Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie transportera, który jest wystarczająco stabilny do badań strukturalnych, i wykorzystanie tego zmodyfikowanego transportera do wytworzenia kryształów, które ulegają defrakcji do wysokiej rozdzielczości za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii strukturalnej, takie jak sposób rozwiązania struktury białek błonowych, które są ważnymi celami leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do wyboru konformacji związanej z lekiem za pomocą testu funkcjonalnego.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w transportery neuroprzekaźników, może być również stosowana do receptorów, kanałów i rozpuszczalnych białek, które wiążą małe cząsteczki z wysokim powinowactwem. Dokładnie zawiesić trypsonizowane HEK293S GnTI minus komórki w DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą do gęstości 0,5 miliona komórek na mililitr w jednorazowym zbiorniku na pipety. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdego dołka płytki pokrytej poli-D-lizyną.

Po napełnieniu każdej płytki należy ponownie zawiesić komórki w zbiorniku pipety, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla. Wymień pożywkę komórkową na godzinę przed transwekcją.

Przygotuj kompleksy odczynników do transwekcji DNA, mieszając 450 nanogramów DNA z 45 mikrolitrami DMEM bez surowicy dla każdego konstruktu w tle cert TC, który ma być poddany badaniom przesiewowym. Następnie dodaj 1,6 mikrolitra odczynnika transwekcyjnego do 45 mikrolitrów DMEM bez surowicy i wymieszaj. Natychmiast dodać rozcieńczony roztwór odczynnika transwekcyjnego do roztworu DNA i wymieszać.

Nie mieszaj roztworów w odwrotnej kolejności. Odczekaj 10 do 15 minut przed dodaniem 20 mikrolitrów mieszaniny DNA odczynnika transwekcyjnego do czterech studzienek. Inkubować komórki z 200 nanomolowymi citalopramem i 25 mikrolitrami TBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Aby rozpuścić komórki, dodaj 25 mikrolitrów ośmiomilimolowego C12M, jeden milimolowy CHS i koktajl inhibitorów proteazy w TBS. Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów TBS z 20 nanomolowymi trytytowanymi citalopramem, 0,1% albuminą surowicy bydlęcej i miligramami na mililitr jego testu zbliżeniowego powinowactwa do znaczników lub koralików SPA, do trzech studzienek dla każdego konstruktu.

Do ostatniego dołka dodaj ten sam roztwór TBS, ale uzupełnij 100 mikromolową sertraliną, aby określić niespecyficzne wiązanie. Upewnij się, że koraliki SPA o powinowactwie do znaczników są dokładnie wymieszane podczas dodawania ich do płytki 96-dołkowej. Zmierz wiązanie trytiowanego citalopramu za pomocą 96-dołkowego licznika scyntylacyjnego w temperaturze pokojowej z jednominutowym czasem liczenia na dołek.

Kontynuuj liczenie płytek, aż całkowita liczba ustabilizuje się po około 36 godzinach. Po pomiarze podgrzewaj płytki przez 15 minut w bloku grzewczym z podgrzewaną pokrywką w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Zmierzyć ponownie trytiowane wiązanie citalopramu po podgrzaniu.

Powtórz te kroki z modyfikacją etapu ogrzewania. Dostosuj temperatury ogrzewania w zależności od pozornej temperatury topnienia białka docelowego i termostabilności najbardziej stabilnej konstrukcji. Kontynuuj podgrzewanie płyt, aż wszystkie konstrukcje będą miały niską liczbę właściwą.

Hoduj HEK293S komórek GnTI minus w zawiesinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla i 85% wilgotnością na wytrząsarce przy 130 obr./min i 293 pożywkach ekspresyjnych uzupełnionych 2% płodową surowicą bydlęcą. Zainfekuj 10 litrów komórek wirusem P2 przy wielokrotności infekcji wynoszącej dwa i gęstości trzech milionów komórek na mililitr. 12 do 16 godzin po zakażeniu dodać maślan sodu do stężenia 10 milimolów z jednego trzonowca.

48 do 60 godzin po zakażeniu zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 razy G przez 15 minut. Usunąć supernatant. Zawiesić komórki w 150 mililitrach TBS za pomocą 2 mikromolowych escitalopramu lub innych inhibitorów SERT.

komórki z 10 litrów kultury w ciepłej wodzie o temperaturze około 30 stopni Celsjusza i ponownie je zawiesić, szybko przepuszczając komórki przez 10-mililitrową pipetę do uzyskania jednorodności. Dodaj wszystkie komórki do zlewki z mieszadłem i dodaj cały roztwór detergentu do komórek, mieszając. Rozpuszczaj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę, mieszając.

Wiruj lizatem, ile wynosi 8 000 razy G, przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant do czystych ultra probówek wirówkowych i wyrzucić osad. Następnie wirować supernatant w temperaturze 100 000 razy G przez jedną godzinę w ultrawirówce.

