Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Protokół ten wykorzystuje automatyzację do wykonywania preparatów biochemicznych białek przed eksperymentami spektrometrii mas, co pozwala na większą przepustowość i mniejszą zmienność w badaniach proteomicznych. Protokół ten wykorzystuje tani, programowalny system obsługi cieczy, który jest dostępny dla większej liczby laboratoriów. Udostępniamy skrypty Pythona o otwartym kodzie źródłowym, które można modyfikować w celu dalszego rozwoju.

Procedurę zademonstruje Milton Amaya, student studiów magisterskich w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, otwórz noSP3_Digestion. py w edytorze tekstu i określ zmienne specyficzne dla eksperymentu zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ.

Następnie otwórz aplikację Opentrons i prześlij skrypt do zakładki Protokół w aplikacji Opentrons. Następnie umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w talii OT2 określonej w skrypcie Pythona. Następnie umieść roztwór wodorowęglanu amonu w studzience A1 stojaka na probówki cztery w jednym z 15-mililitrowym i 50-mililitrowym uchwytem na probówki i umieść próbkę białka w studzience A1 stojaka na probówki cztery w jednym z dwumililitrowym uchwytem probówki.

Ręcznie umieść dwumililitrowe probówki białkowe o niskim poziomie wiązania w studzienkach aluminiowego bloku umieszczonego na górze modułu temperatury, zaczynając od A1 i przesuwając się pionowo w dół. Następnie umieść roztwór DTT w studzience A6 stojaka na probówki cztery w jednym z dwumililitrowym uchwytem na probówki. Obserwuj, jak robot przenosi odpowiednią objętość buforu wodorowęglanu amonu do probówek z próbkami w bloku aluminiowym.

Następnie ręcznie sprawdź, czy program robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że DTT została załadowana do A6 dwumililitrowego stojaka na rurki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Po potwierdzeniu lokalizacji tuby DTT i otwarciu nasadki tuby, kliknij przycisk Wznów w aplikacji Opentrons, aby kontynuować. Upewnij się, że robot przenosi 10 mikrolitrów roztworu DTT do każdej studzienki próbki, a następnie wykonuje pięć rund mieszania.

Następnie sprawdź, czy program robota został wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że zamknięto nakrętki na probówkach z próbkami. Następnie ręcznie zamknij zaślepki probówek i kliknij Wznów, aby kontynuować. Poczekaj, aż moduł temperatury robota zacznie podgrzewać aluminiowy blok, a temperatura osiągnie 55 stopni Celsjusza, a następnie wykonaj pięciominutową inkubację, aby próbki osiągnęły 55 stopni Celsjusza.

Robot będzie następnie utrzymywał tę temperaturę przez 30 minut, aby umożliwić redukcję białka przez naziemną telewizję cyfrową. Podczas inkubacji przygotuj roztwór jodoacetamidu i ręcznie owiń go folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Po inkubacji, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, upewnij się, że otworzyłeś nakrętki na probówkach z próbkami, odkręć probówki z próbkami i kliknij Wznów, aby kontynuować.

Następnie ręcznie sprawdź, czy program robota został wstrzymany z komunikatem ostrzegawczym, upewnij się, że jodoacetamid został załadowany do B6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Po potwierdzeniu położenia stojaka probówki jodoacetamidowej i otwarciu nakrętki probówki, kliknij Wznów i upewnij się, że robot przenosi 10 mikrolitrów roztworu jodoacetamidu do każdej probówki z próbką, a następnie wykonuje pięć rund mieszania. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, Zamknij nakrętki na probówkach z próbkami, zakryj probówki z próbkami i przykryj je folią, a następnie przykryj cały aluminiowy blok czystym kawałkiem folii i kliknij Wznów, aby kontynuować.

Poczekaj, aż próbki zostaną inkubowane w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 30 minut i upewnij się, że moduł temperatury robota wyłączy się po zakończeniu inkubacji jodoacetamidu. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, upewnij się, że trypsyna została załadowana do C6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w szczelinie czwartej przed wznowieniem protokołu, umieść roztwór trypsyny w studzience C6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nasadką probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować. Następnie, gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat ostrzegawczy, Otwórz zaślepki na probówkach z próbkami w module temperatury, odkręć probówki z próbkami i kliknij Wznów, aby kontynuować.

W trybie czuwania, podczas gdy robot przenosi 10 mikrolitrów trypsyny do każdej probówki z próbką, a następnie następuje pięć rund mieszania. Po całonocnym trawieniu trypsyny należy krótko obrócić próbki za pomocą mikrowirówki stołowej i umieścić próbki na magnetycznym stojaku na probówki. Po dwóch minutach ostrożnie przenieść supernatant za pomocą pipety do nowego zestawu probówek wirówkowych o niskiej wiązalności białka i przechowywać próbki w lodówce.

