Name: Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę znakowania i wizualizacji białek mitochondrialnych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika radioaktywnego oznaczania umożliwia badanie biosyntezy białek i funkcji mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez Rosyjską Fundację Badań Podstawowych, numer grantu 18-29-07002. P.K. był wspierany przez Państwowy Przydział Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, numer grantu AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. był wspierany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, numer grantu 075-15-2019-1659 (Program Centrum Badań Genomu im. Kurczatowa). Prace zostały częściowo wykonane na sprzęcie zakupionym w ramach Programu Rozwoju Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego. I.C., S.L. i M.V.B. otrzymały dodatkowe wsparcie z grantu Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego "Wiodąca Szkoła Naukowa Arka Noego".

1. Przygotowanie kultur drożdży
<ol>
	<li>Drożdże z zamrożonych kultur wywarowych rozsypać na świeżych talerzach z odpowiednią pożywką. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli w temperaturze 30 °C przez 24–48 godz. 
	UWAGA: Pozwól mutantom wrażliwym na temperaturę rosnąć w dopuszczalnej temperaturze.</li>
	<li>Zaszczepić kultury drożdży w 2 ml pożywki YPGal (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% galaktozy) ze świeżej smugi w probówkach o pojemności 15 ml i inkubować je przez noc, mieszając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD600).</li>
	<li>Pobrać objętość odpowiadającą 0,2 jednostki absorbancji w sterylnych probówkach, osadzać komórki drożdży w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj komórki 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s. Komórki drożdży osadzać w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki w 2 ml świeżej pożywki YPGal.</li>
	<li>Inkubować mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C, aż OD600 osiągnie wartości 1,5–1,9. 
	UWAGA: Tempo wzrostu drożdży jest różne, więc przygotuj się na czekanie. Rozsądne jest wykonanie kroków 1.3–1.6 wcześnie rano. Zwykle trwa to 4–5 godzin, ale może potrwać dłużej.</li>
</ol>
2. Włączenie izotopów promieniotwórczych
<ol>
	<li>Przenieść objętość kultury odpowiadającą jednej jednostce optycznej w probówce do mikrowirówki. Wirować probówki o masie 3 000 x g przez 1 minutę i wyrzucić supernatant. Myć 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s.
	<ol>
		<li>Osadzać komórki drożdży w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki drożdży w 0,5 ml sterylnego buforu translacyjnego. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Bufor translacyjny jest roztworem zawierającym 2% galaktozy (w/v) i 50 mM fosforanu potasu o pH 6,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać cykloheksymid do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 0,2 mg/ml. Inkubować przez 5 minut, mieszając przy 200 obr./min i w temperaturze 30 °C, aby zahamować translację cytozolową. 
	UWAGA: Roztwór cykloheksymidu (20 mg/ml, w etanolu) powinien być przygotowany świeży przed eksperymentem. Chloramfenikol może być z powodzeniem zastąpiony anizomycyną w tym samym stężeniu7.</li>
	<li>Dodać 25–30 μCi 35S-metioniny do zawiesiny komórek i inkubować przez 30 minut, mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Można również zastosować mieszaninę 35S-metioniny i 35S-cysteiny. Czysta 35S-metionina zapewnia najsilniejszy sygnał i najlepszy stosunek sygnału do szumu. Ogólnie rzecz biorąc, metionina jest bardziej skuteczna niż cysteina, ponieważ zawartość tego aminokwasu w białkach mitochondrialnych jest wyższa. Jednak mieszanina 35S-metioniny i cysteiny EasyTag jest tańsza i daje porównywalne wyniki7. 
	UWAGA: 35S-metionina jest radioaktywna. Postępuj zgodnie ze zwykłymi praktykami bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi. 
