Name: Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj metodę termostabilizacji i krystalizacji ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem. Protokół obejmuje ekspresję w komórkach HEK293S, oczyszczanie i tworzenie kompleksów z przeciwciałami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy D. Cawleyowi za stworzenie przeciwciał monoklonalnych. Dziękujemy A. Penmatsa i K. Wang za podzielenie się pomysłami i wiedzą specjalistyczną opracowaną na podstawie transportera dopaminy. L. Vaskalis za pomoc przy rysunkach, H. Owen za pomoc w przygotowaniu manuskryptu i inni członkowie laboratorium Gouaux za pomocne dyskusje. J.A.C. jest wspierany przez stypendium podoktorskie Banting z Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. jest wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Berniemu i Jennifer LaCroute za ich hojne wsparcie, a także za finansowanie z NIH (5R37MH070039). E.G. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

<ol><li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li>
<li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solute+carrier+6+family+of+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li>
<li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li>
<li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li>
<li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li>
<li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688(2015).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li>
<li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+membrane+protein+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li>
<li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+%28EGFP%29+in+BALB%2Fc+mice%3A+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li>
<li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability%3A+a+crystallographer%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Określenie struktury białek błonowych za pomocą technik biofizycznych pozostaje trudnym przedsięwzięciem dla wielu istotnych z medycznego punktu widzenia transporterów, receptorów i kanałów11. Tutaj dzielimy się szczegółową wiedzą specjalistyczną opracowaną w celu określenia struktury ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem. Przewidujemy, że metody te będą przydatne do określania struktur SERT w innych stanach konformacyjnych, a także struktur innych trudnych białek błonowych. Co więcej, opisane tutaj techniki biochemiczne mogą być również wykorzystane do badania funkcji oczyszczonego SERT w detergentach i prawie natywnym środowisku lipidowym.
Krystalizacja SERT opierała się na opracowaniu kilku narzędzi i technik. Po pierwsze, poprawa termostabilności transportera pozwoliła na uzyskanie wariantów SERET, które zachowywały się dobrze w różnych micelach detergentowych po ekstrakcji transportera z membran6. Po drugie, zastosowanie ligandu S-citalopramu o wysokim powinowactwie podczas oczyszczania i krystalizacji jeszcze bardziej poprawiło stabilność i zmniejszyło niejednorodność konformacyjną. Po trzecie, opracowanie systemu ekspresji BacMam7 pozwoliło na produkcję dużych ilości SERT w krótkim okresie 2 tygodni, ułatwiając zarówno immunizację, jak i krystalizację. Wreszcie, opracowanie strategii selekcji przeciwciał o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D, pozwoliło na odkrycie przeciwciała 8B6, które sprzyja dobrze uporządkowanemu pakowaniu kompleksów przeciwciał SERT w kryształy.
Istnieje szereg krytycznych kroków i odczynników, a także typowych problemów, które często występują w całym protokole. Po pierwsze, generowanie wirusa SERT P2 o wysokim mianie może być problematyczne. Dodanie niskich stężeń wirusa P1 w celu wygenerowania wirusa P2, jak opisano w tym protokole, zwykle łagodzi ten problem, aw przypadkach, gdy miano wirusa P2 jest niskie, wirus P3 może być wytwarzany przy użyciu wirusa przy MOI 0,0001. Wirusy o mianie mniejszym niż 1 x 108 cząsteczek wirusa/ml nie powinny być stosowane i prawie zawsze powodują niską wydajność białka. Do ekspresji wybrano HEK293S komórki GnTI, ponieważ nie mają one aktywności N-acetyloglukozaminylotransferazy I, a zatem nie mogą syntetyzować złożonych N-glikanów, zamiast tego wytwarzając tylko N-glikany o wysokiej zawartości mannozy. EndoH rozszczepia glikozylację sprzężoną z N glikanów o wysokiej zawartości mannozy w dwóch miejscach w pętli zewnątrzkomórkowej 2 (EL2), pozostawiając N-acetyloglukozaminę przyłączoną do asparaginy. Trawienie cukrów sprzężonych z N zmniejsza entropię powierzchniową EL2, która jest prawdopodobnie ważna dla krystalizacji. Do wytwarzania przeciwciał do immunizacji należy użyćukładu scalonego SERT. GFP jest wysoce immunogennym12 i nie powinien być używany jako znacznik fuzyjny do generowania przeciwciał, ponieważ jest trudny do całkowitego usunięcia przez SEC. Elastyczny N- i C-koniec SERT również nie został uwzględniony w konstrukcie, aby uniknąć przeciwciał przeciwko tym regionom. Myszy można uodpornić 30 μg odtworzonego białka; Kontynuuj immunizację myszy, aż do momentu, gdy będzie można wykryć wysokie stężenia przeciwciał w surowicy i wytworzyć komórki hybrydoma, jak opisano13. Konstrukt termostabilizowany jest zwykle najlepszym wyborem do immunizacji; Jeśli transporter zachowuje się dobrze i zachowuje aktywność biologiczną po oczyszczeniu, często wystarcza to do wytworzenia przeciwciał. Przeciwciało 8B6 zostało podniesione przeciwko WT SERT. Do krystalizacji należy połączyć i zagęścić tylko frakcje pikowe z SEC zawierające kompleks monodyspersyjny, zgodnie z oceną FSEC. Kryształy SERT-8B6 rosną w wąskim zakresie warunków i istnieje szereg kroków, które należy podjąć, aby rozwiązać problemy związane ze wzrostem kryształów SERT. Baza Tris dostosowana HCl nie powinna być stosowana w roztworze zbiornikowym, ponieważ bufor ten nie wspomaga wzrostu kryształów; dlatego tak ważne jest, aby zamiast tego stosować Tris dostosowany za pomocą NaOH. Kryształy SERT rosną w wąskim zakresie stężeń PEG 400, więc jeśli kryształy nie rosną lub jeśli obserwuje się wiele małych kryształów, zaleca się nawet niewielki wzrost lub spadek stężenia PEG 400. Co więcej, dodatek kwasu 6-aminoheksanowego został również wykorzystany w zoptymalizowanym badaniu przesiewowym w celu poprawy zarodkowania. Stosunek kropli roztworu białko do studni jest również kluczowym czynnikiem decydującym o wzroście kryształów. Zalecane są proporcje kropli 1,5 - 2:1, przy czym proporcje kropli bliższe 2:1 zazwyczaj wspierają wzrost większych trójwymiarowych kryształów. Wreszcie, zastosowanie niskoprofilowych płytek 24-dołkowych ma również kluczowe znaczenie dla wzrostu kryształów, prawdopodobnie ze względu na modyfikację szybkości dyfuzji pary.
