Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Witam i witam w laboratorium architektury i reaktywności RNA w Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej w Strasburgu. Hodowla dobrze odbijających się kryształów jest krytycznym krokiem w każdym badaniu krystalograficznym. W tym filmie zademonstrujemy zastosowanie nowego narzędzia mikroprzepływowego do hodowli kryształów biomolekuły i określenia jej struktury 3D za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego in situ.

Urządzenie mikroprzepływowe o nazwie ChipX ma kilka zalet. Przeznaczony jest do miniaturyzacji i ułatwienia krystalizacji aktywów metodą przeciwdyfuzji. Jego konfiguracja jest łatwa i odbywa się przy użyciu standardowego materiału laboratoryjnego.

Jest również zoptymalizowany pod kątem bezpośredniej charakterystyki kryształów wyhodowanych w chipie za pomocą seryjnej krystalografii rentgenowskiej. ChipX eliminuje etapy obsługi kryształów i chłodzenia kriogenicznego oraz zachowuje wewnętrzną jakość kryształów, które są analizowane in situ i w temperaturze pokojowej. ChipX ma format szkiełka mikroskopowego o wymiarach 7,5 na 2,5 centymetra.

Zawiera osiem kanałów mikroprzepływowych wykorzystywanych jako komory krystalizacyjne o przekroju 80 na 18 mikrometrów i długości czterech centymetrów. Wlot po lewej stronie umożliwia ręczne wstrzyknięcie roztworu biomolekuły, który wypełni osiem kanałów aż do zbiorników. Roztwory krystalizacyjne są osadzane w tych zbiornikach po prawej stronie.

Krystalizacja jest wywoływana przez zjawisko zwane przeciwdyfuzją. Gdy czynnik krystalizujący dyfunduje do roztworu biomolekuły i tworzy gradient stężenia i super nasycenia. Etykiety i bost wzdłuż kanałów pomagają łatwiej zlokalizować kryształy.

Ustawienie chipa wymaga od pięciu do sześciu mikrolitrów roztworu biomolekuły o typowym stężeniu od pięciu do 10 miligramów na mililitr. Jeden mikrolitr oleju parafinowego, pięć mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego na zbiornik i taśma klejąca. Ładowanie ChipX odbywa się ręcznie za pomocą mikropipety i standardowych końcówek.

W tym przykładzie użyto niebieskiego roztworu próbki w celu lepszej wizualizacji procesu wstrzykiwania. Aby uniknąć wycieków, końcówkę wkłada się do wlotu próbki prostopadle do chipa. Jeden mikrolitr oleju parafinowego jest ładowany za próbką, aby oddzielić kanały od siebie.

Wlot próbki jest następnie uszczelniany taśmą. Osiem zbiorników jest ładowanych indywidualnie pięcioma mikrolitrami roztworu środka krystalizującego. W tym celu końcówkę pipety umieszcza się blisko końca kanału pod kątem około 45 stopni.

Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza między próbką a czynnikiem krystalizującym. Zbiorniki mogą być napełniane koktajlami zawierającymi różne, polimery lub sole i tak dalej, w celu przesiewania lub optymalizacji. Zbiorniki są uszczelnione taśmą.

Jak pokazano tutaj, konfiguracja chipa jest łatwa i zajmuje tylko kilka minut. W ChipX krystalizacja zachodzi przez przeciwdyfuzję. Czynniki krystalizujące zdeponowane w zbiornikach dyfundują do kanałów zawierających biomolekułę.

W ten sposób powstają gradienty koncentracji i super nasycenia, które wyzwalają krystalizację. Są to przykłady kryształów enzymu uzyskanego wewnątrz kanałów. Mogą rosnąć, wypełniając kanały o przekroju 80 na 80 mikrometrów.

Kryształy są łatwo wykrywalne w ChipX za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystującej naturalną fluorescencję reszt tryptofanu w świetle UV lub, jak pokazano tutaj, przy użyciu białka znakowanego fluorescencyjnie. Ta sekcja przedstawia analizę telegraficzną Chrisa przeprowadzoną w szwajcarskim źródle światła w filaggrins w Szwajcarii. Chipy mogą być przenoszone do synchrotronu bez żadnego dodatkowego wyposażenia czy specjalnej pielęgnacji.

