Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych zdolnych do oddychania tlenowego. Ich dysfunkcja jest dobrze znanym źródłem chorób u ludzi. Mitochondria drożdży piekarskich zawierają kolisty genom kodujący osiem białek.

W tym filmie opisaliśmy protokół stosowany do oznaczania biosyntezy białek w mitochondriach drożdży za pomocą radioaktywnego znakowania produktów translacyjnych, a następnie separacji za pomocą elektroforezy żelowej. Procedura składa się z kilku głównych kroków. Drożdże z zamrożonych kultur wywarowych rozsypać na świeżych talerzach za pomocą odpowiedniego podłoża.

Umieść płytki w inkubatorze kultur w temperaturze 30 stopni na 24 do 48 godzin. Zaszczepić te kultury w dwóch mililitrach pożywki ze świeżej smugi w 15-mililitrowej probówce i inkubować je przez noc, mieszając z prędkością 200 obr./min w 30 stopniach. Zmierz gęstość optyczną kultury na długości fali 600 nanometrów.

Pobrać objętość odpowiadającą 0,2 jednostki chłonności w sterylnych probówkach Palette komórek drożdży o stężeniu 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić ten supernatant. Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund.

Paletyzuj komórki drożdży w ilości 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki w dwóch mililitrach świeżego podłoża agarowego do wycierania.

Krawędź inkubacyjną wykonuje się przy 200 obr./min i 30 stopniach, aż gęstość optyczna osiągnie od 1,5 do 1,9 od 1,5 do 1,9. Przenieść objętość kultury odpowiadającą jednej jednostce optycznej w probówce mikrowirówkowej. Wirować probówki o masie 3000 G przez jedną minutę.

Odrzucić supernatant. Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund. Paletyzować komórki drożdży w temperaturze 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki drożdży w 0,5 mililitra sterylnego buforu translacyjnego. Umieść zawiesinę w 15-mililitrowej tubce. Dodaj cykloheksymid do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 0,2 miligrama na mililitr Inkubuj przez pięć minut krawędzi pobranej przy 200 obr./min i 30 stopniach, aby zahamować translację cytozolu.

Dodać od 25 do 30 Dodaj od 25 do 30 mikrokiurów metioniny S35 metioniny S35 do zawiesiny komórek i inkubować przez 30 minut krawędź pobraną przy 200 obr./min i 30 stopniach. Dodaj nieznakowaną zimną metioninę i borymycynę, aby zatrzymać etykietowanie Inkubuj przez 10 minut krawędź pobraną przy 200 obr./min i 30 stopniach. Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie w stężeniu 9 000 G przez 30 sekund.

Umyj komórki 0,5 mililitra sterylnej wody, wirując przez pięć sekund. Paletyzuj komórki drożdży w ilości 9 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.

Dodaj 75 mikrolitrów buforu do lizy do palety i wiruj przez pięć do 10 sekund. Dodaj 500 mikrolitrów 0,5-molowego buforu tris 0,5-molowego buforu tris o pH 6,8. O pH 6,8.

Wiruj krótko. Dodać 600 mikrolitrów metanolu do próbki. Wiruj przez pięć sekund.

Dodać 150 mikrolitrów chloroformu do próbki. Wiruj przez pięć sekund. Odwirować próbki przez dwie minuty w temperaturze 12 000 G. Ostrożnie odrzucić nieprzezroczystą powierzchnię za pomocą próbnika.

Dodać 600 mikrolitrów metanolu do próbki. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Odwirować próbki przez dwie minuty w temperaturze 12 000 G. Odrzucić supernatant.

Suszyć paletę na powietrzu przez dwie minuty w temperaturze 80 stopni. Rozpuścić wytrącone białka w 60 mikrolitrach buforu do próbek Laemmli. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 14 stopni.

Przyczyna 17,5% żel poliakryloamidowy Laemmli SDS. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki do kieszeni. Uruchom żel w chłodni, aż niebieski barwnik osiągnie około 65% żelu limfa.

Zabarwić żel błękitem brylantowym Kumasi i wykonać skan lub zdjęcie, które jest wymagane jako kontrola załadunku. Wysuszyć żel w suszarce do żelu. Przechowuj go w kasecie z ekranem fosforowym do przechowywania przez trzy do pięciu dni.

Zeskanuj ekran za pomocą imagera luminoforowego. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przypisaliśmy produkty translacji mitochondrialnej z dwóch szczepów Saccharomyces cerevisiae. Typ dziki i zmutowany wariant delecja genu Aim23 kodującego trzeci czynnik inicjacji translacji mitochondrialnej.

Produkty translacji mitochondrialnej były już aktywnie znakowane i oddzielane w denaturującym żelu poliakrylamidowym. Próbki były pobierane co dwie i pół minuty przed nasyceniem, aby zbudować przebieg czasu. Żel został wybarwiony, wysuszony i przesiewany po pięciodniowej ekspozycji.

W przypadku udanego eksperymentu rysunek przedstawia osiem pasm przypisanych zgodnie ze standardowym wzorcem. Jednak intensywność poszczególnych pasm może być bardzo zmienna w zależności od szczepu i warunków eksperymentalnych. Każdemu pasmu odpowiada jeden produkt tłumaczeniowy.

Dane sugerują, że zmutowany szczep jest zdolny do syntezy białek mitochondrialnych, ponieważ wszystkie produkty pojawiające się w typie dzikim są widoczne w tym mutancie. Jednak intensywność prążków różni się od typu dzikiego, co oznacza, że ta delecja Aim23 wpływa na ekspresję genów mitochondrialnych. Kumasi uwarzone w niebieskiej plamie i służy jako kontrola załadunku.

Ich wyniki w danych można określić ilościowo w celu zidentyfikowania różnic między szczepami lub warunkami eksperymentalnymi za pomocą oprogramowania Image G lub Image Quan. W ich przypadku obliczany jest stosunek sygnału odpowiadającego każdemu produktowi do sygnału całkowitego. Wartości średnie i odchylenia standardowe są obliczane w co najmniej trzech niezależnych eksperymentach.

Kinetyka zsyntetyzowanego białka przewróconego do góry nogami została zbadana w zeszłorocznym eksperymencie. Próbki pobiera się we wskazanych punktach czasowych po zatrzymaniu reakcji znakowania zimną metioniną i borymycyną. Kontrola ta jest niezbędna do oszacowania stabilności produktu.

Barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-Porin one jest kontrolą obciążenia. Opisaliśmy metodę, która jest często stosowana do badania biosyntezy białek w mitochondriach drożdży. Ten protokół jest stosunkowo prosty i szybki do wykonania.

Jednocześnie pozwala uzyskać cenne informacje na temat szybkości translacji czterech mitochondrialnych mRNA drożdży, co jest bardzo korzystne. Ma jednak kilka ograniczeń wymagających dodatkowych eksperymentów i leży w tym międzystanowym poziomie białek i mRNA. Może dostarczyć informacji o tych funkcjach w mitochondrialnym systemie translacji, ale do odkrycia mechanizmu należy użyć bardziej zaawansowanych technik.