Opracowano alternatywne podejście do metody SPA w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku mutantów, które stabilizują szczurzy transporter serotoniny w konformacji związanej z kokainą przy użyciu testu wiązania filtra5. W przeciwieństwie do tego, test oparty na SPA pozwala na sekwencyjne etapy ogrzewania następujące po określeniu frakcji SERT, która pozostaje związana z ligandem. Pozwala to na szybkie określenie temperatury topnienia na podstawie niewielkiej liczby próbek. Metoda SPA opiera się na dostępności znakowanego radioaktywnie liganda o wysokim powinowactwie, a jeśli nie są znane żadne ligandy, które wiążą się z powinowactwem submikromolowym, konieczne będzie alternatywne podejście. Wiele innych metod jest powszechnie stosowanych do pomiaru stabilności białek, takich jak wiązanie barwników fluorescencyjnych i kalorymetria14 , ale są one niskoprzepustowe i albo nie są w stanie bezpośrednio mierzyć funkcji, albo wymagają dużych ilości białka. Jeżeli nie można zastosować metody SPA, jednym z alternatywnych podejść o wysokiej przepustowości jest test termostabilności15 oparty na FSEC (FSEC-TS), w którym próbka jest podgrzewana, a następnie oddzielana jest frakcja pozostałego transportera. FSEC-TS jest użytecznym podejściem do uzyskiwania dostępu do zachowania chromatograficznego i stanu oligomerycznego oraz jest potężnym narzędziem uzupełniającym, które może być stosowane wraz z metodą SPA.
Stwierdzono również, że porównanie różnych powszechnych systemów ekspresji białek sprzyja wykorzystaniu komórek ssaków do ekspresji SERT16 i, co nie jest zaskakujące, jest to prawdopodobne w przypadku wielu białek pochodzenia ssaków. Metody, których użyliśmy do odciągania pokarmu, zostały dostosowane do SERC, ale prawdopodobnie można je łatwo dostosować. Warunki, które sprzyjają wysokim poziomom ekspresji, powinny być starannie zidentyfikowane poprzez zmianę czasu ekspresji, temperatury, stężenia wirusa i obecności inhibitorów deacetylazy histonowej, takich jak maślan sodu.
Generalnie zalecamy oczyszczanie powinowactwa w łagodnym detergentie o długich łańcuchach, takim jak C12M, wraz z CHS przed rozpuszczeniem, aby zachować wiązanie ligandów o wysokim powinowactwie. Rekonstytucja przy użyciu absorpcji hydrofobowej jest łagodną techniką, która okazała się skuteczna w przypadku kilku innych transporterów i receptorów. Jeśli to się nie powiedzie, można zastosować usuwanie detergentów o wysokich krytycznych stężeniach miceli za pomocą dializy, rozcieńczania lub SEC17 pod warunkiem, że antygen jest wystarczająco stabilny w takich detergentach. W przypadkach, gdy nie znaleziono odpowiednich przeciwciał, prawie zawsze stwierdzamy, że problem jest spowodowany utratą funkcji lub denaturacją antygenu i w takich przypadkach z powodzeniem przeprowadziliśmy nowe immunizacje, zwracając szczególną uwagę na biochemię białek. Wreszcie, ligandy i przeciwciała, które wiążą się z wysokim powinowactwem, powinny stanowić podstawę do racjonalnie zaplanowanego eksperymentu krystalizacji, a wykorzystując wariant termostabilny, można przebadać szerszy zakres warunków, zmieniając właściwości różnych detergentów. Ponadto krystalizacja w mezofazielipidowej 18 lub przy użyciu biceli19 powinna być zawsze brana pod uwagę jako alternatywa dla krystalizacji w miceli.
Te zasady i metody mogą być stosowane z pewnymi modyfikacjami dla wielu innych białek transbłonowych, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia z innych gospodarzy ekspresyjnych, i będą szczególnie przydatne do określania struktury celów leków o wysokim powinowactwie.

