Name: Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj krystalizację enzymów w mikroprzepływowym chipie ChipX metodą dyfuzji przeciwprądowej. Technika umożliwia in situ analizę dyfrakcyjną rentgenowską bez konieczności kriochłodzenia i manipulacji kryształami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Swiss Light Source (Villigen, Szwajcaria) za przydzielenie czasu wiązki do projektu na liniach badawczych X10SA (PXII) i X06DA (PXIII), Alexandrze Bluhm za jej wkład w udoskonalenie konstrukcji, Clarissie Worsdale za nagranie lektora oraz François Schnellowi (Université de Strasbourg) za pomoc w montażu wideo i SFX. Prace te były wspierane przez francuskie Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Uniwersytet w Strasburgu, konsorcjum LabEx "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), finansowanie studiów doktoranckich dla R.dW z inicjatywy doskonałości (IdEx) Uniwersytetu w Strasburgu w ramach francuskiego programu narodowego "Investissements d'Avenir", sfinansowanie doktoranckie dla K.R. z Uniwersytetu Francusko-Niemieckiego (UFA-DFH, Nr dotacji CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant nr Mo 634/10-1). Autorzy skorzystali z programu współpracy PROCOPE Hubert Curien (francuskie Ministerstwo Spraw Zagranicznych i Deutscher Akademischer Austauschdienst).

1. Konfiguracja testów krystalizacji w ChipX
UWAGA: Urządzenie mikroprzepływowe ChipX można uzyskać od autorów. Opis chipa znajduje się w Rysunek 1. Roztwory zawierające krystalant (lub czynnik krystalizujący) używany do wywołania krystalizacji mogą być pochodzenia handlowego lub przygotowane przez eksperymentatora.
<ol>
	<li>Ładowanie próbki biomolekuły 
	UWAGA: Objętość próbki faktycznie wymagana do przeprowadzenia indywidualnego testu przeciwdyfuzyjnego w prostym odcinku każdego kanału ChipX wynosi 300 nL. Jednak dla wygody sugerujemy załadowanie 5 μl, aby całkowicie wypełnić osiem kanałów, biorąc pod uwagę zmienną długość ich zakrzywionej sekcji i martwe objętości wlotu.
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetę o pojemności 5 μl roztworów enzymatycznych za pomocą standardowej pipety i końcówki o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzykiwać roztwór, aż osiem kanałów zostanie wypełnionych do ich przeciwległego końca (wejście do zbiornika krystalicznego).</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 μl oleju parafinowego do wlotu próbki w celu odłączenia kanałów od siebie.</li>
		<li>Odzyskać dodatkowy roztwór w krystalicznym zbiorniku na końcu każdego kanału, używając standardowej pipety o pojemności 10 μl.</li>
		<li>Uszczelnij wlot próbki kawałkiem taśmy o wymiarach 1 cm x 1 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie roztworów krystalizacyjnych
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetą 5 μl roztworu krystalizacyjnego za pomocą standardowej pipety i końcówki o pojemności 10 μl. Pojemność zbiornika wynosi 10 μl, ale załadowanie tylko połowy pozwala uniknąć przepełnienia podczas uszczelniania taśmą i ułatwia dalsze dodawanie liganda do eksperymentów z namaczaniem. Jeżeli początkowe warunki krystalizacji uzyskano przez dyfuzję pary, należy zwiększyć stężenie krystalantu o współczynnik 1,5 - 2. Roztwory mogą być różne w każdym zbiorniku (w prezentowanym przypadku użyto 1 M wodorofosforanu dwuamonu, 100 mM octanu sodu, pH 4,5 w całym zbiorniku).</li>
		<li>Skierować końcówkę pipety w kierunku wejścia do kanału w lejkowatej części zbiornika, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas osadzania roztworu. Zapobiegłoby to kontaktowi między dwoma roztworami i krystalicznej dyfuzji do kanału.</li>
		<li>Wstrzyknąć krystaliczny roztwór do zbiornika.</li>
		<li>Uszczelnij zbiorniki kawałkiem taśmy o wymiarach 2,5 cm x 1 cm.</li>
		<li>Inkubuj chip w temperaturze 20 °C (temperaturę można regulować w zależności od celu, zwykle od 4 do 37 °C 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znakowanie białek karboksyrodaminą do wykrywania fluorescencji
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Należy to wykonać przed załadowaniem próbki, aby ułatwić wykrywanie kryształów w chipie za pomocą fluorescencji. Szczegółowa metoda znakowania śladowego fluorescencyjnego została opisana przez Puseya i współpracowników7. Wszystkie kroki odbywają się w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Rozpuścić 5 mg sproszkowanego estru karboksyrodaminy w 1 ml bezwodnego dimetyloformamidu, rozdzielić roztwór na 0,6 μl podwielokrotności przeznaczonych do przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy Na-boranu o pH 8,75.</li>
	<li>Rozcieńczyć podstawę, aby przygotować bufor reakcyjny przy 0,05 M pH Na-boranu 8,75.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę odsalającą (7 kDa MWCO, 0,5 ml) 800 μl buforu reakcyjnego.</li>
	<li>Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g, usunąć filtrat.</li>
	<li>Powtórz tę operację dwukrotnie (kroki 2.4-2.5), aby umyć kolumnę.</li>
	<li>Umieścić 80 μl białka w buforze do przechowywania w kolumnie (białko można rozcieńczyć do 1 mg/ml, aby w razie potrzeby zwiększyć objętość).</li>
	<li>Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g. Ten etap ma na celu przeniesienie białka z buforu magazynującego do buforu reakcyjnego.</li>
	<li>Odzyskać przepływ (zawierający białko w buforze reakcyjnym) i wymieszać go z 0,6 μl roztworu karboksyrodaminy.</li>
	<li>Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W międzyczasie przepłukać kolumnę 3 x buforem magazynującym, odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Umieścić roztwór reakcyjny na kolumnie.</li>
	<li>Odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 1400 x g i odzyskać przepływ (tj. roztwór znakowanego białka w buforze do przechowywania).</li>
	<li>Uzupełnić podstawowy roztwór białkowy o 0,1-1 % (w/w) znakowanego białka.</li>
	<li>Ustaw testy krystalizacji ChipX zgodnie z opisem w sekcji 1.</li>
	<li>Sprawdź obecność kryształów białka w testach, wzbudzając sondę fluorescencyjną źródłem światła o długości fali 520 nm.</li>
</ol>
3. Obserwacja kryształów
UWAGA: Z urządzeniem ChipX można obchodzić się bez specjalnej ostrożności, nawet z kryształami w środku, chyba że temperatura musi być kontrolowana.
