. Po elektroforezie usuń żel ze szklanych płytek i zabarwij go roztworem Coomassie Brilliant Blue przez 30 minut, a następnie odbarwić roztworem składającym się z 50% wody, 40% etanolu i 10% kwasu octowego, aż tło żelu stanie się jasnoniebieskie.

Przenieś żel na szalkę Petriego zawierającą wodę dejonizowaną w celu odbarwienia i ponownego nawodnienia. Białka powinny pojawiać się jako niebieskie paski z przezroczystym tłem. PL poddano różnym w celu zidentyfikowania warunków pozwalających na minimalną utratę białka i optymalną separację podwarstw.

Pokazano tutaj białko uwalniane w różnych stężeniach Tris, pH i stężeniach chlorku sodu. Powstałe w ten sposób dwie podwarstwy obserwowano pod mikroskopem preparacyjnym. IPL jest półprzezroczysty, podczas gdy OPL jest gęsty, mętny i białawy.

Po rozdzieleniu, OPL i IPL zostały zliofilizowane niezależnie, a ich zawartość białka została całkowicie rozpuszczona przy użyciu kombinacji mielenia mechanicznego, anionowego detergentu, środka redukującego i gotowania. Próbki wykazywały wyraźne profile elektroforetyczne na żelu poliakrylamidowym. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że oddzielenie podwarstw jest krytycznym etapem procedury i musi być wykonane przy użyciu mikroskopu dwuokularowego w buforze zawierającym minimalne stężenie soli.

Aby dokładniej wyjaśnić ich odpowiednią funkcję fizjologiczną, próbki podwarstwy błony periwitelinowej mogą być analizowane w celu charakterystyki histologicznej za pomocą mikroskopii elektronicznej oraz do badań funkcjonalnych przy użyciu testów obrazowania i migracji komórek.