Transporter serotoniny (SERT) jest integralnym białkiem błonowym, które ułatwia transport serotoniny przez błony komórkowe1. SERT należy do rodziny symporterów neuroprzekaźników sodu (NSS), która obejmuje również transportery dopaminy i noradrenaliny2. SERT jest celem molekularnym powszechnie przepisywanych leków przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych, które działają w celu konkurencyjnego hamowania transportu serotoniny3. SERT wykorzystuje energetycznie korzystny kotransport sodu do usuwania neuroprzekaźnika ze szczeliny synaptycznej. Obszerna charakterystyka układu serotoninergicznego wykazała, że zmiany w metabolizmie serotoniny wydają się wpływać na praktycznie wszystkie procesy neurologiczne, w tym nastrój, sen, ból, funkcje poznawcze i zachowaniaagresywne. Funkcja SERT może być modyfikowana poprzez stosowanie leków przeciwdepresyjnych i selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI), takich jak S-citalopram, a także przez psychostymulanty i narkotyki uzależniające, takie jak amfetamina i 3,4-metylenodioksy-N-metyloamfetamina lub "ecstasy"1,2.
SSRI są niezwykle ważne w leczeniu zaburzeń nastroju, jednak dokładne strukturalne podstawy ich działania nie są dobrze poznane. WT SERT jest niestabilny w micelach detergentowych, co utrudnia postęp w kierunku trójwymiarowej (3D) struktury SERT5,6. Ostatnio opracowaliśmy warianty Sert , które są solidnie stabilne w szerokiej gamie detergentów i zachowują aktywność wiążącą SSRI6. Te termostabilne warianty SERT zostały wybrane za pomocą scyntylacyjnego testu termostabilności opartego na bliskości. Tutaj opisujemy procedurę wytwarzania przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą wiązać SERT, oraz oczyszczania i krystalizacji termostabilnego SERT w kompleksie z przeciwciałem i S-citalopramem.
Ten protokół zakłada, że geny SERT i 8B6 zostały pomyślnie sklonowane odpowiednio do wektorów ekspresyjnych BacMam7 i owadów. Aby wytworzyć przeciwciała, reszty kodujące cDNA 73-616 WT SERT sklonowano do wektora BacMam za pomocą C-końcowego znacznika Strep II (SERTIC). Do badania termostabilności użyto pozostałości SERT 73-616 z C-końcowym GFP, Strep II i znacznikami 10-His (SERTTC). Poszczególne mutacje punktowe zostały wygenerowane w tle SERTTC. Do protokołu krystalizacji białko fuzyjne SERT-GFP zastosowano ze znacznikami Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys(GlyGlyGlySer)2GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] i 10-His, przenoszącymi termostabilne mutanty, Y110A, I291A i T439S oraz mutacje cystein powierzchniowych C554A, C580A i C622A (SERTCC). Sekwencje rozszczepienia trombiny (LVPRGS) zostały również wprowadzone do SERTCC po Q76 i T618, aby umożliwić usunięcie N- i C-końców. Plazmid kodujący 8B6 Fab został zaprojektowany do ekspresji zarówno ciężkich, jak i lekkich łańcuchów przeciwciała z sekwencjami wydzielania GP67 pod kontrolą dwóch oddzielnych promotorów poliedryny. C-koniec ciężkiego łańcucha przeciwciała 8B6 został oznaczony znacznikiem 8-His, a miejsce rozszczepienia trombiny zostało wprowadzone między ciężki łańcuch a znacznik.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td></td><td>Fisher BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-bromo-3-indolyl &beta;-D-galaktopiranozyd</td></tr><tr><td>izopropylowy beta-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Odczynnik do transfekcji Sf9</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 media ekspresyjne</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-dodecyl-beta-D-maltopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Hemibursztynian cholesterolu</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Lipid polarny mózgu</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrofobowa żywica absorpcyjna</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Stosowana jako przeciwciało wtórne dla western blot</td></tr><tr><td>Lauryl maltoza glikol neopentylowy</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonina</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Dostępne u autorów</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-oktyl &beta;-D-maltozyd</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris służy do przygotowania zbiorników krystalizacyjnych:</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-aminoheksanowy</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Odczynnik do transfekcji polimerów do komórek sutkowych</td></tr><tr><td>Miedziane koraliki HIS-Tag YSI SPA</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity Koraliki SPA</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Metylo-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>blok grzewczy do oznaczania termostabilności</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, termoblok do płytek PCR</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>System filtracyjny 1 L</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L płaskodenna kolba do hodowli tkankowych</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr> 2 <tr><td>L z przegrodą</td> Inkubator <td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Strep-Tactin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td> Wytłaczarka <td>żywicy powinowactwa do paciorkowców</td></tr><tr><td>System obrazowania Northern</td><td></td> Lipids <td></td>Li-Cor System obrazowania Western Blot Odyssey <td></td> Kolumna</tr><tr><td></td><td></td> XK16 Kolumna GE Healthcare 28-9889-37 używana do oczyszczania Strep-Tactin i Talon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator białka MWCO 