	UWAGA: Powszechnie wiadomo, że włączenie promieniotwórczości osiąga granicę, dzięki której całkowite sygnały wyrównują się w czasie. Po osiągnięciu tego limitu prawie niemożliwe jest określenie szybkości, z jaką syntetyzowane są różne produkty tłumaczeniowe. Aby przeanalizować szybkość translacji mitochondrialnej, konieczne jest przebywanie w stanie, w którym intensywność sygnału wzrasta wraz z czasem inkubacji z 35S-metioniną w sposób liniowy. W przypadku powszechnych laboratoryjnych szczepów typu dzikiego, sygnał jest już nasycony dla czasów inkubacji znacznie krótszych niż 30 minut. Mutanty translacyjne mogą zachowywać się bardzo różnie. Należy przeprowadzić przebieg w czasie, aby ustalić kinetykę inkorporacji radioaktywności, a tym samym szybkość translacji, przynajmniej podczas pracy z nowym szczepem. W tym celu sugerujemy pobieranie próbek w odstępie kilku minut (np. 2,5, 5,0, 7,5, 10 i 20 minut).</li>
	<li>Dodaj nieznakowaną "zimną" metioninę (końcowe stężenie powinno wynosić 20 mM) i puromycynę (końcowe stężenie powinno wynosić 1–10 μg/ml), aby zatrzymać znakowanie. Inkubować przez 10 minut, mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby dać rybosomom czas na zakończenie translacji peptydów. W przeciwnym razie wszystkie polipeptydy krótsze niż pełnej długości zostaną wykryte w innym rozmiarze. Na tym etapie można przeprowadzić eksperyment z przebiegiem czasu (pogoń za impulsem) w celu określenia stabilności mitochondrialnych produktów translacji. W tym celu należy kontynuować inkubację, pobierając próbki w odstępie 30 minut (np. 30, 60, 90 i 120 minut).</li>
</ol>
3. Liza komórek drożdży i ekstrakcja białek
<ol>
	<li>Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 30 s. Umyj komórki 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s. Komórki drożdży osadzać w 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. 
	NUTA. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dodać 75 μl buforu do lizy do osadu i wirować przez 5–10 s. 
	UWAGA: Bufor do lizy jest roztworem 1,8 M NaOH, 1 M β-merkaptoetanolu i 1 mM PMSF w wodzie. Należy unikać nadmiernej inkubacji z buforem do lizy prowadzącej do alkalicznej hydrolizy białek. Natychmiast przejdź do kroku 3.3.</li>
	<li>Dodać 500 μl 0,5 M buforu Tris-HCl o pH 6,8. Wiruj krótko.</li>
</ol>
4. Wytrącanie białek
UWAGA: Metanol i chloroform są rozpuszczalnikami organicznymi. Postępuj zgodnie ze zwykłymi praktykami bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z substancjami organicznymi.
<ol>
	<li>Dodać 600 μl metanolu do próbki. Wir przez 5 s.</li>
	<li>Dodać 150 μl chloroformu do próbki. Wir przez 5 s.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 2 minuty przy 12 000 x g. Ostrożnie wyrzucić górną fazę za pomocą próbnika.</li>
	<li>Dodać 600 μl metanolu do próbki. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 2 minuty przy 12 000 x g. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Suszyć granulki na powietrzu przez 2 minuty w temperaturze 80 °C. 
	UWAGA: Cały płyn powinien wyparować. Istnieje ryzyko nieprawidłowego oddzielenia białek w żelu, jeśli osadek został niedostatecznie wysuszony. Nie ma jednak możliwości przesuszenia granulatu, dlatego można go przechowywać nawet przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozpuść wytrącone białka w 60 μl 1x buforu do próbek Laemmli.</li>
	<li>Podgrzewać przez 10 min w temperaturze 40 °C. 
	UWAGA: Należy unikać gotowania próbek w temperaturze 95 °C, ponieważ powoduje to agregację. Jeżeli agregaty nadal się tworzą, należy wirować próbki o masie 12 000 x g przez 2 minuty i zebrać supernatant. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
5. STRONA SDS
<ol>
	<li>Odlewać 17,5% żel poliakryloamidowy Laemmli SDS. 
