Name: Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj automatyzację przygotowania próbek białkowych do spektrometrii masowej przy użyciu niedrogiego robota laboratoryjnego typu open source. Protokół zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez nagrody NIH F32-HL149191 dla YH; R00-HL144829 do EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 do MPL. Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3 są tworzone za pomocą internetowego narzędzia do ilustracji naukowych, BioRender.com.

<ol><li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li>
<li>Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li>
<li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li>
<li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li>
<li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+reproducibility%2C+human+error%2C+and+public+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li>
<li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+with+data+and+analyses%3A+Errors%2C+underlying+themes%2C+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li>
<li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multiplex+LC-MS%2FMS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I%2C+B%2C+C-I%2C+C-II%2C+C-III%2C+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li>
<li>Müller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li>
<li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li>
<li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona%3A+experimental+methods+for+big+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li>
<li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021).</li>
<li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Krytyczne kroki w ramach protokołu Aby uzyskać najlepszą wydajność, należy używać zweryfikowanego przez Opentrons sprzętu laboratoryjnego, modułów i materiałów eksploatacyjnych kompatybilnych z OT-2. Niestandardowe wyroby laboratoryjne można tworzyć zgodnie z instrukcjami Opentrons w Reference14. Upewnij się, że skalibrowałeś pokład OT-2, pipety i sprzęt laboratoryjny przy pierwszym użyciu. Bardzo ważne jest również przestrzeganie wytycznych producenta kulek SP3 dotyczących p...

Proteomika oparta na spektrometrii mas jest potężnym narzędziem do jednoczesnego pomiaru obfitości wielu białek w próbkach biologicznych. Eksperymenty proteomiczne z analizą bioinformatyczną są rutynowo wykorzystywane do identyfikacji biomarkerów i odkrywania powiązanych kompleksów biologicznych i szlaków leżących u podstaw mechanizmów patologicznych. Dzięki wysokiej swoistości analitowej i potencjalnej dokładności ilościowej, proteomika shotgun ma również doskonały potencjał do przyjęcia przez ośrodki badawcze i laboratoria diagnostyczne do analizy próbek klinicznych bez konieczności polegania na przeciwciałach1,2.
Aby przygotować próbki białek do analizy proteomicznej, białka wyekstrahowane z próbek biologicznych (np. komórek i tkanek) zazwyczaj muszą najpierw zostać przetworzone przy użyciu długich protokołów, w tym pomiaru stężenia białka w próbce, redukcji białka i alkilowania oraz trawienia enzymatycznego do peptydów. Co więcej, białka ekstrahowane w popularnych do lizy zawierających detergenty często wymagają dodatkowych etapów wymiany buforu lub usuwania detergentu przed analizą, ponieważ detergent może zakłócać trawienie trypsyny i znacznie pogarszać wydajność dalszej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS) 3. Peptydy są zwykle dalej odsalane, suszone i odtwarzane w rozpuszczalnikach kompatybilnych z LC-MS/MS po trawieniu enzymatycznym. Te procedury biochemiczne białek mogą być pracochłonne i czasochłonne. W związku z tym nadal ograniczają przepustowość przepływów pracy proteomiki i przyczyniają się do zmienności pozyskiwanych danych4,5. Błędy i uprzedzenia ludzkie zostały uznane za kluczowe czynniki wpływające na wariancję i odtwarzalność danych6,7. Aby zminimalizować błędy ludzkie w procesach przygotowywania próbek metodą spektrometrii mas, zautomatyzowane systemy robotyczne pipetowania zostały wykorzystane w celu poprawy przepustowości i powtarzalności identyfikacji i kwantyfikacji białek na podstawie proteomiki typu shotgun i ukierunkowanej analizy spektrometrii mas, gdzie takie postępy zostały okrzyknięte jako kluczowe dla kontynuowania nacisku na powszechne przyjęcie technologii proteomicznych w krytycznych badaniach i warunkach klinicznych8,9,10,11,12,13. Jednak większość istniejących protokołów wykorzystuje zrobotyzowane platformy do obsługi cieczy, które wymagają znacznych inwestycji i szkoleń, co ogranicza ich użyteczność w wielu laboratoriach w środowisku akademickim lub w inny sposób przy ograniczonym budżecie.