<ol>
	<li>Użyj dowolnego mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić wynik testów krystalizacji w ChipX. Jego podstawa ma standardowe wymiary szkiełek mikroskopowych i jest kompatybilna z dowolnym systemem i uchwytem do szkiełek.</li>
	<li>Sprawdzić zawartość kanałów mikroprzepływowych, zaczynając od zbiornika, w którym stężenie krystalicznych jest najwyższe, do wlotu próbki, gdzie stężenie krystalantu jest najniższe. Materiał ChipX jest przezroczysty dla światła widzialnego, kompatybilny z użyciem polaryzatorów, a także z oświetleniem UV do identyfikacji kryształów białkowych za pomocą wewnętrznej fluorescencji tryptofanu8.</li>
	<li>Rejestruj pozycje kryształów za pomocą etykiet wytłoczonych wzdłuż kanałów lub zaznacz lokalizacje kryształów trwałym markerem, rysując kolorowe kropki obok nich na powierzchni chipa.</li>
</ol>
4. Moczenie kryształów z ligandami
UWAGA: Ta procedura jest opcjonalna. Służy do wprowadzania ligandów, substratów enzymatycznych lub ciężkich atomów do kryształów i powinien być przeprowadzany co najmniej 24-48 godzin przed analizą rentgenowską, aby umożliwić dyfuzję związku wzdłuż kanałów i do kryształów.
<ol>
	<li>Delikatnie usuń taśmę uszczelniającą ze zbiorników.</li>
	<li>Dodać do 5 μl roztworu liganda do jednego lub kilku zbiorników za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl (w przykładzie dodano 3 μl 10 mM roztworu trifosforanu cytydyny-5'-[(α,β)-metyleno] (CMPcPP), aby uzyskać końcowe stężenie 3,75 mM). CMPcPP jest niehydrolizowalnym analogiem CTP, naturalnego substratu enzymu.</li>
	<li>Uszczelnij zbiorniki kawałkiem taśmy o wymiarach 2,5 cm x 1 cm.</li>
	<li>Inkubować chip w kontrolowanej temperaturze przez 24-48 godzin, aby umożliwić dyfuzję liganda wzdłuż kanałów chipa.</li>
</ol>
5. Analiza kryształów metodą krystalografii szeregowej
UWAGA: Ta część protokołu musi być dostosowana w zależności od konfiguracji linii badawczej i właściwości dyfrakcyjnych kryształów. Podano jedynie ogólne wskazania do analizy krystalograficznej na podstawie doświadczeń przeprowadzonych na linii X06DA (SLS, Villigen, Szwajcaria).
<ol>
	<li>Montaż ChipX na goniometrze linii badawczej 
	UWAGA: Plik do drukowania 3D uchwytu ChipX znajduje się w ref4.