	UWAGA: Do żelu można dodać 6 M mocznika, aby lepiej rozpuścić atp8 i atp9. Żele gradientowe 15%–20% mogą również zapewnić lepszą rozdzielczość.</li>
	<li>Załaduj 15 μl (40–50 μg) każdej próbki do kieszeni. 
	UWAGA: Nie jest konieczne mierzenie stężenia białka, jeśli wartości OD600 były zbliżone w kroku 1.6. Jeśli nie, zmierz stężenie białka za pomocą testu z odczynnikami kompatybilnymi z detergentami.</li>
	<li>Uruchom żel w chłodnym pomieszczeniu, aż niebieski barwnik osiągnie około 65% długości żelu. 
	UWAGA: Dla zastosowanego systemu (np. ogniwo Protean II xi) stosujemy jeden z dwóch trybów: 16–17 godzin przy 5 V/cm lub 5 godzin przy 15 V/cm. Żadne białka nie działają szybciej niż niebieski barwnik bromofenolowy, ale długie przebiegi mogą powodować rozmycie sygnałów atp8 i atp9.</li>
	<li>Zabarwić żel błękitem brylantowym Coomassie i wykonać skan lub zdjęcie, które jest wymagane jako kontrola załadunku. 
	UWAGA: Alternatywnym sposobem kontroli obciążenia jest immunoblotting za pomocą przeciwciała przeciwko mitochondrialnemu genowi "porządkowania", np. porynie 1.</li>
</ol>
6. Autoradiografia
<ol>
	<li>Wysuszyć żel w suszarce do żelu. Przechowuj go w kasecie z sitkiem luminoforowym do przechowywania przez 3–5 dni. 
	UWAGA: Alternatywą dla przesiewania wysuszonego żelu jest przeniesienie białek do membrany nitrocelulozowej poprzez elektroblotting, a następnie przesiewanie. Skutkuje to silniejszymi sygnałami i ostrzejszymi pasmami.</li>
	<li>Zeskanuj ekran za pomocą phosphorimager. 
	UWAGA: Jako alternatywę dla obrazowania luminoforowego, film rentgenowski może być również używany do ujawniania sygnałów.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania nad ekspresją genów odgrywają kluczową rolę we współczesnych naukach przyrodniczych. Opracowano wiele metod zapewniających wgląd w ten złożony proces. W tym artykule opisano metodę pozwalającą na dostęp do biosyntezy białek w mitochondriach drożdży piekarskich S. cerevisiae. Zwykle stosuje się go do porównania wydajności translacji mRNA w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży w porównaniu z typem dzikim, aby uzyskać dostęp do konsekwencji badanej mutacji. Jest to jeden z podstawowych eksperymentów, ...

Mitochondria to organelle głęboko zaangażowane w metabolizm komórki eukariotycznej. Ich łańcuch transferu elektronów zaopatruje komórkę w ATP, główną walutę energetyczną używaną w wielu szlakach biochemicznych. Poza tym biorą udział w apoptozie, syntezie kwasów tłuszczowych i hemu oraz innych procesach. Dysfunkcja mitochondriów jest dobrze znanym źródłem chorób u ludzi1. Może to wynikać z mutacji w genach jądrowych lub mitochondrialnych kodujących strukturalne lub regulatorowe składniki organelli2. Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae są doskonałym organizmem modelowym do badania ekspresji genów mitochondrialnych z kilku powodów. Po pierwsze, ich genom jest całkowicie zsekwencjonowany3, dobrze opisany, a duża ilość danych jest już dostępna w literaturze dzięki długiej historii badań przeprowadzonych na tym organizmie. Po drugie, manipulacje ich genomem jądrowym są stosunkowo szybkie i łatwe ze względu na ich szybkie tempo wzrostu i wysoce wydajny system rekombinacji homologicznej. Po trzecie, drożdże piekarskie S. cerevisiae są jednymi z niewielu organizmów, dla których opracowywane są manipulacje genomami mitochondrialnymi. Wreszcie, drożdże piekarskie są organizmem fakultatywnym tlenowo-beztlenowym, który umożliwia izolację i badanie mutantów z wadami układu oddechowego, ponieważ mogą one rosnąć w pożywkach zawierających fermentujące źródła węgla.