100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa koncentrator białka MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Używana do</td></tr><tr><td>aparatu FSEC z przepływem stycznym</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m filtr styczny komora przepływowa</td> Koncentrator przepływu stycznego <td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO</td><td>Żywica Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>Żywica powinowactwa His-tag używana do oczyszczania Fab</td></tr><tr><td>Kolumna HiTrap SP 1 ml</td><td>Wymiennik kationowy GE Healthcare 17115101 używany do oczyszczania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fab Kolumna Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Służy do separacji SEC</td></tr><tr><td>24-dołkowej płytki VDXm</td> SERT-8B6 <td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Licznik wirusów Virocyt</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-dołkowy licznik scyntylacyjny</td></tr><tr><td>Kolumna HiTrap SP</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z s-citalopramem

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Transporter serotoniny to transporter sprzężony z sodem i chlorkiem, który "pompuje" zewnątrzkomórkową serotoninę do komórek. S-citalopram jest lekiem stosowanym w leczeniu depresji i lęku poprzez wiązanie się z transporterem serotoniny o wysokim powinowactwie, blokującym wychwyt zwrotny serotoniny. Tutaj przedstawiamy skuteczną procedurę i zestaw narzędzi do stabilizacji, ekspresji, oczyszczania i krystalizacji kompleksów transporter-przeciwciało serotoniny związanych z S-citalopramem i innymi lekami przeciwdepresyjnymi. Mutacje, które stabilizują transporter serotoniny, zidentyfikowano za pomocą testu wiązania S-citalopramu. Transporter serotoniny ulegający ekspresji w komórkach GnTI transduk HEK293S owanych przez bakulowirusa został odtworzony w proteoliposomach i wykorzystany do wytworzenia przeciwciał o wysokim powinowactwie. Opracowaliśmy strategię odkrywania przeciwciał, które są przydatne w badaniach strukturalnych. Ustalono również proste podejście do ekspresji fragmentów przeciwciał w komórkach Sf9. Oczyszczone za pomocą tej procedury kompleksy transporter-przeciwciało zachowują się dobrze i łatwo krystalizują, wytwarzając kompleksy z S-citalopramem, które załamują promieniowanie rentgenowskie do rozdzielczości 3-4 A. Opracowane w ten sposób strategie można wykorzystać do określenia struktury innych trudnych białek błonowych.

W celu poszukiwania mutacji termostabilizujących stworzono bibliotekę mutantów punktowych w tle SERTTC. Pojedyncze mutanty wygenerowano za pomocą standardowej mutogenezy. Protokół przesiewowy wykorzystuje przejściowo transfektowane komórki HEK293S oraz test termostabilności oparty na bliskościowej licznicy scyntylacyjnej, aby szybko zidentyfikować mutacje przydatne do krystalizacji, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1A. Wykres zależności wartości Tm od ilości związanego [3H]citalopramu w RT pozwala zidentyfikować konstrukty o wysokiej termostabilności i poziomach ekspresji odpowiednich do oczyszczania białka (Rysunek 1B). Trzy mutanty (Y110A, I291A i T439S) połączono w celu otrzymania wysoce stabilnego konstruktu (Rysunek 1C). Termostabilność koreluje również ze zwiększoną stabilnością w detergentach o krótkim łańcuchu, które są niezbędne do krystalizacji kompleksu SERT-Fab.
Ekspresja ludzkiego białka SERT na dużą skalę z wykorzystaniem komórek HEK293S GnTI- transdukowanych bakulowirusem może zająć mniej niż 2 tygodnie i pozwolić na uzyskanie ilości rzędu miligramów, co zilustrowano na Rysunku 2A. Zastosowanie białka SERTCC znakowanego GFP umożliwia wygodne śledzenie procesu ekspresji i oczyszczania SERT za pomocą fluorescencji (Rysunek 2B). Nasza strategia oczyszczania obejmowała: 1) solubilizację SERT związanego z S-citalopramem z komórek HEK293S GnTI- w C12M w obecności CHS jako lipidu stabilizującego; 2) wiązanie SERT z macierzą powinowactwa Strep; 3) usuwanie zanieczyszczających białek poprzez intensywne przemywanie; oraz 4) elucję funkcjonalnego białka SERT buforem zawierającym desthiobiotynę (Rysunek 2C). Eluowane białko jest w dużej mierze wolne od innych wykrywalnych białek w barwieniu błękitem Coomassie i jest monodyspersyjne w ocenie metodą FSEC (Rysunek 2D, E).
Podobną strategię zastosowano w celu oczyszczenia SERT z tagiem Strep II, który został wykorzystany do rekonstytucji i immunizacji (Rysunek 3A, B). Włączenie SERT do proteoliposomów zwiększa okres półtrwania w surowicy oraz stabilność SERT i poprawia prawdopodobieństwo izolacji przeciwciał o wysokim powinowactwie. Ponadto dodatek lipidu A, składnika bakteryjnej ściany komórkowej, służy jako silny adiuwant9. Liposomy wielowarstwowe przygotowano poprzez dodanie buforu do wysuszonej mieszaniny lipidów w probówkach szklanych, a następnie resuspensowano w buforze. Ekstruzja liposomów przez filtry o rozmiarze porów 200 nm pozwala na otrzymanie monodyspersyjnych zawiesin liposomalnych jednowarstwowych. Następnie liposomy nasyca się detergentem, po czym dodaje oczyszczony SERT w detergencie. Na koniec detergent usuwa się poprzez dodanie hydrofobowej żywicy absorpcyjnej do mieszaniny lipid:detergent. Do zrekonstytuowanej próbki należy dodać dodatkowy ligand, aby wyselekcjonować przeciwciała rozpoznające konformację związaną z lekiem przeciwdepresyjnym. Obecność SERT w proteoliposomach należy potwierdzić, solubilizując niewielką próbkę za pomocą barwnika do SDS-PAGE lub C12M, a następnie poddając ją analizie SDS-PAGE oraz FSEC (Rysunek 3C, D).