	<ol>
		<li>Wyłącz kriodyszę linii badawczej. Analizę tutaj przeprowadza się w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zamontuj ChipX na dedykowanym uchwycie z kanałem zawierającym kryształy do analizy umieszczonym pośrodku uchwytu. ChipX holder4 nie wymaga żadnej ani dodatkowej części, ponieważ został zaprojektowany tak, aby zapewnić idealne dopasowanie do ChipX.</li>
		<li>Przymocuj uchwyt do goniometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych
	<ol>
		<li>Zorientuj najgrubszą warstwę (górna warstwa, <silna klasa="xfig">Rysunek 1) ChipX (w tej orientacji etykiety wzdłuż kanałów są bezpośrednio czytelne za pomocą kamery centrującej linii badawczej), w kierunku bezpośredniej wiązki i najcieńszej powierzchni za kryształem, aby zminimalizować tłumienie sygnału dyfrakcyjnego, jak opisano w ref3.</li>
		<li>Aby uniknąć kolizji ChipX z otaczającym materiałem (beamstop, kolimator), należy ograniczyć ruchy goniometru w zakresie ±30° (0° odpowiada kanałom prostopadłym do wiązki promieniowania rentgenowskiego).</li>
		<li>Znajdź pozycję kryształów za pomocą etykiet wytłoczonych wzdłuż kanałów.</li>
		<li>Wybierz pozycję kryształu.</li>
		<li>Wyśrodkuj kryształ za pomocą standardowej siatki/rastrowej siatki o niskiej dawce lub procedury 1-kliknięcia (film pokazuje przykład przesiewania siatki).</li>
		<li>Zbieraj dane dyfrakcyjne w zakresie -30° / +30°.</li>
		<li>Uruchom ponownie procedurę w krokach 5.2.4-5.2.6 na innym krysztale w tym samym kanale po translacji chipa.</li>
		<li>Ręcznie wyrównaj kolejny kanał ChipX na środku uchwytu i kontynuuj zbieranie danych na kryształach obecnych w tym kanale.</li>
		<li>Użyj standardowych pakietów i procedur krystalograficznych do przetwarzania i scalania danych, a następnie do rozwiązywania i udoskonalania struktury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Giegé, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocrystallography%3A+past%2C+present%2C+future%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+Journal%22%5BJournal%5D)">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li>
<li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li>
<li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChipX%3A+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li>
<li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li>
<li>García-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crystal+Growth%22%5BJournal%5D)">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li>
<li>Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li>
<li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li>
<li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li>
<li>Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+nucleotidyltransferases%3A+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li>
<li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases%3A+A+tradeoff+in+activity%2C+stability+and+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285(2011).</li>
<li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSauter%2C+C+%22International+Tables+of+Crystallography%2C+Vol.+F%2C+Crystallography+of+Biological+Macromolecules%22">International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules</a>. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).</li>
<li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cool%22+crystals%3A+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001(2012).</li>
<li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li>
<li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecne protokoły w biokrystalografii obejmują przygotowanie kryształów przy użyciu metod takich jak dyfuzja parowa lub partia13, 14 i przeniesienie ich do mikropętli w celu chłodzenia kriogenicznego15, 16 przed wykonaniem analizy dyfrakcyjnej w strumieniu azotu w warunkach kriogenicznych. W przeciwieństwie do tego, bezpośrednie chłodzenie kryształów nie jest możliwe w ChipX3 , a kryształy nie mogą być ekstrahowane z ich kanału mikroprzepływowego, co może być postrzegane jako ograniczenia tej konfiguracji. Jednak protokół opisany w artykule zapewnia w pełni zintegrowany potok do oznaczania struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej (tj. w bardziej fizjologicznych warunkach). Mimo że gromadzenie danych w temperaturze pokojowej powoduje wzrost uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem19, efekt ten jest równoważony przez szybki czas zbierania danych (na każdym krysztale zbierany jest maksymalnie obrót o 60°) oraz przez łączenie kilku częściowych zestawów danych. Zarówno konstrukcja, jak i materiał ChipX zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia rozpraszania tła i tłumienia sygnału dyfrakcyjnego3, a gromadzenie danych można przeprowadzić na kryształach o wymiarach odpowiadających połowie rozmiaru kanałów (40 μm)4.
Podsumowując, główne zalety protokołu są następujące. Kryształy są wytwarzane w środowisku wolnym od konwekcji (kanały mikroprzepływowe), co jest bardzo korzystne dla wzrostu kryształów wysokiej jakości. Metoda przeciwdyfuzji zaimplementowana w ChipX jest bardzo skuteczna w przesiewaniu krajobrazu przesycenia; Dyfuzja krystalikantów do kanału chipowego tworzy falę koncentracji i przesycenia, która pomaga określić odpowiednie warunki zarodkowania i wzrostu5. Kryształy nigdy nie są poddawane bezpośredniej obróbce, ale są analizowane in situ, wewnątrz chipa, co pozwala zachować ich rzeczywiste właściwości dyfrakcyjne (tj. nie zmienia mozaikowości kryształów przez oddziaływanie fizyczne lub kriochłodzenie)20. Analiza dyfrakcyjna jest przeprowadzana na serii kryształów rozmieszczonych wzdłuż kanałów chipowych z niską ekspozycją na dawkę w celu zminimalizowania uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, a pełny zestaw danych jest składany przez połączenie częściowych danych z serii. Standardowa powierzchnia i prosta konstrukcja ChipX pozwolą w przyszłości na pełną automatyzację zbierania danych in situ przy użyciu urządzeń synchrotronowych lub XFEL. Wszystkie kroki protokołu są wykonywane w ChipX. Z punktu widzenia eksperymentatora, konfiguracja chipa jest prosta i łatwa do wykonania przy użyciu standardowych pipet i nie wymaga żadnego dodatkowego sprzętu. Przypominające drzewo połączenie kanałowe na wlocie próbki minimalizuje martwe objętości w systemie, co jest ważne podczas pracy z próbkami, które są trudne do oczyszczenia lub które są dostępne tylko w ograniczonej ilości.