Wejdźmy do hali szwajcarskiego źródła światła. Elektrony krążą w centralnym pierścieniu i generują szerokie spektrum fal elektromagnetycznych, w tym promieniowanie rentgenowskie wykorzystywane na różnych liniach badawczych. Film ten został nagrany na X06, która jest linią badawczą dedykowaną krystalografii makromolekularnej.

Protokół może się zmieniać w zależności od obiektu synchrotronowego, ale ogólna zasada pozostaje taka sama. ChipX jest zamontowany na uchwycie wydrukowanym w 3D. Uchwyt ten jest następnie przymocowany do magnesu standardowego goniometru.

Analiza szeregowa spójna zbiera dane z serii kryształów wyhodowanych w chipie. Listy pozycji kryształów są ustalane za pomocą etykiet i bostów wzdłuż kanałów chipowych. Naukowcy przesuwają chip, aby wyśrodkować kryształy w wiązce promieniowania rentgenowskiego symbolizowanej przez żółte okienko.

Uruchamiana jest procedura szybkiego centrowania z wykorzystaniem wiązki promieniowania rentgenowskiego. Ogranicznik wiązki podnosi się na swoje miejsce, a detektor przesuwa się w kierunku próbki. Przesiewanie siatki jest wykonywane w celu upewnienia się, że kryształ jest wyrównany z wiązką.

Tę samą procedurę powtarza się po obróceniu chipa o 30 stopni. Drugi krok jest ważny, ponieważ materiał chipa tworzy efekt paralaksy, który prowadzi do przesunięcia maksimum dyfrakcyjnego w stosunku do obserwowanego położenia kryształu. Gdy tylko kryształ zostanie wyśrodkowany w wiązce, rozpoczyna się zbieranie danych.

Ta sekwencja pokazuje zbieranie danych w czasie rzeczywistym. Chip obraca się o 30 stopni. W międzyczasie detektor zbiera odpowiednie obrazy dyfrakcyjne.

Charakterystyka tego kryształu jest kompletna. Chip przesunął się na następny kryształ w kanale i cała procedura jest powtarzana. Należy zauważyć, że analiza ta jest przeprowadzana in situ bez bezpośredniego kontaktu z kryształem i w temperaturze pokojowej.

Dane zebrane na serii kryształów są następnie łączone w celu uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, który jest używany do obliczenia mapy gęstości elektronów, pokazanej na niebiesko, oraz do zbudowania modelu atomowego. Procedura opisana w tym filmie została zastosowana w ramach charakterystyki strukturalnej enzymu modyfikującego tRNA. Enzym dodający CCA z przystosowanej do zimna bakterii, Planococcus halocryophilus.

ChipX został użyty do krystalizacji enzymu poprzez przeciwdyfuzję w obecności siarczku amonu jako środka krystalizującego. Kryształy piramidalne pojawiły się wzdłuż kanałów, po kilku dniach inkubacji w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Znakowanie fluorescencyjne białka ułatwiło identyfikację kryształów białka i ich odróżnienie od kryształów soli.

Serię kryształów analizowano in situ i w temperaturze pokojowej. Ich dane dyfrakcyjne zostały połączone i doprowadziły do struktury krystalicznej enzymu APOE w rozdzielczości 2,5 angstrema. Ponadto wykorzystano rozproszenie środowiska w kanałach chipowych, aby dostarczyć substrat enzymowi, który buduje kryształy.

W omawianym przypadku analog CTP został dodany do roztworów zbiornikowych na dwa dni przed analizą synchrotronową. Pozwoliło to związkowi dyfundować i dotrzeć do katalitycznego miejsca enzymu. Jak widać w strukturze krystalicznej kompleksu wyznaczonej z rozdzielczością 2,3 angstrema.

Protokół przedstawiony w tym filmie ma ogólne zastosowanie i został przetestowany na różnych biomolekułach. Podsumowując, ChipX jest laboratoryjnym narzędziem chipowym, które integruje wszystkie etapy badania krystalograficznego i pozwala przejść od roztworu biomedycznego do struktury krystalicznej w unikalnym urządzeniu mikroprzepływowym. Dziękuję za obejrzenie tego filmu.

i mamy nadzieję, że przekonaliśmy Cię o korzyściach płynących z używania ChipX do krystalizacji i określania struktury krystalicznej Twoich ulubionych przez Biomolecule.