Ten artykuł opisuje protokół, który wykorzystuje tani, zrobotyzowany system obsługi cieczy OT-2 o otwartym kodzie źródłowym, do częściowej automatyzacji typowego procesu przygotowywania próbek proteomicznych typu shotgun. OT-2 ma niższy koszt niż wiele innych zrobotyzowanych systemów obsługi cieczy, a w chwili pisania tego tekstu kosztuje około 5,000 USD. Biorąc pod uwagę ceny różnych modułów i sprzętu laboratoryjnego, całkowity koszt przeprowadzenia eksperymentów w tym protokole w momencie pisania tego tekstu wynosi około 10 000 USD, co czyni go bardziej przystępnym dla znacznie szerszego zestawu laboratoriów w porównaniu z droższymi opcjami. OT-2 jest kompatybilny z programowaniem typu open source za pomocą skryptów Pythona i oferuje dużą elastyczność w projektowaniu protokołów DIY zdefiniowanych przez użytkownika. Korzystając z trzech opracowanych przez nas skryptów, poniższe protokoły obejmują wykonywanie typowego procesu przygotowania próbki proteomicznej typu shotgun na stacji OT-2 z archetypicznym wzorcem białka (albumina surowicy bydlęcej; BSA) oraz złożoną próbkę białka normalnego lizatu ludzkiego serca (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Procedury przetwarzania (1) próbki BSA i (2) próbki złożonego lizatu sercowego są szczegółowo opisane odpowiednio w sekcjach 1, 2, 5, 6 i 3, 4, 5, 6 i 6 Protokołu. Kulki magnetyczne modyfikowane karboksylanem Sera-Mag są wykorzystywane w jednogarnkowym przygotowywaniu próbek wzmocnionych fazą stałą (SP3) w celu usunięcia detergentów i soli z próbek białek i peptydów. Tryptyczne trawienie z albuminy surowicy bydlęcej i białek ludzkiego serca jest następnie oczyszczane za pomocą kulek SP3 i przesyłane do analizy LC-MS/MS. Widma masowe są następnie analizowane za pomocą oprogramowania MaxQuant do identyfikacji peptydów i białek. Reprezentatywne wyniki przeprowadzone przez nas pokazują, że protokół osiąga doskonałe techniczne współczynniki zmienności (CV) przy jednoczesnej oszczędności czasu pracy na stole i nie ustępuje trawieniu ręcznemu.

<table><tbody><tr><td>300 i mikro; L końcówki do pipet</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw stojaków na probówki 4 w 1</td><td>Opentrons</td><td></td><td>Każdy zestaw zawiera 2 podstawki i 4 uchwyty na probówki 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml i 50 ml. W tym badaniu używamy topów 2 ml i 15 ml + 50 ml.</td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 100 C18 HPLC Kolumna</td><td>Thermo Scientific</td><td>#164568</td><td>3 &mu; m cząstka; 100 i Aring; por; 75 &mu; m x 150 mm</td></tr><tr><td>Acetonitryl LC-MS klasy</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#JT9829 <tr><td>Zestaw bloków aluminiowych</td><td>Opentrons</td><td></td><td>Ten zestaw bloków zawiera 3 nakrętki, które są kompatybilne z 96-dołkowymi probówkami o pojemności 2,0 ml i paskiem PCR do użytku z modułem temperatury OT-2. W tym manuskrypcie używamy uchwytu na probówkę o pojemności 2,0 ml.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># A6141</td><td></td></tr><tr><td>Wzorcowa albumina surowicy bydlęcej, 2 mg/ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23210</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO) Klasa LC-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5545</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny HPLC EASY-Spray</td><td>Thermo Scientific</td><td>#ES800A</td><td></td></tr><tr><td>EasynLC 1200 Nano LC</td><td>Thermo Scientific</td><td>#LC140</td><td></td></tr><tr><td>Odporny na etanol 195-200</td><td>Fisher</td><td>#04-355-720</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy klasy LC-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85178</td><td></td></tr><tr><td>Lizat ludzkiego serca</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB820-59217</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I1149</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak</td> <td>na probówkiThermo Scientific</td><td>#MR02</td><td></td></tr><tr><td>MAXQuant v.1.6.10.43</td><td></td><td></td><td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>mySPIN 6 Mini wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>#75004061</td> mini <td>wirówka stołowa do szybkiego wirowania</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96-dołkowa płytka głębinowa, V Dół</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OT-2 moduł magnetyczny</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa OT-2 P300</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa OT-2 P50</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>Robot pipetujący OT-2</td><td>Opentrons</td><td>OT-2</td> Moduł temperaturowy Opentrons GEN1 <td></td></tr><tr><td>Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23275</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>#022431102</td><td></td></tr><tr><td>Baza danych sekwencji białek</td><td>UniProt/SwissProt</td><td></td><td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20recenzje:tak</td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead Modyfikowane karboksylanem cząstki magnetyczne, hydrofobowe</td><td>Cytiva</td><td>#65152105050250</td><td></td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead Cząstki magnetyczne modyfikowane karboksylanem, Hydrofilowy</td><td>Cytiva</td><td>#45152105050250</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Parownik próżniowy</td></tr><tr><td>Thermo Q Exactive HF Spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna MS</td><td>Grade Thermo Scientific</td><td>#90057</td><td></td></tr><tr><td>Woda LC-MS klasa</td><td>VWR</td><td>#BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Eksperymenty proteomiczne oparte na spektrometrii mas wymagają wielu etapów przygotowania próbki, w tym enzymatycznego trawienia białek i oczyszczania, co może zająć znaczną ilość osobogodzin pracy na stanowisku i stanowić źródło zmienności między partiami. Automatyzacja laboratorium za pomocą robotów pipetujących może zmniejszyć nakład pracy ręcznej, zmaksymalizować wydajność i zwiększyć powtarzalność badań. Mimo to wysokie ceny wyjściowe standardowych stacji automatyki sprawiają, że są one nieosiągalne dla wielu laboratoriów akademickich. W tym artykule opisano proces przygotowania próbek proteomicznych przy użyciu niedrogiego systemu automatyzacji typu open source (Opentrons OT-2), w tym instrukcje dotyczące konfiguracji półautomatycznej redukcji białek, alkilacji, trawienia i oczyszczania; a także towarzyszące skrypty Pythona o otwartym kodzie źródłowym do programowania systemu OT-2 za pomocą interfejsu programowania aplikacji.

Przedstawiono tutaj trzy skrypty Python kompatybilne z robotem OT-2, które służą do przygotowania próbek do proteomiki metodą spektrometrii mas z wykorzystaniem pojedynczego standardu białkowego w postaci albuminy surowicy bydlęcej (powtórzenia techniczne n = 5 trawień) oraz próbki lizatu ludzkiego serca zawierającego detergent (n = 5 trawień). Każdy produkt trawienia jest dzielony na dwie reakcje oczyszczania peptydów. Liczba zidentyfikowanych dopasowań widma do peptydów (PSM), peptydów i białek w każdym przebiegu dla p...

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Protokół ten wykorzystuje automatyzację do wykonywania preparatów biochemicznych białek przed eksperymentami spektrometrii mas, co pozwala na większą przepustowość i mniejszą zmienność w badaniach proteomicznych. Protokół ten wykorzystuje tani, programowalny system obsługi cieczy, który jest dostępny dla większej liczby laboratoriów. Udostępniamy skrypty Pythona o otwartym kodzie źródłowym, które można modyfikować w celu dalszego rozwoju.Procedurę zademonstruje Milton Amaya, student studiów magisterskich w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, otwórz noSP3_Digestion. py w edytorze tekstu i określ zmienne specyficzne dla eksperymentu zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ.Następnie otwórz aplikację Opentrons i prześlij skrypt do zakładki Protokół w aplikacji Opentrons. Następnie umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w talii OT2 określonej w skrypcie Pythona. Następnie umieść roztwór wodorowęglanu amonu w studzience A1 stojaka na probówki cztery w jednym z 15-mililitrowym i 50-mililitrowym uchwytem na probówki i umieść próbkę białka w studzience A1 stojaka na probówki cztery w jednym z dwumililitrowym uchwytem probówki.Ręcznie umieść dwumililitrowe probówki białkowe o niskim poziomie wiązania w studzienkach aluminiowego bloku umieszczonego na górze modułu temperatury, zaczynając od A1 i przesuwając się pionowo w dół. Następnie umieść roztwór DTT w studzience A6 stojaka na probówki cztery w jednym z dwumililitrowym uchwytem na probówki. Obserwuj, jak robot przenosi odpowiednią objętość buforu wodorowęglanu amonu do probówek z próbkami w bloku aluminiowym.Następnie ręcznie sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że DTT została załadowana do A6 dwumililitrowego stojaka na rurki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Po potwierdzeniu lokalizacji tuby DTT i otwarciu nasadki tuby, kliknij przycisk Wznów w aplikacji Opentrons, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 10 mikrolitrów roztworu DTT do każdej studzienki próbki, a następnie wykonuje pięć rund mieszania.Następnie sprawdź, czy program robota został wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że zamknięto nakrętki na probówkach z próbkami. Następnie ręcznie zamknij zaślepki probówek i kliknij Wznów, aby kontynuować. Poczekaj, aż moduł temperatury robota zacznie podgrzewać aluminiowy blok, a temperatura osiągnie 55 stopni Celsjusza, a następnie wykonaj pięciominutową inkubację, aby próbki osiągnęły 55 stopni Celsjusza.Robot będzie następnie utrzymywał tę temperaturę przez 30 minut, aby umożliwić redukcję białka przez naziemną telewizję cyfrową. Podczas inkubacji przygotuj roztwór jodoacetamidu i ręcznie owiń go folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Po inkubacji, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, upewnij się, że otworzyłeś nakrętki na probówkach z próbkami, odkręć probówki z próbkami i kliknij Wznów, aby kontynuować.Następnie ręcznie sprawdź, czy program robota został wstrzymany z komunikatem ostrzegawczym, upewnij się, że jodoacetamid został załadowany do B6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Po potwierdzeniu położenia stojaka probówki jodoacetamidowej i otwarciu nakrętki probówki, kliknij Wznów i upewnij się, że robot przenosi 10 mikrolitrów roztworu jodoacetamidu do każdej probówki z próbką, a następnie wykonuje pięć rund mieszania. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, Zamknij nakrętki na probówkach z próbkami, zakryj probówki z próbkami i przykryj je folią, a następnie przykryj cały aluminiowy blok czystym kawałkiem folii i kliknij Wznów, aby kontynuować.Poczekaj, aż próbki zostaną inkubowane w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 30 minut i upewnij się, że moduł temperatury robota wyłączy się po zakończeniu inkubacji jodoacetamidu. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, upewnij się, że trypsyna została załadowana do C6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w szczelinie czwartej przed wznowieniem protokołu, umieść roztwór trypsyny w studzience C6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nasadką probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować. Następnie, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, Otwórz zaślepki na probówkach z próbkami w module temperatury, odkręć probówki z próbkami i kliknij Wznów, aby kontynuować.W trybie czuwania, podczas gdy robot przenosi 10 mikrolitrów trypsyny do każdej probówki z próbką, a następnie następuje pięć rund mieszania. Po całonocnym trawieniu trypsyny należy krótko obrócić próbki za pomocą mikrowirówki stołowej i umieścić próbki na magnetycznym stojaku na probówki. Po dwóch minutach ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowego zestawu probówek wirówkowych o niskiej wiązalności białka i przechowywać próbki w lodówce.Następnie otwórz skrypt języka Python SP3_peptide_cleanup. py w edytorze tekstów i określ zmienne eksperymentu zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ. Następnie prześlij skrypt do zakładki Protokół w aplikacji Opentrons.Umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w pokładzie OT2 określonym w skrypcie Pythona i upewnij się, że moduł magnetyczny jest włączony i podłączony do robota. Umieść nową, dwumililitrową, 96-dołkową płytkę dołkową na górze modułu magnetycznego. Następnie umieść strawione próbki w dwumililitrowym stojaku na probówki, zaczynając od A1 i przesuwając się pionowo w dół.Następnie upewnij się, że robot przenosi 55 mikrolitrów przefermentowanych próbek do studzienek w płytkach głębokich studni na module magnetycznym. Sprawdź, czy protokół robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat, Upewnij się, że przygotowane koraliki zostały załadowane do A6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Następnie odwiruj i krótko odkręć kulki SP3 w mini-wirówce stołowej i umieść je w dołku A6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nakrętką.Sprawdź, czy program robotów jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że 80% etanolu zostało załadowane do A4 z 15-mililitrowego plus 50-mililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe piątym przed wznowieniem protokołu. Następnie umieść 80% roztwór etanolu w studzience A4 w stojaku na probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską, zasysa supernatant z każdej studzienki i dozuje go do rurki odpływowej.Poczekaj, aż robot zmieni prędkość pipetowania z powrotem na domyślną i odłączy moduł magnetyczny. Gdy program robotów zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, Otwórz nakrętkę na probówce wodorowęglanu amonu, otwórz nakrętkę roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwanie, gdy robot odłącza moduł magnetyczny, przenosi 250 mikrolitrów buforu wodorowęglanu amonu do każdej studzienki i natychmiast miesza 10 razy.Następnie obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską i przenosi supernatant z każdej studzienki do rurki odpływowej. Poczekaj, aż robot przeniesie 100 mikrolitrów buforu wodorowęglanu amonu do każdej studzienki i natychmiast miesza przez 10 razy. Sprawdź, czy program robotów jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że nowe probówki zbiorcze zostały umieszczone w dwumililitrowym bloku aluminiowym przed wznowieniem protokołu.Następnie umieść nowy zestaw probówek wirówkowych do mikrowirówek o niskiej retencji białka w aluminiowym bloku natychmiast po ostatniej probówce z próbką początkowo w bloku i kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwanie, podczas gdy robot przenosi każdą próbkę z buforu wodorowęglanu amonu do nowych dwumililitrowych probówek. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, upewnij się, że trypsyna została załadowana do C6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu, umieść roztwór trypsyny w studzience C6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nasadką probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować.Po zakończeniu programu owiń nakrętki probówek z próbkami folią parafinową, przenieś wszystkie próbki do mieszalnika o kontrolowanej temperaturze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin z wytrząsaniem z prędkością 1 000 obr./min. W próbce BSA zidentyfikowano pożywkę składającą się z 728 dopasowań widma peptydów i 65 peptydów, o współczynnikach zmienności odpowiednio 5,2% i 3,2%. W złożonej próbce serca zidentyfikowano pożywkę zawierającą 9 526 dopasowań widma peptydów, 7 558 peptydów i 1 336 białek w 10 seriach ze współczynnikami zmienności odpowiednio 7,6%, 5,9% i 3,6%.Aby określić zmienność kwantyfikacji peptydów, obliczono współczynniki zmienności intensywności wyekstrahowanego chromatogramu jonowego dla 10 peptydów, które odwzorowują unikalne białko. Gdy zmienność wyników eksperymentalnych człowieka i robota w pomiarze stężenia białka została dodatkowo porównana z testem BCA, średni współczynnik zmienności testu BCA robota był niższy niż ręczny test BCA u człowieka. Protokół ten skraca czas przetwarzania każdej próbki na stanowisku laboratoryjnym.Toruje nam to drogę do zbadania różnic proteomicznych w panelu linii komórkowych pomiędzy wieloma terapiami lekowymi.

shotgun-proteomics-sample-processing-automated-an-open-source-lab

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety.  W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno 1H, jak i 19F NMR.

Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Poznaj automatyzację przygotowania próbek białkowych do spektrometrii masowej przy użyciu niedrogiego robota laboratoryjnego typu open source. Protokół zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność wyników.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Przeglądaj więcej filmów