Podsumowując, podejście lab-on-a-chip wdrożone w ChipX upraszcza i skutecznie miniaturyzuje proces krystalizacji poprzez przeciwdyfuzję i określanie struktury krystalicznej, umożliwiając przejście od próbki do jej struktury 3D w jednym urządzeniu. Ma szerokie zastosowanie i oferuje przyjazne dla użytkownika, ekonomiczne rozwiązanie do rutynowych seryjnych badań biokrystalograficznych w temperaturze pokojowej.

Krystalografia to metoda do rozszyfrowywania architektury 3D makrocząsteczek biologicznych. To ostatnie jest ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób enzym wybiera i przetwarza swoje substraty. Określenie struktury krystalicznej wymaga krystalizacji docelowej makrocząsteczki i kondycjonowania kryształów do ich analizy za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej1. Zarówno przygotowanie, jak i obróbka kryształów są kluczowymi, ale delikatnymi etapami, które mogą wpływać na jakość kryształów i właściwości dyfrakcyjne, a tym samym na rozdzielczość (tj. dokładność) uzyskanej struktury 3D. Aby ułatwić przygotowanie wysokiej jakości kryształów i wyeliminować niepotrzebne czynności związane z obsługą w celu zachowania ich właściwości dyfrakcyjnych, zaprojektowaliśmy przyjazne dla użytkownika i wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe o nazwie ChipX2,3,4.
W tym artykule pokażemy, jak załadować roztwór białka do kanałów ChipX za pomocą konwencjonalnego materiału laboratoryjnego do przygotowania kryształów metodą przeciwdyfuzji. Ta metoda krystalizacji zapewnia skuteczne badanie przesiewowe przesycenia i potencjalnych warunków zarodkowania wzdłuż kanałów mikroprzepływowych zawierających roztwór enzymu ze względu na gradient stężeń generowany przez dyfuzję czynnika krystalizującego5,6.
Konfiguracja chipa jest prosta, wykorzystuje tylko standardowe pipety laboratoryjne i nie wymaga żadnego kosztownego sprzętu. Kiedy kryształy wyrosną w ChipX, ligandy enzymu mogą zostać wprowadzone przez dyfuzję. Dane dyfrakcyjne są następnie zbierane w temperaturze pokojowej na szeregu kryształów zawartych w kanałach chipa za pomocą synchrotronowego źródła promieniowania rentgenowskiego. Opisane tu badania strukturalne doprowadziły do wyznaczenia struktur enzymu dojrzewania tRNA w postaci apo oraz w kompleksie z analogiem jego substratu CTP wprowadzonego przez namaczanie. Białko to, zwane enzymem dodającym CCA, polimeryzuje ogon trójnukleotydowy CCA na końcu 3' tRNA. Porównanie dwóch obrazów 3D uzyskanych za pomocą krystalografii szeregowej ujawnia lokalne zmiany konformacyjne związane z wiązaniem liganda w warunkach, które są bardziej fizjologiczne niż te stosowane w kriokrystalografii. Protokół opisany w tym filmie ma ogólne zastosowanie do każdej biomolekuły, czy to białka, kwasu nukleinowego czy kompleksu wieloskładnikowego.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Aksjoskop A1</td><td>Obserwacja Zeiss</td><td></td><td>Crystal&nbsp; (Krok 3)</td></tr><tr><td>Ester sukcynimidylowy karboksyrodaminy</td><td>Invitrogen</td><td>C-6157</td><td>Znakowanie białek (krok 2)</td></tr><tr><td>CMPcPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-438</td><td>Namaczanie kryształów (krok 4)</td></tr><tr><td>Krystalicznie czysta taśma uszczelniająca</td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td><td>Uszczelnienie ChipX&nbsp; (krok 1)</td></tr><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td><td>ChipX ładowanie&nbsp; (krok 1)</td></tr><tr><td>Ultimaker 2 extended+</td>Drukarka 3D <td>Ultimaker</td><td></td><td>- Reprezentatywne wyniki</td></tr><tr><td>Źródło światła UV</td><td>Xtal Concepts Gmbh</td><td>XtalLight100c</td><td>Obserwacja kryształów&nbsp; (Krok 3)</td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca wirowa Zeba 7K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89882</td><td>Etykietowanie białek&nbsp; (Krok 2)</td></tr></tbody></table>

krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Przygotowanie dobrze dyfrakujących kryształów i postępowanie z nimi przed analizą rentgenowską to dwa kluczowe etapy badań biokrystalograficznych. Opisujemy wszechstronny układ mikroprzepływowy, który umożliwia wytwarzanie kryształów za pomocą wydajnej metody przeciwdyfuzji. Środowisko wolne od konwekcji zapewniane przez kanały mikroprzepływowe jest idealne do wzrostu kryształów i przydatne do dyfuzji substratu do miejsca aktywnego enzymu krystalicznego. Tutaj zastosowaliśmy to podejście do enzymu dodającego CCA psychrofilnej bakterii Planococcus halocryophilus w przedstawionym przykładzie. Po krystalizacji i dyfuzji/nasączeniu substratu, strukturę krystaliczną kompleksu enzym-substrat określono w temperaturze pokojowej za pomocą krystalografii szeregowej i analizy wielu kryształów bezpośrednio wewnątrz chipa. Cała procedura zachowuje rzeczywiste właściwości dyfrakcyjne próbek, ponieważ nie wymaga obróbki kryształów.

