C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

- Do tej sekcji użyj dwóch mikropipet: jednej z otworem o szerokości mniej więcej tej samej szerokości co jajko i drugiej o dwukrotnie większej szerokości oraz szeregu roztworów zorganizowanych w studzienkach, aby ułatwić szybki transfer między nimi.

Po pierwsze, umieść dorosłe hermafrodyty w roztworze soli jaja, który jest osmotycznie zrównoważony, aby zapobiec pękaniu zarodków. Przetnij robaki na pół, aby uwolnić rozwijające się zarodki.

Następnie zidentyfikuj zarodki w stadium dwukomórkowym. Komórki te są blastomerami powstałymi w wyniku podziału zapłodnionej komórki jajowej. Użyj mikropipety z większym otworem, aby przenieść zarodek do roztworu podchlorynu, wybielacza, który zacznie rozkładać ochronną skorupkę jaja.

Już po 40 do 55 sekundach przenieś zarodek do pożywki wzrostu Sheltona lub SGM. Umyj krótko każdy zarodek w dwóch studzienkach SGM, aby usunąć wszelkie ślady wybielacza przed umieszczeniem go w trzecim dołku.

Teraz użyj mniejszej mikropipety, aby wielokrotnie pipetować zarodek, zapewniając siłę mechaniczną do usunięcia skorupki jaja i odsłonięcia blastomerów. Delikatnie kontynuuj pipetowanie zarodka, aby oddzielić poszczególne komórki blastomerów. W poniższym protokole zobaczymy tę technikę w akcji.

- Trzymaj każdy koniec mikrokapilary o pojemności 10 mikrolitrów prawą i lewą ręką. Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnik, aby utworzyć dwie ręcznie pociągnięte kapilary.

Pod mikroskopem preparacyjnym przytnij końcówki ręcznie pociągniętych naczyń włosowatych kleszczami. Spraw, aby dwa rozmiary otworów końcówki były około dwa razy większe niż długość krótkiej osi zarodków C. elegans odpowiednio do transferu zarodków i usunięcia skorupki jaja.

Podłącz wyciągniętą kapilę do urządzenia do pipetowania do ust. Odpipetować 45 mikrolitrów roztworu soli jaja na studzienkę szkiełka wielodołkowego.

Umieść 5 do 10 dorosłych C. elegans w studni. Aby uzyskać wczesne zarodki C. elegans, należy pokroić dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C. elegans i przesuwając igły obok siebie.

Odpipetować 45 mikrolitrów roztworu podchlorynu do studzienki obok studzienki zawierającej roztwór soli jajecznej, a następnie pipetę 45 mikrolitrów pożywki Sheltona do kolejnych trzech studzienek. Przenieść zarodki w stadium jednokomórkowym i wczesnym stadium dwukomórkowym do roztworu hipodochorytu za pomocą pipety doustnej z otworem o większym rozmiarze i odczekać od 40 do 55 sekund.

Umyj zarodki, przenosząc je do następnych trzech dołków za pomocą pożywki wzrostowej Sheltona w ciągu 1 do 2 sekund w każdym z pierwszych dwóch dołków. Używając ręcznie narysowanej kapilary z otworem o mniejszym rozmiarze, ostrożnie powtórz pipetowanie zarodka w celu usunięcia skorupki jaja.

Następnie należy w sposób ciągły pipetować ręcznie narysowaną kapilarą, aby oddzielić blastomery embrionalne w stadium dwukomórkowym.

- Po usunięciu skorupki jaja zminimalizuj siłę podczas pipetowania zarodków w górę iw dół, aby zapobiec pęknięciu.