Po ultraodwirowaniu przefiltrować supernatant przez filtr 0,2 mikrona i wyrzucić osad. Następnie przepuścić lizat przez 10 mililitrów żywicy powinowactwa do paciorkowców umieszczonych w kolumnie za pomocą pompy perysaltycznej zrównoważonej w buforze do mycia. Następnie podłącz kolumnę powinowactwa do paciorkowca do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i przemyj kolumnę z prędkością dwóch mililitrów na minutę 66 mililitrami buforu do mycia.

Eluować oczyszczone białko w tym samym buforze do płukania uzupełnionym pięcioma milimolowymi destiobiotyną w ilości 0,5 mililitra na minutę przy użyciu 33 mililitrów buforu. Zbierz ułamki jednego mililitra. Frakcje szczytowe wyniosą około 10 mililitrów.

Aby utworzyć kompleksy przeciwciał transportowych, najpierw trawić oczyszczone białko przez noc w temperaturze pokojowej za pomocą trombiny w celu usunięcia znaczników i Endo H w celu deglikozylacji. Skoncentrować białko do stężenia 10 miligramów na mililitr i objętości od 250 do 300 mikrolitrów za pomocą koncentratora białka wirówki o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Wymieszaj skoncentrowane białko SERT z 8B6 Fab w proporcji molowej od jednego do 1,2 w objętości mniejszej niż 500 mikrolitrów.

Odwirować mieszaninę w temperaturze 100 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Po odwirowaniu zebrać supernatant zawierający kompleks SERT Fab i wyrzucić osad. Rozdzielić kompleks za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek na kolumnie wykluczającej wielkość.

Zrównoważ go z uzupełnionym TBS w ilości 0,5 mililitra na minutę. Przed krystalizacją należy skoncentrować frakcje pikowe z oddzielenia kompleksu do dwóch miligramów na mililitr za pomocą koncentratora białek wirówki o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Absorbancja dwóch AU przy 280 nanometrach jest równa jednemu miligramowi na mililitr.

Dodaj dodatkowe Fab w stosunku jeden do 0,05 kompleksu do darmowego Fab. Dodaj również 10 cytalopramu S wolnego od mikromolów. Po odwirowaniu próbki zebrać supernatant zawierający kompleks SERT Fab i wyrzucić osad.

Ustaw wiszący ekran z 24 studniami w temperaturze czterech stopni Celsjusza zgodnie z tabelą pierwszą w protokole tekstowym. Odpipetować 500 mikrolitrów każdego roztworu zbiornika na niskoprofilowej płytce 24-dołkowej z uszczelniaczem nałożonym na każdą studzienkę. Odpipetować 1,5, 1,75 i dwa mikrolitry kompleksu SERT Fab na 18-milimetrowe szkiełko nakrywkowe ze szkła silikonowanego.

Następnie odpipetować jeden mikrolitr roztworu w zbiorniku na próbkę białka. Monokryształy pojawią się w ciągu około trzech dni i osiągną od 100 do 175 mikrometrów po 14 dniach. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki badań przesiewowych termostabilności w obecności trytiowanego citalopramu.

Wartości temperatury topnienia wykreślone w stosunku do maksymalnego wiązania wykazują mutanty o wysokiej termostabilności i ekspresji. Poniżej przedstawiono krzywe termostabilności dla SERT TC typu dzikiego i trzech pierwszych mutantów, Y110A, I291A i T439S. Ten obraz mikroskopowy pokazuje HEK293S komórek GnTI minus wykazujących ekspresję SERT CC z zieloną fluorescencją obecną na błonie komórkowej.

Chromatografia wykluczająca wielkość detekcji fluorescencji SERT CC wykazuje główny pik przy 15 mililitrach. Analiza przeprowadzona przez SDS-PAGE pokazuje, że pojedynczy gatunek białka jest w dużej mierze wolny od zanieczyszczeń. Przedstawiono reprezentatywne rozdzielenie kompleksów przeciwciał transportowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Główny pik wymykający się na poziomie 11,5 mililitra zawierał zarówno SERT, jak i Fab, jak pokazano na żelu SDS-PAGE. Mikroskopia świetlna kompleksu przeciwciał SERT związanych z citalopramem S po dwóch tygodniach wzrostu pokazuje kryształy w kształcie pryzmatu o wielkości około 100 do 175 mikronów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować mutacje, które stabilizują białko błonowe w potwierdzeniu związanym ligandem i jak ustawiać ekrany krystalizacji z kompleksami przeciwciał białkowych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ligandy są niezbędne do stabilizacji SERT TC i są niezbędne do krystalizacji SERT CC. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób psychicznych, ponieważ SERT jest celem molekularnym wielu leków przeciwdepresyjnych. Po tej procedurze można scharakteryzować funkcję oczyszczonego SERT za pomocą metod biochemicznych i biofizycznych.