Opisany tutaj chip mikrofluidyczny został zaprojektowany w celu umożliwienia łatwego przygotowania testów krystalizacji oraz analizy kryształów w temperaturze pokojowej. Procedura opisana powyżej oraz w filmie została zastosowana w ramach charakterystyzacji strukturalnej enzymu dodającego sekwencję CCA z bakterii psychrofilnej Planococcus halocryophilus. Enzym ten należy do kluczowej rodziny polimeraz katalizujących sekwencyjne przyłączanie sekwencji 3' CCA do tRNA przy wykorzystaniu CTP i ATP9,10.
Układ scalony został najpierw wykorzystany do przygotowania kryształów enzymu do analizy strukturalnej metodą przeciwdyfuzji. W tym celu roztwór enzymu wprowadzono do ośmiu kanałów mikroprzepływowych (komór krystalizacyjnych) poprzez pojedynczą iniekcję w wlocie dla próbek układu (patrz Rysunek 1). Enzym zastosowano w stężeniu 5,5 mg/mL w buforze do przechowywania zawierającym 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl oraz 5 mM MgCl2. Etap ten wykonano ręcznie za pomocą standardowej mikropipety 10 µL. Następnie w zbiornikach na przeciwległym końcu kanałów umieszczono roztwory krystalizacyjne (100 mM octanu sodu pH 4,5, 1 M wodorofosforanu diamonu).
Procedura ładowania jest prosta i nie trwa dłużej niż pięć minut (Rysunek 2). Następnie substancja krystalizująca dyfunduje do kanałów, tworząc gradient stężenia, który inicjuje nukleację i wzrost kryształów. Gradient ten ewoluuje dynamicznie i obejmuje kontinuum stanów nasycenia5,6 aż do osiągnięcia stanu równowagi stężenia substancji krystalizującej pomiędzy kanałami a rezerwuarem. Testy krystalizacji są zazwyczaj monitorowane pod mikroskopem w okresie od 2 do 4 tygodni w celu śledzenia wzrostu kryształów. Bipiramidalne kryształy enzymu dodającego CCA pojawiły się w kanałach po kilku dniach inkubacji w temperaturze 20 °C (Rysunek 3). Opcjonalne znakowanie fluorescencyjne7 białka znacznie ułatwia identyfikację kryształów białkowych i ich odróżnienie od kryształów soli (Rysunek 4).
Wykorzystano środowisko dyfuzyjne w kanałach układu mikroprzepływowego do dostarczenia substratu do enzymu odpowiedzialnego za wzrost kryształów. W niniejszym przypadku do roztworów w zbiornikach dodano CMPcPP, analog CTP, w końcowym stężeniu 3,75 mM (Rysunek 5). Dodanie to wykonano dwa dni przed analizą krystalograficzną, aby umożliwić CMPcPP dotarcie do centrum katalitycznego enzymu i jego zajęcie, co zostało później potwierdzone przez strukturę kryształu (patrz poniżej).
Wytworzyliśmy uchwyt do chipa (Rysunek 6) z kwasu polimlekowego przy użyciu drukarki 3D. Uchwyt umożliwia montaż chipa na goniometrach z wykorzystaniem standardowych głowic magnetycznych. Dzięki temu chip może być łatwo pozycjonowany i przesuwany w wiązce promieni X, aby ustawić kryształy w pozycji dyfrakcyjnej. Strategia zbierania danych musi zostać dostosowana w zależności od charakterystyki linii wiązki oraz właściwości kryształu. W przypadku enzymu dodającego CCA dane zbierano na liniach wiązek X06DA i X10SA w Swiss Light Source (SLS), przy długości fali promieniowania X wynoszącej 1,0 Å i z użyciem detektorów pikselowych Pilatus 2M-F oraz 6M odpowiednio. Dla każdego kryształu w temperaturze pokojowej zebrano dane z zakresu rotacji 30-60° z obrazami co 0,1° lub 0,2° i czasem ekspozycji 0,1 s (patrz Tabela 1). Częściowe zestawy danych przetwarzano indywidualnie i obcinano w momencie, gdy rozdzielczość wzorów dyfrakcyjnych zaczęła spadać z powodu uszkodzeń radiacyjnych (wykrytych poprzez spadek stosunku sygnału do szumu <img alt="Równanie równowagi statycznej ⟨|σ(l)|⟩, reprezentacja symboliczna, użytek edukacyjny, koncepcja fizyczna." src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> i CC1/2, a także wzrost Rmeas w powłoce wysokiej rozdzielczości). Pełne zestawy danych odtworzono poprzez scalenie danych z 5 kryształów (Tabela 1). Struktury kryształów wyznaczono metodą wymiany molekularnej, korzystając ze standardowych pakietów krystalograficznych i procedur przetwarzania danych11 oraz uszlachetniania12. Porównanie struktur enzymu oraz jego kompleksu z CMPcPP ujawnia lokalną adaptację konformacyjną, która towarzyszy wiązaniu substratu w centrum aktywnym enzymu dodającego CCA (Rysunek 7).