Opisujemy metodę badania ekspresji genów mitochondrialnych drożdży piekarskich S. cerevisiae na poziomie translacyjnym4. Jego główna zasada wynika z kilku obserwacji. Po pierwsze, genom mitochondrialny drożdży koduje tylko osiem białek: trzy podjednostki oksydazy cytochromu c (Cox1p, Cox2p i Cox3p), trzy podjednostki syntazy ATP (Atp6p, Atp8p i Atp9p), podjednostkę enzymu oksydoreduktazy ubichinolu-cytochromu c, cytochromu b (Cytb) i mitochondrialne białko rybosomalne Var1p5. Liczba ta jest niewielka, a wszystkie z nich można oddzielić za pomocą elektroforezy na jednym żelu w odpowiednich warunkach. Po drugie, rybosomy mitochondrialne należą do klasy prokariotycznej, a nie eukariotyczne6, a zatem wrażliwość na antybiotyki jest inna dla rybosomów cytoplazmatycznych drożdży i mitochondriów. Pozwala na hamowanie translacji cytoplazmatycznej za pomocą cykloheksymidu, zapewniając warunki, w których znakowany aminokwas (35S-metionina) jest włączony tylko do mitochondrialnych produktów translacji. W rezultacie eksperyment dostarcza informacji na temat szybkości włączania aminokwasów do białek mitochondrialnych syntetyzowanych de novo, odzwierciedlając ogólną wydajność translacji mitochondrialnej dla każdego z ośmiu produktów

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miernik gęstości komórek Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>MARKOWE standardowe kuwety jednorazowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy blok</td><td>grzewczy Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&mikro; Ci (18.5MBq), Stabilizowany roztwór wodny</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Ekrany fosforowe do przechowywania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metylenobisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Inkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton z mięsa, bakteriologiczny</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce 660nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Podstawowy zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny ze Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Imager luminoforowy Storm 865</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana próżniowo suszarka żelowa</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych zdolnymi do oddychania tlenowego. Zawierają kolisty genom i aparat ekspresji genów. Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem białek: trzy podjednostki oksydazy cytochromu c (Cox1p, Cox2p i Cox3p), trzy podjednostki syntazy ATP (Atp6p, Atp8p i Atp9p), podjednostkę enzymu oksydoreduktazy ubichinolu-cytochromu c, cytochromu b (Cytb) i mitochondrialne białko rybosomalne Var1p. Celem opisanej tutaj metody jest specyficzne oznakowanie tych białek 35S metioniną, oddzielenie ich za pomocą elektroforezy i wizualizacja sygnałów jako dyskretnych pasm na ekranie. Procedura składa się z kilku kroków. Po pierwsze, komórki drożdży są hodowane w pożywce zawierającej galaktozę, aż osiągną późny logarytmiczny etap wzrostu. Następnie leczenie cykloheksymidem blokuje translację cytoplazmatyczną i umożliwia włączenie metioniny 35S tylko do mitochondrialnych produktów translacji. Następnie wszystkie białka są ekstrahowane z komórek drożdży i rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Na koniec żel jest suszony i inkubowany z sitkiem fosforowym do przechowywania. Ekran jest skanowany na luminowizorze, odsłaniając pasma. Metodę można zastosować do porównania szybkości biosyntezy pojedynczego polipeptydu w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży z typem dzikim, co jest przydatne do badania defektów ekspresji genów mitochondrialnych. Protokół ten dostarcza cennych informacji na temat szybkości translacji wszystkich mitochondrialnych mRNA drożdży. Wymaga to jednak kilku kontroli i dodatkowych eksperymentów, aby wyciągnąć właściwe wnioski.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przeprowadzono analizę produktów translacji mitochondrialnej dwóch szczepów S. cerevisiae: typu dzikiego (WT) oraz mutanta z delecją genu AIM23 (AIM23Δ), kodującego mitochondrialny czynnik inicjacji translacji 3 (Tabela 1)8. Produkty translacji mitochondrialnej zostały znakowane radioaktywnie i rozdzielone w żelu SDS-PAAG9. Próbki pobierano co 2,5 min przed osiągnięciem nasycenia w celu opracowania przebieg...