Linie komórkowe hybridoma wykazujące ekspresję przeciwciał przeciwko SERT można przesiewać w celu wyłonienia wiązań o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D. Właściwości te są kluczowe dla końcowego sukcesu krystalizacji, ponieważ przeciwciało musi pozostać silnie związane ze ustrukturyzowanym regionem, aby promować upakowanie kryształów jednorodnych, dobrze uporządkowanych domen. W pierwszym kroku identyfikuje się przeciwciała rozpoznające regiony nieustrukturyzowane. Białko SERT jest denaturowane i przenoszone na membranę nitrocelulozową; przeciwciała wiążące denaturowane SERT będą pozytywne w analizie western i prawdopodobnie rozpoznają epitopy liniowe. Na Ryc. 4A przedstawiamy 2 przykłady przeciwciał, które są pozytywne w analizie western i prawdopodobnie nie będą użyteczne w promowaniu krystalogenezy. Na Ryc. 4B pozostałe przeciwciała negatywne w analizie western inkubuje się z 100 nM SERT-GFP, a następnie rozdziela metodą FSEC. Przeciwciała wiążące SERT przesuną pik pozytywny dla GFP na wcześniejszą pozycję. Kompleksy SERT-przeciwciało można dalej rozcieńczać w detergencie, aby określić, czy wykazują powinowactwo nanomolarne, co następnie analizuje się za pomocą FSEC. Dodatek serotoniny powoduje zmiany konformacyjne w transporterze, w związku z czym przeciwciała można przesiewać ponownie, aby ustalić, czy potrafią one specyficznie rozpoznawać konformację związaną z SSRI. Na Ryc. 4C pokazano, że przeciwciała wiążą SERT w obecności serotoniny, co wskazuje, że epitop(y) nie zmieniają się przy przejściu ze stanu związanego z SSRI do stanu związanego z substratem. Na koniec, na Ryc. 4D testuje się kombinacje przeciwciał pod kątem ich zdolności do wiązania odrębnych epitopów, co skutkuje dalszym przesunięciem w lewo. W tym przypadku przeciwciała 15B8 lub 8A11 rozpoznają epitop inny niż 8B6.
Przeciwciało 8B6 wybrano do dalszej analizy strukturalnej na podstawie wstępnego przesiewu krystalograficznego z użyciem Fab traktowanego papainą. Geny Fab 8B6 sklonowano do wektora ekspresyjnego dla komórek owadów. Fab może być ekspresowany i wydzielany przez komórki Sf9 hodowane w zawiesinie. Fab 8B6 można oczyścić z supernatantu komórek Sf9 za pomocą chromatografii powinowactwa do znaczników His (Rycina 5A, B) oraz chromatografii wymiany kationowej (Rycina 5C, D), co pozwala uzyskać białko wolne od zanieczyszczeń w analizie SDS-PAGE. Na Rycini 5E pokazano, że rekombinowany Fab 8B6 wiąże SERT i jest wykorzystywany w kolejnych eksperymentach biochemicznych i biofizycznych.
Oczyszczony metodą powinowactwa SERTCC jest trawiony trombiną i EndoH, a następnie mieszany z fragmentem Fab 8B6 w obecności S-citalopramu w celu utworzenia kompleksu. Kompleks transporter-przeciwciało jest następnie rozdzielany za pomocą SEC w C8M (Rysunek 6A), a frakcje szczytowe zawierają zarówno SERT, jak i Fab, co potwierdzono za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 6B). Zastosowanie C8M jest kluczowe dla formowania kryształów, prawdopodobnie dlatego, że detergent o krótkim łańcuchu umożliwia lepsze upakowanie cząsteczek w sieci krystalicznej. FSEC jest wykorzystywane do określenia, które frakcje należy połączyć do krystalizacji (Rysunek 6C); frakcje, które nie są monodyspersyjne i/lub zawierają duże ilości wolnego SERT lub Fab, nie powinny być łączone.
Kryształy przeciwciał anty-SERT o kształcie pryzmatów można hodować w obecności S-citalopramu, stosując niniejszy protokół metodą dyfuzji pary w kropli wiszącej (Rysunek 7A). Powstałe kryształy dyfrakują promienie X do rozdzielczości 3.15 Å10 (Rysunek 7B).
<img alt="Analiza stabilności termicznej mutantów SERT; A: schemat procesu, B: wykres Tm w funkcji wiązania, C: wykres wiązania w funkcji temperatury." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza thermostabilności oparta na metodzie bliskości scyntylacyjnej. A. Przegląd protokołu przesiewania thermostabilności w obecności [3H]citalopramu. B. Maksymalne wiązanie [3H]citalopramu w funkcji pozornej temperatury topnienia (Tm). Linie przerywane reprezentują wartości dla transportera WT. Oznaczono 3 najbardziej thermostabilne mutanty. Szary obszar reprezentuje mutanty, które wykazują mniej niż 10% wiązania [3H]citalopramu w stosunku do WT, a co za tym idzie, mają niedokładne wartości Tm ze względu na niski stosunek sygnału do szumu. C. Krzywe thermostabilności dla WT SERTTC i 3 najlepszych mutantów. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (S.D.). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="System ekspresji bakulowirusowej; schemat procesu ekspresji białka, mikroskopia fluorescencyjna, wyniki chromatografii, SDS-PAGE, analiza widm fluorescencji." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przegląd heterologicznej ekspresji białek ssaczych. A. Schematyczny przegląd generowania wirusa BacMam i ekspresji SERT w komórkach HEK293S GnTI-. B. Komórki HEK293S GnTI- eksponujące SERTCC (fluorescencja GFP). C. Profil elucji SERTCC na żywicy powinowactwa Strep. Zielona linia reprezentuje stężenie desthiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). D. Analiza oczyszczonego metodą powinowactwa SERTCC na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. E. FSEC oczyszczonego metodą powinowactwa SERTCC wykrytego za pomocą fluorescencji GFP (Wzbudzenie: 480 nm; Emisja: 510 nm). Pik eluujący przy 15 mL to SERT (#), a przy 18 mL to wolne GFP (*). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rekonstytucja liposomów, insercja SERT, proces immunizacji; chromatogram, elektroforeza w żelu, wykres fluorescencji." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywna oczyszczanie powinowactwem i rekonstytucja SERTIC. A. Schematyczny przegląd generowania przeciwciał. B. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania powinowactwem SERTIC na żywicy powinowactwa Strep. Zielona linia reprezentuje stężenie desthiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). C. Analiza oczyszczonego powinowactwem i rekonstytuowanego SERT na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. D. FSEC solubilizowanego SERT po rekonstytucji. Do detekcji SERT wykorzystano fluorescencję reszt tryptofanu (Wzbudzenie: 280 nm; Emisja: 335 nm). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy western blot i chromatograficzne; analiza białek; fluorescencja w funkcji objętości; testy SERT." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza reprezentatywnych przeciwciał przeciwko SERT. A. Przesiewanie przeciwciał metodą western blot. Około 1 µg SERTCC z GFP lub bez GFP naniesiono na żel SDS-PAGE 4 - 15% i przeniesiono na membranę nitrocelulozową. Wiązanie wykryto przy użyciu koziego przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom sprzężonego z barwnikiem IR. 2G4 i 10F2 wykazują pozytywny wynik w metodzie western blot. B. Wiązanie przeciwciał do 100 nM SERT znakowanego GFP i detekcja metodą FSEC z wykorzystaniem fluorescencji GFP. C. Wiązanie wybranych fragmentów Fab do 100 nM SERT znakowanego GFP w obecności 1 mM serotoniny. D. Wiązanie fragmentów Fab 8A11 lub 15B8 do SERT-8B6 Fab. Małe piki eluujące przy 18 mL to wolne GFP. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Żele SDS-PAGE, wykresy chromatograficzne, analiza fluorescencyjna wyników oczyszczania białek." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne oczyszczanie Fab 8B6 z komórek Sf9. A. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania Fab 8B6 za pomocą chromatografii powinowactwa do znaczników His. Zielona linia reprezentuje stężenie imidazolu, 0 - 50% (0 - 250 mM). B. Żel SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i redukujących po oczyszczaniu powinowactwem do znaczników His. Białko wędrujące w pobliżu 50 kDa to nieredukowany Fab (#), a mniejsza frakcja przy 25 kDa to zredukowany Fab (*). C. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania Fab 8B6 za pomocą wymiany kationowej, wykazujący pojedynczy symetryczny pik eluujący w liniowym gradiencie chlorku sodu. Zielona linia reprezentuje stężenie NaCl, 0 - 100% (0 - 500 mM). D. Analiza Fab 8B6 na żelu SDS-PAGE 12,5% po oczyszczaniu metodą wymiany kationowej. E. Wiązanie Fab 8B6 z 10 nM SERT z tagiem GFP, wykryte przy użyciu fluorescencji GFP. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; A: Wykres absorbancji; B: Żel białkowy; C: Wykres fluorescencji; analiza SERT." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywna chromatografia żelowa kompleksu SERT-8B6 w obecności S-citalopramu. A. Profil elucji z chromatografii żelowej oczyszczonego kompleksu SERT-8B6. Główny pik eluujący przy 11,5 mL to kompleks SERT-8B6. Pik w zakresie 15 - 17 mL zawiera GFP i Fab. B. Analiza oczyszczonego kompleksu SERT-8B6 na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. Pozycje SERT oraz ciężkich i lekkich łańcuchów Fab są zaznaczone kreską. C. FSEC frakcji rozdzielonych według wielkości. Kompleksy SERT-8B6 wykryto przy użyciu fluorescencji tryptofanu. Frakcja 17 zawiera większą ilość SERT, który nie utworzył kompleksu z Fab. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki krystalizacji białek i dyfrakcji rentgenowskiej; kryształy na obrazie z mikroskopu, wzór dyfrakcyjny." src="/files/ftp_upload/54792/54792fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Krystalizacja kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopramem. A. Mikroskopia świetlna kryształów kompleksu SERT-8B6 o kształcie prostopadłościanów po 2 tygodniach wzrostu. Pasek skali odpowiada 200 µm. B. Kryształy SERT-8B6 dyfrakują promienie X do rozdzielczości 3.15 Å. Niebieski pierścień reprezentuje 3.15 Å. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Przesiew krystalizacji dla kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopramem. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie transportera o stabilności wystarczającej do badań strukturalnych oraz wykorzystanie tego zmodyfikowanego transportera do otrzymania kryształów ulegających dyfrakcji o wysokiej rozdzielczości w krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej, takie jak sposób rozwiązywania struktury białek błonowych, które stanowią istotne cele terapeutyczne dla leków. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyselekcjonowania konformacji związanej z lekiem przy użyciu testu funkcjonalnego.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat transporterów neurotransmiterów, można ją również zastosować do receptorów, kanałów i białek rozpuszczalnych, które wiążą małe cząsteczki z wysokim powinowactwem. Komórki HEK293S GnTI minus poddane trypsynizacji należy dokładnie resuspendować w medium DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej do gęstości 0,5 miliona komórek na mililitr w jednorazowym zbiorniku do pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej należy nanieść 100 mikrolitrów komórek do każdego dołka płytki powlekanej poli-D-lizyną.Po napełnieniu każdej płytki resuspenduj komórki w zbiorniku pipetującym, aby zapewnić ich równomierne rozmieszczenie. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 8% carbon dioxide. Wymień medium hodowlane na jedną godzinę przed transwekcją.Przygotować kompleksy odczynnika do transwekcji DNA, mieszając 450 nanogramów DNA z 45 mikrolitrami DMEM bez surowicy dla każdego konstruktu w tle cert TC przeznaczonym do przesiewu. Następnie dodać 1,6 mikrolitra odczynnika do transwekcji do 45 mikrolitrów DMEM bez surowicy i wymieszać. Bezzwłocznie dodać rozcieńczony roztwór odczynnika do transwekcji do roztworu DNA i wymieszać.Nie mieszać roztworów w odwrotnej kolejności. Odczekać od 10 do 15 minut przed dodaniem 20 µl mieszaniny DNA odczynnika do transwekcji do czterech studni. Inkubować komórki z 200 nM citalopramem i 25 µl TBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Aby przeprowadzić solubilizację komórek, należy dodać 25 µL roztworu 8 mM C12M, 1 mM CHS oraz koktajlu inhibitorów proteaz w buforze TBS. Komórki należy inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie do trzech dołków dla każdego konstruktu należy dodać 50 µL buforu TBS z 20 nM trytowanym citalopramem, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz mg/ml kulek do testu SPA (scintillation proximity assay) z powinowactwem do znacznika His.Do ostatniej dołki dodaj ten sam roztwór TBS, lecz uzupełnij go o 100 µM sertraliny w celu określenia wiązania nieswoistego. Upewnij się, że kuleczki SPA z powinowactwem do znaczników His są dokładnie wymieszane przed dodaniem ich do płytki 96-dołkowej. Pomiar wiązania trytylowanego citalopramu przeprowadź za pomocą licznika scyntylacyjnego do płytek 96-dołkowych w temperaturze pokojowej, przy czasie zliczania jednej minuty na dołek.Kontynuuj zliczanie płytek, aż całkowita liczba osiągnie plateau w około 36 godzinie. Po dokonaniu pomiaru inkubuj płytki przez 15 minut w bloku grzewczym z podgrzewaną pokrywą w temperaturze 33 °C. Po podgrzaniu ponownie zmierz wiązanie trytylowanego citalopramu.Powtórz te kroki, modyfikując etap ogrzewania. Dostosuj temperatury ogrzewania w zależności od pozornej temperatury topnienia białka docelowego oraz termostabilności najstabilniejszego konstruktu. Kontynuuj ogrzewanie płytek, aż wszystkie konstrukty wykażą niskie zliczenia swoiste.Hodować komórki HEK293S GnTI minus w zawiesinie w temperaturze 37 °C przy 8% CO2 i 85% wilgotności na wytrząsarce przy 130 RPM w pożywce do ekspresji 293 uzupełnionej o 2% płodowej surowicy bydlęcej. Zainfekować 10 litrów komórek wirusem P2 przy wielokrotności infekcji (MOI) równej dwa i gęstości trzech milionów komórek na ml. Od 12 do 16 godzin po infekcji dodać maślan sodu do stężenia 10 mM z roztworu stokowego o stężeniu 1 M.Od 48 do 60 godzin po infekcji zebrać komórki poprzez wirowanie przy 4 000 ×g przez 15 minut. Usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 150 ml TBS z 2 µM escitalopramu lub innych inhibitorów SERT.komórki z 10 litrów hodowli w ciepłej wodzie o temperaturze około 30 stopni Celsjusza i resuspenduj je, szybko przepuszczając przez pipetę 10 mililitrów, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Przenieś wszystkie komórki do zlewki z mieszadełkiem magnetycznym i dodaj do nich cały roztwór detergentu podczas mieszania. Solubilizuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę przy ciągłym mieszaniu.Wiruj lizat z prędkością 8,000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej nadsącz do czystych probówek do ultrawirówki, a osad odrzuć. Następnie wiruj nadsącz z prędkością 100,000 ×g przez jedną godzinę w ultrawirówce.Po ultrawirowaniu przefiltruj nadsącz przez filtr 0,2 mikrona, a osad odrzuć. Następnie przepuść lizat przez 10 mililitrów żywicy do powinowactwa strep zapakowanej w kolumnę przy użyciu pompy perystaltycznej, uprzednio