<img alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego; kanały, wlot próbki, zbiorniki opisane do analizy płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Konstrukcja ChipX. Chip składa się z górnej warstwy wykonanej z COC (grubość: 1 mm), w której odciśnięto osiem kanałów mikrofluidycznych i zbiorników. Cały chip jest uszczelniony warstwą COC (grubość: 0,1 mm). Wszystkie kanały są połączone z pojedynczym wlotem po lewej stronie w celu jednoczesnej iniekcji próbek oraz z poszczególnymi zbiornikami po prawej stronie, do których naniesione są roztwory krystalizacyjne. Kanały, które stanowią właściwe komory krystalizacji chipa, mają długość 4 cm i przekrój 80 µm x 80 µm. Etykiety (A1, A2, A3 itd.) wytłoczone wzdłuż kanałów ułatwiają pozycjonowanie kryształów pod mikroskopem oraz przygotowanie listy próbek do gromadzenia danych. ChipX ma rozmiar standardowego szkiełka przedmiotowego (7,5 cm x 2,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat procesu krystalizacji białek z wykorzystaniem chipa mikroprzepływowego do precyzyjnego mieszania roztworów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie testów krystalizacji w ChipX. 1) Nanieść 5-6 µL roztworów enzymu za pomocą standardowej pipety 10 µL i końcówki. 2) Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzyknąć roztwór do ośmiu kanałów. 3) Nabrać 1 µL oleju parafinowego. 4) Wprowadzić końcówkę pionowo do wlotu próbki i wstrzyknąć olej w celu odseparowania od siebie kanałów. 5) Uszczelnić wlot kawałkiem taśmy. 6) Nabrać 5 µL roztworu krystalizacyjnego za pomocą standardowej pipety 10 µL i końcówki. Roztwory w każdym zbiorniku mogą być różne (np. z zestawu przesiewowego). 7) Skierować końcówkę pipety w stronę wejścia do kanału w lejkowatej części zbiornika (aby uniknąć powstania pęcherzyka powietrza podczas nanoszenia roztworu) i wstrzyknąć roztwór krystalizacyjny do zbiornika. 8) Uszczelnić zbiorniki kawałkiem taśmy i inkubować chip w kontrolowanej temperaturze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces krystalografii na obrazach z mikroskopu; sekwencja wzrostu kryształów, widoczne paski skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kryształy enzymu dodającego CCA, wyhodowane metodą przeciwdyfuzji w kanałach mikrofluidycznych ChipX. Pasek skali wynosi 0.1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat badania wiązania białek, przedstawiający proces pipetowania roztworu liganda na chipie mikromacierzy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Procedura namaczania kryształów. 1) Ostrożnie usuń taśmę z rezerwuarów. 2) Nanieś do 5 µL roztworu liganda za pomocą mikropipety 10 µL. 3) Dodaj ligand do jednego lub kilku rezerwuarów. 4) Ponownie zabezpiecz rezerwuary kawałkiem taśmy i inkubuj chip w kontrolowanej temperaturze przez 24-48 h przed rozpoczęciem zbierania danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment krystalograficzny; obraz mikroskopowy struktur krystalicznych, pokazany schemat cząsteczkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Śladowe znakowanie fluorescencyjne odróżnia kryształy białka (po lewej) od kryształów soli (po prawej). Roztwór enzymu dodającego CCA zawierał 0,4 % (w/w) białka znakowanego karboksyrodaminą. Po prawej stronie kryształy są oświetlone źródłem światła o długości fali 520 nm, a obraz został wykonany z użyciem filtra dolnoprzepustowego 550 nm (LP550); (wstawka) struktura estru sukcynimidylowego karboksyrodaminy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ krystalografii rentgenowskiej, schemat i sprzęt do analizy strukturalnej, badania dyfrakcyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: (Po lewej) Rysunek uchwytu ChipX oraz (po prawej) ChipX zamontowany na goniometrze linii wiązki X06DA w SLS (Villigen, Szwajcaria) do seryjnej analizy kryształów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dopasowanie struktury białka z mapą gęstości elektronowej; wizualizacja oddziaływań aminokwasowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Porównanie centrum aktywnego enzymu dodającego CCA w formie apo (kolor różowy) oraz w kompleksie z analogiem CTP (kolor zielony). Mimo że ogólna konformacja enzymu nie uległa zmianie, wiązanie ligandu CMPcPP wiąże się z niewielką reorganizacją łańcuchów bocznych w centrum aktywnym. Mapa gęstości elektronowej 2Fo-Fc (kolor niebieski) została wyrysowana dla poziomu 1,2 sigma. Mapa różnicowej gęstości elektronowej wyrysowana dla poziomu 4 sigma (kolor zielony) potwierdza obecność ligandu w centrum aktywnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Skrystalizowana próbka</td>
			<td>enzym dodający CCA</td>
			<td>enzym dodający CCA + CMPcPP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analiza kryształów</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linia wiązki promieniowania rentgenowskiego</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość fali (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor</td>
			<td>Pilatus 2M-F</td>
			<td>Pilatus 6M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odległość kryształ-detektor (mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrane kryształy</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wybrane kryształy</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zakres obrotu na obraz (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas ekspozycji na obraz (s)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba wybranych obrazów</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity zakres obrotu (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa przestrzenna</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia mozaikowość (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres rozdzielczości (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba refleksów</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba unikalnych refleksów</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kompletność (%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redundancja</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><img alt="Równanie równowagi statycznej ⟨|σ(l)|⟩, reprezentacja symboliczna, zastosowanie edukacyjne, pojęcie fizyczne." src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpom (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ogólny czynnik B z wykresu Wilsona (Å²)2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Udoskonalenie krystalograficzne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba refleksji, zbiór roboczy / zbiór testowy</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Końcowe Rcryst (%) / Rwolny (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba atomów innych niż wodór: całkowita / białko / ligand / rozpuszczalnik</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odchylenia r.m.s. dla wiązań (Å) / kątów (°)</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnie czynniki B (Å²2): całkowity / białko / ligand / rozpuszczalnik</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wykres Ramachandrana: obszary najbardziej preferowane (%) / dopuszczalne (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Id PDB</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Statystyki zbierania i udoskonalania danych
§ Niezależna od redundancji wartość Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- &lt;I(hkl)&gt;| / ΣhklΣi Ii(hkl), gdzie N oznacza wielokrotność danych 17.
Dane o niskim stosunku &lt;I/σ(I)&gt; w zewnętrznej powłoce (&lt;2.0) zostały uwzględnione na podstawie kryterium CC1/2 (korelacja między dwiema losowymi połowami zbioru danych &gt; 50%), zgodnie z propozycją Karplusa i Diederichsa 18.

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Witam i witam w laboratorium architektury i reaktywności RNA w Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej w Strasburgu. Hodowla dobrze odbijających się kryształów jest krytycznym krokiem w każdym badaniu krystalograficznym. W tym filmie zademonstrujemy zastosowanie nowego narzędzia mikroprzepływowego do hodowli kryształów biomolekuły i określenia jej struktury 3D za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego in situ.Urządzenie mikroprzepływowe o nazwie ChipX ma kilka zalet. Przeznaczony jest do miniaturyzacji i ułatwienia krystalizacji aktywów metodą przeciwdyfuzji. Jego konfiguracja jest łatwa i odbywa się przy użyciu standardowego materiału laboratoryjnego.Jest również zoptymalizowany pod kątem bezpośredniej charakterystyki kryształów wyhodowanych w chipie za pomocą seryjnej krystalografii rentgenowskiej. ChipX eliminuje etapy obsługi kryształów i chłodzenia kriogenicznego oraz zachowuje wewnętrzną jakość kryształów, które są analizowane in situ i w temperaturze pokojowej. ChipX ma format szkiełka mikroskopowego o wymiarach 7,5 na 2,5 centymetra.Zawiera osiem kanałów mikroprzepływowych wykorzystywanych jako komory krystalizacyjne o przekroju 80 na 18 mikrometrów i długości czterech centymetrów. Wlot po lewej stronie umożliwia ręczne wstrzyknięcie roztworu biomolekuły, który wypełni osiem kanałów aż do zbiorników. Roztwory krystalizacyjne są osadzane w tych zbiornikach po prawej stronie.Krystalizacja jest wywoływana przez zjawisko zwane przeciwdyfuzją. Gdy czynnik krystalizujący dyfunduje do roztworu biomolekuły i tworzy gradient stężenia i super nasycenia. Etykiety i bost wzdłuż kanałów pomagają łatwiej zlokalizować kryształy.Ustawienie chipa wymaga od pięciu do sześciu mikrolitrów roztworu biomolekuły o typowym stężeniu od pięciu do 10 miligramów na mililitr. Jeden mikrolitr oleju parafinowego, pięć mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego na zbiornik i taśma klejąca. Ładowanie ChipX odbywa się ręcznie za pomocą mikropipety i standardowych końcówek.W tym przykładzie użyto niebieskiego roztworu próbki w celu lepszej wizualizacji procesu wstrzykiwania. Aby uniknąć wycieków, końcówkę wkłada się do wlotu próbki prostopadle do chipa. Jeden mikrolitr oleju parafinowego jest ładowany za próbką, aby oddzielić kanały od siebie.Wlot próbki jest następnie uszczelniany taśmą. Osiem zbiorników jest ładowanych indywidualnie pięcioma mikrolitrami roztworu środka krystalizującego. W tym celu końcówkę pipety umieszcza się blisko końca kanału pod kątem około 45 stopni.Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza między próbką a czynnikiem krystalizującym. Zbiorniki mogą być napełniane koktajlami zawierającymi różne, polimery lub sole i tak dalej, w celu przesiewania lub optymalizacji. Zbiorniki są uszczelnione taśmą.Jak pokazano tutaj, konfiguracja chipa jest łatwa i zajmuje tylko kilka minut. W ChipX krystalizacja zachodzi przez przeciwdyfuzję. Czynniki krystalizujące zdeponowane w zbiornikach dyfundują do kanałów zawierających biomolekułę.W ten sposób powstają gradienty koncentracji i super nasycenia, które wyzwalają krystalizację. Są to przykłady kryształów enzymu uzyskanego wewnątrz kanałów. Mogą rosnąć, wypełniając kanały o przekroju 80 na 80 mikrometrów.Kryształy są łatwo wykrywalne w ChipX za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystującej naturalną fluorescencję reszt tryptofanu w świetle UV lub, jak pokazano tutaj, przy użyciu białka znakowanego fluorescencyjnie. Ta sekcja przedstawia analizę telegraficzną Chrisa przeprowadzoną w szwajcarskim źródle światła w filaggrins w Szwajcarii. Chipy mogą być przenoszone do synchrotronu bez żadnego dodatkowego wyposażenia czy specjalnej pielęgnacji.Wejdźmy do hali szwajcarskiego źródła światła. Elektrony krążą w centralnym pierścieniu i generują szerokie spektrum fal elektromagnetycznych, w tym