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych zdolnych do oddychania tlenowego. Ich dysfunkcja jest dobrze znanym źródłem chorób u ludzi. Mitochondria drożdży piekarskich zawierają kolisty genom kodujący osiem białek.W tym filmie opisaliśmy protokół stosowany do oznaczania biosyntezy białek w mitochondriach drożdży za pomocą radioaktywnego znakowania produktów translacyjnych, a następnie separacji za pomocą elektroforezy żelowej. Procedura składa się z kilku głównych kroków. Drożdże z zamrożonych kultur wywarowych rozsypać na świeżych talerzach za pomocą odpowiedniego podłoża.Umieść płytki w inkubatorze kultur w temperaturze 30 stopni na 24 do 48 godzin. Zaszczepić te kultury w dwóch mililitrach pożywki ze świeżej smugi w 15-mililitrowej probówce i inkubować je przez noc, mieszając z prędkością 200 obr./min w 30 stopniach. Zmierz gęstość optyczną kultury na długości fali 600 nanometrów.Pobrać objętość odpowiadającą 0,2 jednostki chłonności w sterylnych probówkach Palette komórek drożdży o stężeniu 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić ten supernatant. Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund.Paletyzuj komórki drożdży w ilości 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki w dwóch mililitrach świeżego podłoża agarowego do wycierania.Krawędź inkubacyjną wykonuje się przy 200 obr./min i 30 stopniach, aż gęstość optyczna osiągnie od 1,5 do 1,9 od 1,5 do 1,9. Przenieść objętość kultury odpowiadającą jednej jednostce optycznej w probówce mikrowirówkowej. Wirować probówki o masie 3000 G przez jedną minutę.Odrzucić supernatant. Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund. Paletyzować komórki drożdży w temperaturze 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej Odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki drożdży w 0,5 mililitra sterylnego buforu translacyjnego. Umieść zawiesinę w 15-mililitrowej tubce. Dodaj cykloheksymid do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr Inkubuj przez pięć minut krawędzi pobranej przy 200 obr./min i 30 stopniach, aby zahamować translację cytozolu.Dodać od 25 do 30 Dodaj od 25 do 30 mikrokiurów metioniny S35 metioniny S35 do zawiesiny komórek i inkubować przez 30 minut krawędź pobraną przy 200 obr./min i 30 stopniach. Dodaj nieznakowaną zimną metioninę i borymycynę, aby zatrzymać etykietowanie Inkubuj przez 10 minut krawędź pobraną przy 200 obr./min i 30 stopniach. Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie w stężeniu 9 000 G przez 30 sekund.Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund. Paletyzuj komórki drożdży w ilości 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.Dodaj 75 mikrolitrów buforu do lizy do palety i wiruj przez pięć do 10 sekund. Dodaj 500 mikrolitrów 0,5-molowego buforu tris 0,5-molowego buforu tris o pH 6,8. O pH 6,8.Wiruj krótko. Dodać 600 mikrolitrów metanolu do próbki. Wiruj przez pięć sekund.Dodać 150 mikrolitrów chloroformu do próbki. Wiruj przez pięć sekund. Odwirować próbki przez dwie minuty w temperaturze 12 000 G. Ostrożnie odrzucić nieprzezroczystą powierzchnię za pomocą próbnika.Dodać 600 mikrolitrów metanolu do próbki. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Odwirować próbki przez dwie minuty w temperaturze 12 000 G. Odrzucić supernatant.Suszyć paletę na powietrzu przez dwie minuty w temperaturze 80 stopni. Rozpuścić wytrącone białka w 60 mikrolitrach buforu do próbek Laemmli. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 14 stopni.Przyczyna 17,5% żel poliakryloamidowy Laemmli SDS. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki do kieszeni. Uruchom żel w chłodni, aż niebieski barwnik osiągnie około 65% żelu limfa.Zabarwić żel błękitem brylantowym Kumasi i wykonać skan lub zdjęcie, które jest wymagane jako kontrola załadunku. Wysuszyć żel w suszarce do żelu. Przechowuj go w kasecie z ekranem fosforowym do przechowywania przez trzy do pięciu dni.Zeskanuj ekran za pomocą imagera luminoforowego. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przypisaliśmy produkty translacji mitochondrialnej z dwóch szczepów Saccharomyces cerevisiae. Typ dziki i zmutowany wariant delecja genu Aim23 kodującego trzeci czynnik inicjacji translacji mitochondrialnej.Produkty translacji mitochondrialnej były już aktywnie znakowane i oddzielane w denaturującym żelu poliakrylamidowym. Próbki były pobierane co dwie i pół minuty przed nasyceniem, aby zbudować przebieg czasu. Żel został wybarwiony, wysuszony i przesiewany po pięciodniowej ekspozycji.W przypadku udanego eksperymentu rysunek przedstawia osiem pasm przypisanych zgodnie ze standardowym wzorcem. Jednak intensywność poszczególnych pasm może być bardzo zmienna w zależności od szczepu i warunków eksperymentalnych. Każdemu pasmu odpowiada jeden produkt tłumaczeniowy.Dane sugerują, że zmutowany szczep jest zdolny do syntezy białek mitochondrialnych, ponieważ wszystkie produkty pojawiające się w typie dzikim są widoczne w tym mutancie. Jednak intensywność prążków różni się od typu dzikiego, co oznacza, że ta delecja Aim23 wpływa na ekspresję genów mitochondrialnych. Kumasi uwarzone w niebieskiej plamie i służy jako kontrola załadunku.Ich wyniki w danych można określić ilościowo w celu zidentyfikowania różnic między szczepami lub warunkami eksperymentalnymi za pomocą oprogramowania Image G lub Image Quan. W ich przypadku obliczany jest stosunek sygnału odpowiadającego każdemu produktowi do sygnału całkowitego. Wartości średnie i odchylenia standardowe są obliczane w co najmniej trzech niezależnych eksperymentach.Kinetyka zsyntetyzowanego białka przewróconego do góry nogami została zbadana w zeszłorocznym eksperymencie. Próbki pobiera się we wskazanych punktach czasowych po zatrzymaniu reakcji znakowania zimną metioniną i borymycyną. Kontrola ta jest niezbędna do oszacowania stabilności produktu.Barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-Porin one jest kontrolą obciążenia. Opisaliśmy metodę, która jest często stosowana do badania biosyntezy białek w mitochondriach drożdży. Ten protokół jest stosunkowo prosty i szybki do wykonania.Jednocześnie pozwala uzyskać cenne informacje na temat szybkości translacji czterech mitochondrialnych mRNA drożdży, co jest bardzo korzystne. Ma jednak kilka ograniczeń wymagających dodatkowych eksperymentów i leży w tym międzystanowym poziomie białek i mRNA. Może dostarczyć informacji o tych funkcjach w mitochondrialnym systemie translacji, ale do odkrycia mechanizmu należy użyć bardziej zaawansowanych technik.

labelling-visualization-mitochondrial-genome-expression-products

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Ta praca wyjaśnia, jak przekształcić mitochondria drożdży za pomocą metody biolistycznej. Pokazujemy również, jak selekcjonować i oczyszczać transformanty oraz jak wprowadzić pożądaną mutację w docelowej pozycji w genomie mitochondrialnym.

Transformacja mitochondrialna w drożdżach piekarskich w celu zbadania translacji i składania kompleksów oddechowych

Poznaj metodę znakowania i wizualizacji białek mitochondrialnych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika radioaktywnego oznaczania umożliwia badanie biosyntezy białek i funkcji mitochondriów.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów