Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie transportera o stabilności wystarczającej do badań strukturalnych oraz wykorzystanie tego zmodyfikowanego transportera do otrzymania kryształów ulegających dyfrakcji o wysokiej rozdzielczości w krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej, takie jak sposób rozwiązywania struktury białek błonowych, które stanowią istotne cele terapeutyczne dla leków. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyselekcjonowania konformacji związanej z lekiem przy użyciu testu funkcjonalnego.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat transporterów neurotransmiterów, można ją również zastosować do receptorów, kanałów i białek rozpuszczalnych, które wiążą małe cząsteczki z wysokim powinowactwem. Komórki HEK293S GnTI minus poddane trypsynizacji należy dokładnie resuspendować w medium DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej do gęstości 0,5 miliona komórek na mililitr w jednorazowym zbiorniku do pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej należy nanieść 100 mikrolitrów komórek do każdego dołka płytki powlekanej poli-D-lizyną.

Po napełnieniu każdej płytki resuspenduj komórki w zbiorniku pipetującym, aby zapewnić ich równomierne rozmieszczenie. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 8% carbon dioxide. Wymień medium hodowlane na jedną godzinę przed transwekcją.

Przygotować kompleksy odczynnika do transwekcji DNA, mieszając 450 nanogramów DNA z 45 mikrolitrami DMEM bez surowicy dla każdego konstruktu w tle cert TC przeznaczonym do przesiewu. Następnie dodać 1,6 mikrolitra odczynnika do transwekcji do 45 mikrolitrów DMEM bez surowicy i wymieszać. Bezzwłocznie dodać rozcieńczony roztwór odczynnika do transwekcji do roztworu DNA i wymieszać.

Nie mieszać roztworów w odwrotnej kolejności. Odczekać od 10 do 15 minut przed dodaniem 20 µl mieszaniny DNA odczynnika do transwekcji do czterech studni. Inkubować komórki z 200 nM citalopramem i 25 µl TBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Aby przeprowadzić solubilizację komórek, należy dodać 25 µL roztworu 8 mM C12M, 1 mM CHS oraz koktajlu inhibitorów proteaz w buforze TBS. Komórki należy inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie do trzech dołków dla każdego konstruktu należy dodać 50 µL buforu TBS z 20 nM trytowanym citalopramem, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz mg/ml kulek do testu SPA (scintillation proximity assay) z powinowactwem do znacznika His.

Do ostatniej dołki dodaj ten sam roztwór TBS, lecz uzupełnij go o 100 µM sertraliny w celu określenia wiązania nieswoistego. Upewnij się, że kuleczki SPA z powinowactwem do znaczników His są dokładnie wymieszane przed dodaniem ich do płytki 96-dołkowej. Pomiar wiązania trytylowanego citalopramu przeprowadź za pomocą licznika scyntylacyjnego do płytek 96-dołkowych w temperaturze pokojowej, przy czasie zliczania jednej minuty na dołek.

Kontynuuj zliczanie płytek, aż całkowita liczba osiągnie plateau w około 36 godzinie. Po dokonaniu pomiaru inkubuj płytki przez 15 minut w bloku grzewczym z podgrzewaną pokrywą w temperaturze 33 °C. Po podgrzaniu ponownie zmierz wiązanie trytylowanego citalopramu.

Powtórz te kroki, modyfikując etap ogrzewania. Dostosuj temperatury ogrzewania w zależności od pozornej temperatury topnienia białka docelowego oraz termostabilności najstabilniejszego konstruktu. Kontynuuj ogrzewanie płytek, aż wszystkie konstrukty wykażą niskie zliczenia swoiste.

Hodować komórki HEK293S GnTI minus w zawiesinie w temperaturze 37 °C przy 8% CO2 i 85% wilgotności na wytrząsarce przy 130 RPM w pożywce do ekspresji 293 uzupełnionej o 2% płodowej surowicy bydlęcej. Zainfekować 10 litrów komórek wirusem P2 przy wielokrotności infekcji (MOI) równej dwa i gęstości trzech milionów komórek na ml. Od 12 do 16 godzin po infekcji dodać maślan sodu do stężenia 10 mM z roztworu stokowego o stężeniu 1 M.

Od 48 do 60 godzin po infekcji zebrać komórki poprzez wirowanie przy 4 000 ×g przez 15 minut. Usunąć nadsącz. Resuspendować komórki w 150 ml TBS z 2 µM escitalopramu lub innych inhibitorów SERT.

komórki z 10 litrów hodowli w ciepłej wodzie o temperaturze około 30 stopni Celsjusza i resuspenduj je, szybko przepuszczając przez pipetę 10 mililitrów, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Przenieś wszystkie komórki do zlewki z mieszadełkiem magnetycznym i dodaj do nich cały roztwór detergentu podczas mieszania. Solubilizuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę przy ciągłym mieszaniu.

Wiruj lizat z prędkością 8,000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej nadsącz do czystych probówek do ultrawirówki, a osad odrzuć. Następnie wiruj nadsącz z prędkością 100,000 ×g przez jedną godzinę w ultrawirówce.

Po ultrawirowaniu przefiltruj nadsącz przez filtr 0,2 mikrona, a osad odrzuć. Następnie przepuść lizat przez 10 mililitrów żywicy do powinowactwa strep zapakowanej w kolumnę przy użyciu pompy perystaltycznej, uprzednio równoważonej w buforze płuczącym. Następnie podłącz kolumnę do powinowactwa strep do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i wypłucz kolumnę z prędkością dwóch mililitrów na minutę, używając 66 mililitrów buforu płuczącego.

Eluuj oczyszczone białko w tym samym buforze do płukania uzupełnionym o 5 mM desthiobiotyny z prędkością 0,5 ml/min, wykorzystując 33 ml buforu. Zbieraj frakcje o objętości 1 ml. Frakcje szczytowe będą miały objętość około 10 ml.

Aby utworzyć kompleksy białka transporterowego z przeciwciałem, najpierw poddać oczyszczone białko trawieniu przez noc w temperaturze pokojowej przy użyciu trombiny w celu usunięcia znaczników oraz Endo H w celu deglikozylacji. Skoncentrować białko do stężenia 10 mg/ml i objętości od 250 do 300 µl, korzystając z wirówki z koncentratorem białek o progu odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa. Wymieszać skoncentrowane białko SERT z Fab 8B6 w stosunku molowym 1:1,2 w objętości poniżej 500 µl.

Odwiruj mieszaninę z prędkością 100 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po wirowaniu zbierz nadsącz zawierający kompleks SERT Fab, a osad odrzuć. Wyizoluj kompleks, stosując szybką chromatografię cieczową białek na kolumnie do wykluczania wielkości.

Równoważ zestaw z uzupełnionym TBS przy przepływie 0,5 mililitrów na minutę. Przed krystalizacją zagęść frakcje szczytowe z rozdziału kompleksu do stężenia dwóch miligramów na mililitr, używając wirówkowego koncentratora białek z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Absorbancja równa 2 AU przy 280 nanometrach odpowiada stężeniu jednego miligrama na mililitr.

Dodaj dodatkowy Fab w stosunku jednego kompleksu do 0,05 wolnego Fab. Dodaj również 10 µM wolnego S-citalopramu. Po odwirowaniu próbki zbierz nadsącz zawierający kompleks SERT Fab, a osad odrzuć.

Przygotuj przesiewanie metodą wiszącej kropli w płytce 24-dołkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza zgodnie z tabelą 1 w protokole tekstowym. Pipetuj 500 µl każdego roztworu z rezerwuaru do niskoprofilowej płytki 24-dołkowej z zastosowaniem uszczelniacza w każdym dołku. Pipetuj 1,5, 1,75 oraz 2 µl kompleksu SERT Fab na 18 mm sylikonizowane szkiełko nakrywkowe.

Następnie należy nanieść pipetą 1 µL roztworu rezerwuarowego na górną powierzchnię próbki białka. Pojedyncze kryształy pojawią się w ciągu około trzech dni i urosną do rozmiarów od 100 do 175 µm po 14 dniach. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla badania termostabilności w obecności trytylowanego citalopramu.

Wartości temperatury topnienia naniesione na wykres w funkcji maksymalnego wiązania wskazują mutanty o wysokiej termostabilności i ekspresji. Przedstawiono tutaj krzywe termostabilności dla SERT TC typu dzikiego oraz trzech najlepszych mutantów: Y110A, I291A i T439S. Ten obraz mikroskopowy przedstawia komórki HEK293S GnTI minus wykazujące ekspresję SERT CC z zieloną fluorescencją obecną na błonie komórkowej.

Chromatografia wykluczania z detekcją fluorescencyjną SERT CC wykazuje główny pik przy 15 ml. Analiza metodą SDS-PAGE wykazuje pojedynczy gatunek białka w znacznym stopniu wolny od zanieczyszczeń. Przedstawiono reprezentatywny rozdział kompleksów przeciwciał do transportera za pomocą chromatografii wykluczania.

Główny pik eluujący przy 11,5 mililitrach zawierał zarówno SERT, jak i Fab, co wykazano na żelu SDS-PAGE. Mikroskopia świetlna kompleksu przeciwciała SERT związanego z S citalopramem po dwóch tygodniach wzrostu ukazuje kryształy w kształcie pryzmatu o rozmiarach od około 100 do 175 mikronów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować mutacje stabilizujące białko błonowe w konformacji związanej z ligandem oraz jak przygotowywać ekrany krystalizacji dla kompleksów białko-przeciwciało.

Przy próbie przeprowadzenia tej procedury należy pamiętać, że ligandy są niezbędne do stabilizacji SERT TC i są kluczowe dla krystalizacji SERT CC. Znaczenie tej techniki wykracza poza aspekty techniczne i ma odniesienie do terapii schorzeń psychiatrycznych, ponieważ SERT jest celem molekularnym wielu leków przeciwdepresyjnych. Po wykonaniu tej procedury funkcję oczyszczonego SERT można scharakteryzować za pomocą metod biochemicznych i biofizycznych.