promieniowanie rentgenowskie wykorzystywane na różnych liniach badawczych. Film ten został nagrany na X06, która jest linią badawczą dedykowaną krystalografii makromolekularnej.Protokół może się zmieniać w zależności od obiektu synchrotronowego, ale ogólna zasada pozostaje taka sama. ChipX jest zamontowany na uchwycie wydrukowanym w 3D. Uchwyt ten jest następnie przymocowany do magnesu standardowego goniometru.Analiza szeregowa spójna zbiera dane z serii kryształów wyhodowanych w chipie. Listy pozycji kryształów są ustalane za pomocą etykiet i bostów wzdłuż kanałów chipowych. Naukowcy przesuwają chip, aby wyśrodkować kryształy w wiązce promieniowania rentgenowskiego symbolizowanej przez żółte okienko.Uruchamiana jest procedura szybkiego centrowania z wykorzystaniem wiązki promieniowania rentgenowskiego. Ogranicznik wiązki podnosi się na swoje miejsce, a detektor przesuwa się w kierunku próbki. Przesiewanie siatki jest wykonywane w celu upewnienia się, że kryształ jest wyrównany z wiązką.Tę samą procedurę powtarza się po obróceniu chipa o 30 stopni. Drugi krok jest ważny, ponieważ materiał chipa tworzy efekt paralaksy, który prowadzi do przesunięcia maksimum dyfrakcyjnego w stosunku do obserwowanego położenia kryształu. Gdy tylko kryształ zostanie wyśrodkowany w wiązce, rozpoczyna się zbieranie danych.Ta sekwencja pokazuje zbieranie danych w czasie rzeczywistym. Chip obraca się o 30 stopni. W międzyczasie detektor zbiera odpowiednie obrazy dyfrakcyjne.Charakterystyka tego kryształu jest kompletna. Chip przesunął się na następny kryształ w kanale i cała procedura jest powtarzana. Należy zauważyć, że analiza ta jest przeprowadzana in situ bez bezpośredniego kontaktu z kryształem i w temperaturze pokojowej.Dane zebrane na serii kryształów są następnie łączone w celu uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, który jest używany do obliczenia mapy gęstości elektronów, pokazanej na niebiesko, oraz do zbudowania modelu atomowego. Procedura opisana w tym filmie została zastosowana w ramach charakterystyki strukturalnej enzymu modyfikującego tRNA. Enzym dodający CCA z przystosowanej do zimna bakterii, Planococcus halocryophilus.ChipX został użyty do krystalizacji enzymu poprzez przeciwdyfuzję w obecności siarczku amonu jako środka krystalizującego. Kryształy piramidalne pojawiły się wzdłuż kanałów, po kilku dniach inkubacji w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Znakowanie fluorescencyjne białka ułatwiło identyfikację kryształów białka i ich odróżnienie od kryształów soli.Serię kryształów analizowano in situ i w temperaturze pokojowej. Ich dane dyfrakcyjne zostały połączone i doprowadziły do struktury krystalicznej enzymu APOE w rozdzielczości 2,5 angstrema. Ponadto wykorzystano rozproszenie środowiska w kanałach chipowych, aby dostarczyć substrat enzymowi, który buduje kryształy.W omawianym przypadku analog CTP został dodany do roztworów zbiornikowych na dwa dni przed analizą synchrotronową. Pozwoliło to związkowi dyfundować i dotrzeć do katalitycznego miejsca enzymu. Jak widać w strukturze krystalicznej kompleksu wyznaczonej z rozdzielczością 2,3 angstrema.Protokół przedstawiony w tym filmie ma ogólne zastosowanie i został przetestowany na różnych biomolekułach. Podsumowując, ChipX jest laboratoryjnym narzędziem chipowym, które integruje wszystkie etapy badania krystalograficznego i pozwala przejść od roztworu biomedycznego do struktury krystalicznej w unikalnym urządzeniu mikroprzepływowym. Dziękuję za obejrzenie tego filmu.i mamy nadzieję, że przekonaliśmy Cię o korzyściach płynących z używania ChipX do krystalizacji i określania struktury krystalicznej Twoich ulubionych przez Biomolecule.

crystallization-structural-determination-an-enzymesubstrate-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Poznaj krystalizację enzymów w mikroprzepływowym chipie ChipX metodą dyfuzji przeciwprądowej. Technika umożliwia in situ analizę dyfrakcyjną rentgenowską bez konieczności kriochłodzenia i manipulacji kryształami.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym (Wideo) | JoVE Journal

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Przeglądaj więcej filmów