Następnie otwórz skrypt języka Python SP3_peptide_cleanup. py w edytorze tekstów i określ zmienne eksperymentu zgodnie z potrzebami w sekcji DOSTOSUJ TYLKO TUTAJ. Następnie prześlij skrypt do zakładki Protokół w aplikacji Opentrons.

Umieść wymagany sprzęt laboratoryjny i pipety w odpowiednim miejscu w pokładzie OT2 określonym w skrypcie Pythona i upewnij się, że moduł magnetyczny jest włączony i podłączony do robota. Umieść nową, dwumililitrową, 96-dołkową płytkę dołkową na górze modułu magnetycznego. Następnie umieść strawione próbki w dwumililitrowym stojaku na probówki, zaczynając od A1 i przesuwając się pionowo w dół.

Następnie upewnij się, że robot przenosi 55 mikrolitrów przefermentowanych próbek do studzienek w płytkach głębokich studni na module magnetycznym. Sprawdź, czy protokół robota jest wstrzymany i wyświetla komunikat, Upewnij się, że przygotowane koraliki zostały załadowane do A6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu. Następnie odwiruj i krótko odkręć kulki SP3 w mini-wirówce stołowej i umieść je w dołku A6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nakrętką.

Sprawdź, czy program robotów jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że 80% etanolu zostało załadowane do A4 z 15-mililitrowego plus 50-mililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe piątym przed wznowieniem protokołu. Następnie umieść 80% roztwór etanolu w studzience A4 w stojaku na probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować. Obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską, zasysa supernatant z każdej studzienki i dozuje go do rurki odpływowej.

Poczekaj, aż robot zmieni prędkość pipetowania z powrotem na domyślną i odłączy moduł magnetyczny. Gdy program robotów zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, Otwórz nakrętkę na probówce wodorowęglanu amonu, otwórz nakrętkę roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwanie, gdy robot odłącza moduł magnetyczny, przenosi 250 mikrolitrów buforu wodorowęglanu amonu do każdej studzienki i natychmiast miesza 10 razy.

Następnie obserwuj, jak robot zmienia prędkość pipetowania na niską i przenosi supernatant z każdej studzienki do rurki odpływowej. Poczekaj, aż robot przeniesie 100 mikrolitrów buforu wodorowęglanu amonu do każdej studzienki i natychmiast miesza przez 10 razy. Sprawdź, czy program robotów jest wstrzymany i wyświetla komunikat: Upewnij się, że nowe probówki zbiorcze zostały umieszczone w dwumililitrowym bloku aluminiowym przed wznowieniem protokołu.

Następnie umieść nowy zestaw probówek wirówkowych do mikrowirówek o niskiej retencji białka w aluminiowym bloku natychmiast po ostatniej probówce z próbką początkowo w bloku i kliknij Wznów, aby kontynuować. Czuwanie, podczas gdy robot przenosi każdą próbkę z buforu wodorowęglanu amonu do nowych dwumililitrowych probówek. Gdy program robota zostanie wstrzymany i wyświetli komunikat, upewnij się, że trypsyna została załadowana do C6 dwumililitrowego stojaka na probówki znajdującego się w gnieździe czwartym przed wznowieniem protokołu, umieść roztwór trypsyny w studzience C6 dwumililitrowego stojaka na probówki z otwartą nasadką probówki i kliknij Wznów, aby kontynuować.

Po zakończeniu programu owiń nakrętki probówek z próbkami folią parafinową, przenieś wszystkie próbki do mieszalnika o kontrolowanej temperaturze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin z wytrząsaniem z prędkością 1 000 obr./min. W próbce BSA zidentyfikowano pożywkę składającą się z 728 dopasowań widma peptydów i 65 peptydów, o współczynnikach zmienności odpowiednio 5,2% i 3,2%. W złożonej próbce serca zidentyfikowano pożywkę zawierającą 9 526 dopasowań widma peptydów, 7 558 peptydów i 1 336 białek w 10 seriach ze współczynnikami zmienności odpowiednio 7,6%, 5,9% i 3,6%.

Aby określić zmienność kwantyfikacji peptydów, obliczono współczynniki zmienności intensywności wyekstrahowanego chromatogramu jonowego dla 10 peptydów, które odwzorowują unikalne białko. Gdy zmienność wyników eksperymentalnych człowieka i robota w pomiarze stężenia białka została dodatkowo porównana z testem BCA, średni współczynnik zmienności testu BCA robota był niższy niż ręczny test BCA u człowieka. Protokół ten skraca czas przetwarzania każdej próbki na stanowisku laboratoryjnym.

Toruje nam to drogę do zbadania różnic proteomicznych w panelu linii komórkowych pomiędzy wieloma terapiami lekowymi.