równoważonej w buforze płuczącym. Następnie podłącz kolumnę do powinowactwa strep do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i wypłucz kolumnę z prędkością dwóch mililitrów na minutę, używając 66 mililitrów buforu płuczącego.Eluuj oczyszczone białko w tym samym buforze do płukania uzupełnionym o 5 mM desthiobiotyny z prędkością 0,5 ml/min, wykorzystując 33 ml buforu. Zbieraj frakcje o objętości 1 ml. Frakcje szczytowe będą miały objętość około 10 ml.Aby utworzyć kompleksy białka transporterowego z przeciwciałem, najpierw poddać oczyszczone białko trawieniu przez noc w temperaturze pokojowej przy użyciu trombiny w celu usunięcia znaczników oraz Endo H w celu deglikozylacji. Skoncentrować białko do stężenia 10 mg/ml i objętości od 250 do 300 µl, korzystając z wirówki z koncentratorem białek o progu odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa. Wymieszać skoncentrowane białko SERT z Fab 8B6 w stosunku molowym 1:1,2 w objętości poniżej 500 µl.Odwiruj mieszaninę z prędkością 100 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po wirowaniu zbierz nadsącz zawierający kompleks SERT Fab, a osad odrzuć. Wyizoluj kompleks, stosując szybką chromatografię cieczową białek na kolumnie do wykluczania wielkości.Równoważ zestaw z uzupełnionym TBS przy przepływie 0,5 mililitrów na minutę. Przed krystalizacją zagęść frakcje szczytowe z rozdziału kompleksu do stężenia dwóch miligramów na mililitr, używając wirówkowego koncentratora białek z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Absorbancja równa 2 AU przy 280 nanometrach odpowiada stężeniu jednego miligrama na mililitr.Dodaj dodatkowy Fab w stosunku jednego kompleksu do 0,05 wolnego Fab. Dodaj również 10 µM wolnego S-citalopramu. Po odwirowaniu próbki zbierz nadsącz zawierający kompleks SERT Fab, a osad odrzuć.Przygotuj przesiewanie metodą wiszącej kropli w płytce 24-dołkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza zgodnie z tabelą 1 w protokole tekstowym. Pipetuj 500 µl każdego roztworu z rezerwuaru do niskoprofilowej płytki 24-dołkowej z zastosowaniem uszczelniacza w każdym dołku. Pipetuj 1,5, 1,75 oraz 2 µl kompleksu SERT Fab na 18 mm sylikonizowane szkiełko nakrywkowe.Następnie należy nanieść pipetą 1 µL roztworu rezerwuarowego na górną powierzchnię próbki białka. Pojedyncze kryształy pojawią się w ciągu około trzech dni i urosną do rozmiarów od 100 do 175 µm po 14 dniach. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla badania termostabilności w obecności trytylowanego citalopramu.Wartości temperatury topnienia naniesione na wykres w funkcji maksymalnego wiązania wskazują mutanty o wysokiej termostabilności i ekspresji. Przedstawiono tutaj krzywe termostabilności dla SERT TC typu dzikiego oraz trzech najlepszych mutantów: Y110A, I291A i T439S. Ten obraz mikroskopowy przedstawia komórki HEK293S GnTI minus wykazujące ekspresję SERT CC z zieloną fluorescencją obecną na błonie komórkowej.Chromatografia wykluczania z detekcją fluorescencyjną SERT CC wykazuje główny pik przy 15 ml. Analiza metodą SDS-PAGE wykazuje pojedynczy gatunek białka w znacznym stopniu wolny od zanieczyszczeń. Przedstawiono reprezentatywny rozdział kompleksów przeciwciał do transportera za pomocą chromatografii wykluczania.Główny pik eluujący przy 11,5 mililitrach zawierał zarówno SERT, jak i Fab, co wykazano na żelu SDS-PAGE. Mikroskopia świetlna kompleksu przeciwciała SERT związanego z S citalopramem po dwóch tygodniach wzrostu ukazuje kryształy w kształcie pryzmatu o rozmiarach od około 100 do 175 mikronów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować mutacje stabilizujące białko błonowe w konformacji związanej z ligandem oraz jak przygotowywać ekrany krystalizacji dla kompleksów białko-przeciwciało.Przy próbie przeprowadzenia tej procedury należy pamiętać, że ligandy są niezbędne do stabilizacji SERT TC i są kluczowe dla krystalizacji SERT CC. Znaczenie tej techniki wykracza poza aspekty techniczne i ma odniesienie do terapii schorzeń psychiatrycznych, ponieważ SERT jest celem molekularnym wielu leków przeciwdepresyjnych. Po wykonaniu tej procedury funkcję oczyszczonego SERT można scharakteryzować za pomocą metod biochemicznych i biofizycznych.

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Opisano prosty protokół nadekspresji i oczyszczania zoptymalizowanej pod kątem kodonów, ludzkiej cis-prenylotransferazy, w warunkach niedenaturujących, z Escherichia coli, wraz z testem aktywności enzymatycznej. Protokół ten można uogólnić na produkcję innych białek cis-prenylotransferazy w ilości i jakości odpowiednich do badań mechanistycznych.

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Ten artykuł przedstawia szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania syntazy tryptofanu Salmonella typhimurium w tym protokole, szybkim systemie do oczyszczania kompleksu białkowego w ciągu jednego dnia. Omówione metody to mutageneza ukierunkowana na miejsce, ekspresja białek w Escherichia coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia filtracji żelowej i krystalizacja.

Mutageneza PCR, klonowanie, ekspresja, protokoły szybkiego oczyszczania białek oraz krystalizacja typu dzikiego i zmutowanych form syntazy tryptofanu

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Poznaj metodę termostabilizacji i krystalizacji ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem. Protokół obejmuje ekspresję w komórkach HEK293S, oczyszczanie i tworzenie kompleksów z przeciwciałami.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Przeglądaj więcej filmów